抗炎细胞因子Interleukin-4抑制诱导小鼠巨噬细胞一氧化氮合酶基因表达的细胞株RAW264.7通过Octamer-Dependent转录的镇压

文摘

诱导一氧化氮合酶(间接宾语)是一个标志性分子参与M1的经典活化的巨噬细胞和诱导的Nos2基因在刺激与Th1-cell派生移行细胞(干扰素γ)和细菌脂多糖(LPS)。虽然抗炎细胞因子il - 4抑制Nos2基因表达的分子机制参与的负调控Nos2通过il - 4还有待充分阐明。在目前的研究中,我们调查了IL-4-mediated机制Nos2转录镇压在鼠标macrophage-like细胞株RAW264.7。信号传感器和转录激活蛋白6 (Stat6)击倒siRNA废除了IL-4-mediated抑制Nos2干扰素引起的γ/有限合伙人。瞬时转染的荧光素酶报告基因包含5′侧翼的区域Nos2基因表明一个八聚物转录因子结合位点(10月)在启动子区域都需要积极的监管由干扰素γ通过il - 4 /有限合伙人和消极的监管。虽然il - 4没有抑制作用的dna结合活动持续表达了oct - 1, IL-4-inducedNos2记者转录镇压部分减毒的超表达共激活剂CREB-binding蛋白质(CBP)。这些结果表明,共激活剂/辅因子,功能与oct - 1是一个分子IL-4-mediated抑制的目标Nos2这IL-4-activated Stat6压制Oct-1-dependent转录与这共激活剂/代数余子式竞争。

1。介绍

巨噬细胞功能的各个方面的炎症反应,先天和后天免疫,和组织重构,和巨噬细胞的功能能力通常在应对多样化的刺激中遇到的组织微环境1]。细菌细胞的组件,如脂多糖(LPS)和I型辅助T细胞(Th1)派生细胞因子移行细胞(干扰素γ),是众所周知的巨噬细胞活化刺激促进抗菌和抗肿瘤功能(1- - - - - -3]。这些所谓的经典激活巨噬细胞或巨噬细胞M1,产生大量的促炎细胞因子,活性氧中间体,等活性氮中间体和一氧化氮(NO),由诱导生成没有合酶(间接宾语)编码的Nos2基因(4,5]。相比之下,Th2-derived interleukin-4细胞因子(il - 4)和IL-13诱导巨噬细胞激活的替代模式,导致巨噬细胞参与清除,抗炎反应,伤口愈合,增强表达和组织重构的甘露糖受体,il - 1受体拮抗剂,精氨酸酶我3,6- - - - - -8]。这些Th2-derived细胞因子抑制促炎基因的表达,包括Nos2在经典激活巨噬细胞(9- - - - - -12),从而进一步促进向II型极化响应。

il - 4的胞内信号通路,至少在某种程度上,由信号传感器和激活转录6 (Stat6),潜在的细胞质转录因子,在酪氨酸残基磷酸化(Tyr641) Janus激酶1 (Jak1) il - 4和il - 4受体结合后(13,14]。磷酸化Stat6组装在一个二聚的形式,把原子核,绑定到一个特定的独联体管理序列,介导IL-4-inducible基因的转录激活(13- - - - - -18]。IL-4-induced Stat6也功能-干扰素的监管机构γ全身Stat1-dependent转录激活的巨噬细胞基因,以前的研究已经表明Stat6直接和/或间接抑制干扰素γ全身Stat1-dependent转录(19- - - - - -22]。尽管IL-4-activated Stat6似乎是必不可少的负调节il - 4 (17,19的分子机制,IL-4-activated Stat6抑制LPS诱导的巨噬细胞基因表达和干扰素γ仍有待澄清。

转录调控的老鼠Nos2有限合伙人和干扰素诱导的基因的作用γ在巨噬细胞被广泛研究[23- - - - - -30.]。5′的近端区域Nos2基因(地区)包含一个TATA盒和绑定图案八聚物转录因子(10月)和核因子κB (NF -κB),它们主要调解对LPS诱导的转录激活(23,24,31日- - - - - -33]。远端监管区域(区域2)位于0.9 kb上游的转录启动网站主要包含中介的监管序列IFN-induced激活。在这个地区,IFN-stimulated响应元素(isr)和干扰素γ激活序列(气)已确定为成员的绑定风格干扰素调节因子(IRF)家庭,IFN-stimulated基因因子3 (ISGF3 Stat1组成,Stat2 IRF-9),和Stat125- - - - - -28,30.),干扰素调节反应。的转录协同作用Nos2基因诱导干扰素γ和有限合伙人已经建议由一个功能LPS-activated转录因子之间的合作,比如NF -κB,在地区和IFN-induced转录因子在区域二世(23,26,30.]。il - 4也负调节的表达Nos2基因,尤其是干扰素γ全身的表达Nos2在小鼠巨噬细胞(12]。参与IL-4-mediated抑制的机制Nos2已被证明取决于干扰素的负调控γ通过抑制全身IRF-1 IRF-1表达式(34,35),通过竞争与IL-4-induced IRF-1绑定IRF-2 [36),或通过一个衰减与干扰素共识sequence-binding蛋白质(ICSBP,称为IRF-8) [28]。虽然干扰素的机制γ全身的表达Nos2il - 4基因的集中在负面IRF-1监管,IL-4-mediated抑制的机制Nos2基因诱导干扰素γ和有限合伙人还有待充分阐明。

在目前的研究中,我们分析了il - 4的分子机制抑制转录激活鼠标Nos2在与干扰素刺激基因γ有限合伙人在小鼠巨噬细胞细胞株RAW264.7。我们证明Stat6击倒siRNA废除IL-4-mediated抑制Nos2信使rna表达。使用荧光素酶报告基因的瞬时转染包含5′的监管区域Nos2基因,我们确定了10月的近端启动子区域Nos2基因的响应区域IL-4-mediated镇压。这些数据表明,IL-4-activated Stat6 OCT-dependent转录激活的抑制Nos2在RAW264.7细胞基因。

2。材料和方法

2.1。试剂

有限合伙人准备使用韦氏比重酚提取大肠杆菌(0111:B4)获得Sigma-Aldrich公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。鼠标重组干扰素γ和il - 4从Chemicon获得国际(美国泰梅库拉,CA)和研发系统(美国麦金利,NE),分别。兔多克隆抗体Stat6 (sc - 981),β肌动蛋白(sc - 1616), Bob-1 /鲍勃。1(sc-955), TATA-binding protein (TBP; sc-204), Oct-1 (sc-232), and Oct-2 (sc-233) were obtained from Santa Cruz Biotechnology (Hercules, CA, USA).

2.2。细胞培养

从美国获得了鼠标macrophage-like细胞株RAW264.7类型文化修正(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)和培养在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM;表达载体、大岛屿,美国纽约)补充10%胎牛血清(的边后卫;美国佛罗里达州西部生物、迈阿密、)和1%青霉素G /硫酸链霉素(表达载体)。对于所有实验,细胞亚文化直到70% ~ 80%汇合的单层。细胞被使用10 ng / mL重组小鼠il - 4为刺激前30分钟10 ng / mL鼠标干扰素γ和/或100 ng / mL有限合伙人指定的时间了。鼠标B细胞白血病细胞系BCL1-B20 (RCB2618) [37理研生物资源中心)是经(日本东京)和RPMI1640培养补充了青霉素G /硫酸链霉素的边后卫10%和1%。

2.3。的决心积累

亚硝酸盐积累的文化上层的格里斯试验测量,如前所述[38]。简单地说,100 -μL整除文化的上层清液与同等容积的孵化格里斯试剂(1%磺胺/ 0.1%N——(1-naphthyl)乙二胺盐酸盐/ 2.5% H₃阿宝₄)在室温下10分钟。在550纳米样品的吸光度测量使用标(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国),和内容决定使用亚硝酸钠作为标准。细胞蛋白质在每种文化也是由布拉德福德法(39]。没有生产表示为nmol /蛋白质含量。

2.4。总RNA和北方杂交分析的准备

isothiocyanate-cesium氯胍的总RNA的制备方法和杂交分析北部进行如前所述[40]。在一些实验中,总RNA制备使用快速纯RNA工具包(豆类,大津,日本)。鼠标的互补脱氧核糖核酸探针诱导一氧化氮合酶(Nos2)和老鼠glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(Gapdh)描述了其他地方40,41]。

2.5。实时定量rt - pcr

互补脱氧核糖核酸的合成纯化使用高容量cDNA总RNA逆转录工具包(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。实时PCR探针和引物特定的鼠标Nos2,Stat6,oct - 1,Oct-2如表1所示,可以在补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2013/369693,选择使用通用探针库分析设计中心(罗氏应用科学、巴塞尔、瑞士)。整除的cDNA放大使用LightCycler 480实时PCR系统(罗氏)和TaqMan基因表达主人混合(生命技术)根据制造商的指示。PCR循环条件如下:95°C的循环5分钟和95°C 10年代,30年代60°C, 72°C 10年代。转录水平计算相对于18 s rRNA作为内部控制水平。

2.6。siRNA-Mediated击倒

细胞被播种在24-well板块和转染100海里的智能池siRNA针对鼠标Stat6(混合物的四个不同的小干扰rna寡核苷酸Stat6能够切中要害:AGGCUUCACCAUCGAGUAA, CCAAGACAACAACGCCAAA, GGAUGAAGUCCUGCGAAC,和UGGUCAUCGUGCAUGGUAA)使用Dharmafect Duo转染试剂按照制造商的指示(热科学)。小干扰rna寡核苷酸的ON-TARGETplus不属预定目标的池包含四个不同的不属预定目标的(热科学)作为消极的控制。小干扰rna转染在36小时后,这些细胞被预处理与il - 4 30分钟,与干扰素刺激γ和/或有限合伙人总RNA的准备前8小时实时rt - pcr或为西方墨点法总细胞溶解产物。

2.7。荧光素酶报告基因的建造

启动子/增强子区域的鼠标Nos2基因(−996 ~ + 104;参见[23)从老鼠基因组DNA分离(WI Promega,麦迪逊,美国)通过PCR可以天涯DNA聚合酶(表达载体)。表2列出了PCR引物补充。的gene-specific正向和反向引物含有限制性内切酶网站(MluI和BglII、职责);PCR产品消化了MluI和BglII1.0%的琼脂糖凝胶分析,使用DNA提取和纯化工具包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)根据制造商的指示。纯化PCR产品(104−996 ~ +)subcloned成一个MluI- - -BglII消化pGL2荧光素酶报告质粒(Promega),以及由此产生的质粒被指定为pnos - 996。一系列的缺失突变体的5′侧翼的区域Nos2基因是由限制性内切酶消化pnos - 996 (SmaI772年−尚驰−333,PstI−44)。另一个系列的近端5′侧翼地区缺失突变体,对应于该地区之间+ 104−143−86−62或−17日由使用正向和反向PCR引物包含生成的MluI和BglII网站,分别(补充表2)。PCR产品消化MluI和BglII和subcloned pGL2荧光素酶报告质粒。

位点突变的近端κ10月B站点和站点是由一个两轮PCR方法的修改(42]。在短暂的,κB站点(5′-GGGACTCTCC-3′)突变5′-ccACatcgat3,小写字母表示突变序列和斜体表示ClaI网站,使用两套PCR引物包含突变序列(补充表2)。10月网站(5′-ATGCAAAA-3′) 5′-突变cgtacgAA-3′,小写字母和斜体显示突变序列BsiWI网站,分别使用两套引物。的详细施工方法变异记者构造图1中描述的补充。由此产生的突变体结构经测序。

2.8。瞬时转染和荧光素酶记者分析

RAW264.7细胞被播种到24-well盘子1×10的密度⁴细胞在DMEM /补充10%的边后卫和培养转染前16个小时。细胞被瞬变与荧光素酶报告质粒转染pRL-TK参考Renilla荧光素酶质粒(Promega)使用FuGene转染试剂(罗氏)根据制造商的指示。在一些实验中,CREB-binding蛋白(CBP)表达载体(43克里斯托弗·k博士](请证明玻璃、加州大学圣地亚哥)或控制向量(pCMV) cotransfected荧光素酶报告质粒。24小时后,细胞预处理与il - 4 30分钟,与干扰素刺激γ和/或有限合伙人为8小时。萤火虫,Renilla荧光素酶活动是化验使用Promega提供的试剂根据他们的指示。标准化的转染效率,荧光素酶的活动Nos2是归一化Renilla荧光素酶活性。

2.9。制备细胞提取

核和胞质提取准备使用一个修改的方法Dignam et al。44,如前所述45]。刺激后,冰冷的PBS的细胞被洗,收获,resuspended在300年μL低渗的缓冲区(10毫米玫瑰,pH值7.9,10毫米氯化钾,EDTA 0.1毫米,0.1毫米EGTA,德勤1毫米,1毫米PMSF和10μ克/毫升的亮抑酶肽、antipain抑肽酶、抑肽素)10分钟在冰上。细胞细胞溶解在0.6% NP-40涡流10秒钟。细胞核被离心与胞质分离12000 g×30秒,和上层清液保存为胞质分数。600年剩余核洗了μL的缓冲区,在缓冲resuspended C(20毫米玫瑰,pH值7.9,25%的甘油,0.4 M氯化钠,1毫米EDTA, EGTA 1毫米,1毫米德勤,1毫米PMSF和10μ亮抑酶肽的g / mL, antipain、抑肽酶和胃酶抑素),简单地用在冰上。核提取物通过离心12000 g×10分钟;蛋白质浓度测定采用布拉德福德法(39)与蛋白质染色试剂(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。

2.10。电泳迁移率改变分析(EMSA)

下面的寡核苷酸(有义链)中使用了EMSA: wt号10月(33];5′-tcgaCAGTTATGCAAAATAGCT-3′;狗号10月5′-tacgaCAGTTCGTACGAATAGCT-3′;和wt搞笑κB 10月(46),5′-tcgaTAATAATTTGCATACCT-3′。突显出序列和斜体代表10月和突变序列的共识序列,分别。绑定的反应,核提取物(5μ在12.5 g蛋白)孵化μL(总量)包含20毫米玫瑰(pH值7.9),氯化钾50毫米,0.1毫米EDTA, 1毫米德勤,5%的甘油,200μ1.25 g / mL BSA,μ克保利(dI-dC)在室温下15分钟。(³²P]标记的寡核苷酸(0.5 ng, 5×10⁵cpm)然后添加到反应混合物在室温下孵化15分钟。分析了反应产物通过5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳0.25×此种缓冲(硼酸三22.3毫米,22.2毫米和0.5毫米EDTA)。在一些实验中,兔子oct - 1抗体,Oct-2和Bob-1 /鲍勃。1在电泳前添加。分析了干凝胶通过放射自显影法和磷光检测。

2.11。免疫印迹分析

细胞被刺激和resuspended后收获里帕缓冲区(0.1% SDS, 1% NP-40 5毫米EDTA, 0.5%钠脱氧胆酸盐,150毫米氯化钠,50 mM玫瑰(pH值8.0),2μg / mL亮抑酶肽,20毫克/毫升抑肽酶,20μg / mL Na₃签证官₄,氟化钠10毫米,1毫米PMSF和2毫米德勤)和离心机在4°C, 12000 g×10分钟;上层清液被恢复为总细胞溶解产物。在一些实验中,核提取物被用作样品。布拉德福德的蛋白浓度测定方法(39使用蛋白质染色试剂(Bio-Rad)]。等量的蛋白质变性在SDS样品缓冲(62.5毫米Tris-HCl (pH值6.8)包含2% SDS、20%甘油、5% 2-mercaptoethanol,和0.2%溴酚蓝),由SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离,转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(微孔,贝德福德,妈,美国)。5%脱脂牛奶的膜被封锁TBS-T [50 mM Tris-HCl (pH值7.4)包含150毫米氯化钠和0.1% Tween-20],孵化与初级抗体在4°C,一夜之间,与TBS-T洗了三次。屁股被孵化1小时在室温下与二次抗体结合辣根过氧化物酶与TBS-T再洗。墨迹是使用一种SuperSignal西部Pico化学发光底物工具包(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。

2.12。统计分析

学生的成对的数据被用来测试与棱镜5软件统计上显著差异(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。结果表示为均值±SEM至少三个实验。一个值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。抑制干扰素γ——和/或LPS-InducedNos2信使rna表达的il - 4取决于Stat6 RAW264.7细胞

我们最初评估是否il - 4抑制干扰素引起的生产γ和/或有限合伙人在macrophage-like细胞株RAW264.7(图1(一))。RAW264.7细胞治疗中单独或il - 4与干扰素刺激前30分钟γ48小时内,和/或有限合伙人和文化上层清液被收割的分析没有生产。如图1(一)没有生产,il - 4显著抑制RAW264.7细胞与干扰素刺激γ和/或有限合伙人。对干扰素研究il - 4的抑制作用γ和/或LPS-inducedNos2mRNA表达,细胞使用il - 4的30分钟,与干扰素刺激γ和/或有限合伙人8小时;总RNA然后由北方杂交(图准备和分析1)。与之前的研究结果相一致(12,28,34- - - - - -36与il - 4],预处理抑制干扰素γ和/或LPS-inducedNos2信使rna表达。

il - 4的生物活性已被证明是主要由转录因子Stat6 [16,17]。因此,要确定抑制Nos2基因表达的il - 4是由Stat6,我们撞倒Stat6使用SMARTpool Stat6 siRNA针对老鼠。实时rt - pcr和免疫印迹分析证实,siRNA-mediated Stat6击倒Stat6转录和蛋白表达水平显著降低了控制核治疗相比(数字2(一个)和2 (b))。同意Stat6水平下降,IL-4-mediated抑制Nos2基因表达干扰素引起的γ和/或有限合伙人被废除的细胞转染Stat6核(图2 (d))。这些结果表明,IL-4-mediated抑制Nos2基因表达取决于Stat6。

3.2。的分析Nos2监管区域IL-4-Mediated抑制

检查的机制IL-4-induced Stat6抑制Nos2基因表达,我们孤立的5′监管区域的鼠标Nos2基因(104−996 ~ +转录启动网站)使用PCR从老鼠基因组DNA。然后我们将扩增片段克隆到pGL2荧光素酶报告质粒(指定为pnos - 996)和分析瞬时转染的荧光素酶活性测定RAW264.7细胞(图所示3)。当细胞与干扰素刺激γ孤独,一个小但在观察荧光素酶活性显著增加,而预处理与il - 4抑制干扰素γ全身的荧光素酶活性降低50%。仅与LPS刺激强烈诱导荧光素酶活动;il - 4也抑制LPS-induced荧光素酶活性,抑制作用的大小是小于的干扰素γ全身的荧光素酶的活动。荧光素酶活动的协同诱导时观察到的细胞被刺激结合干扰素γ有限合伙人,预处理与il - 4也抑制荧光素酶的活动。

确定监管区域负责IL-4-mediated抑制Nos2,一系列的5′的缺失突变体Nos2基因进行了分析。远端增强器的删除元素(区域2)降低干扰素γ全身的荧光素酶活性(pnos pnos - 772 - 333);然而,有限合伙人和干扰素γ加上LPS-stimulated荧光素酶活动是与全身的活动启动子构建。此外,与il - 4预处理抑制干扰素诱导的荧光素酶活性γ与这些记者和有限合伙人在细胞转染结构。删除NF-IL-6站点(pnos - 143)减少本构活动与干扰素γ和/或LPS-induced荧光素酶活性,表明这个网站有助于整体推广活动;IL-4-mediated抑制荧光素酶活性还观察到与此结构。尽管NF -的删除κB站点(pnos - 62)只有轻微影响荧光素酶活动,删除的八聚物(10月)网站几乎完全废除了活动(pNOS-44)。

3.3。八聚物的转录因子结合位点的IL-4-Mediated抑制Nos2基因表达

因为10月网站在近端启动子区域似乎是关键的转录调控Nos2这个网站的基因位点突变,κB网站创建的长篇pnos - 996荧光素酶荧光素酶活性(图构造和分析4)。虽然变异的近端κB站点减少LPS-induced荧光素酶活性和IL-4-mediated荧光素酶活性,抑制il - 4的干扰素的抑制作用γ——或干扰素γ加上LPS-induced荧光素酶活性还观察到。尽管如此,10月网站进一步降低了干扰素的突变γ——和/或LPS-induced荧光素酶活性,抑制il - 4的影响也减少,这表明10月网站负责调停il - 4的抑制作用。的重要性来确定10月网站的积极的和消极的监管Nos2基因,κB和10月网站是突变的上下文中pnos - 333远端增强剂的地区已被删除。的突变κB明显减少了LPS-induced荧光素酶活动,虽然il - 4的抑制作用还观察到细胞与干扰素刺激γ——或干扰素γ+有限合伙人。10月网站突变时,干扰素引起的荧光素酶活性γ和/或有限合伙人和il - 4的抑制作用明显降低。这些结果表明,10月网站似乎调解il - 4的抑制作用的转录调控Nos2在RAW276.7细胞基因。

为了进一步确认10月网站的监管的重要性Nos2,这个网站是由定点诱变突变的上下文中的最小启动子构建(pnos - 62),其中包含10月网站TATA盒,104个基点的5′非翻译区;这种构造的能力协调应对干扰素γ和/或有限合伙人在瞬时转染化验(图然后评估5)。突变的10月网站几乎完全废除了干扰素引起的荧光素酶活性γ和/或有限合伙人,这表明所需的10月网站的转录激活转录镇压的最小启动子构建和il - 4是通过这个网站介导的。

3.4。分析10月绑定核从RAW264.7细胞提取准备的活动

检查是否il - 4诱发或调节核转录因子(s)专门(s)绑定到10月序列,核提取物是从RAW264.7细胞准备和分析通过EMSA使用放射性标记的寡核苷酸(图10月对应序列6)。本构DNA结合活性观察到核提取物治疗细胞,此绑定活动并没有增强通过干扰素γ(图或有限合伙人单独或组合6(一)通道1,3,5,7)。此外,这些本构OCT-binding活动并非由il - 4修改治疗(通道2,4,6,8)。一个时间进程的实验表明,没有观察到显著增加OCT-binding活动核提取物RAW264.7细胞干扰素治疗γ和有限合伙人(图6 (b))。观察到OCT-binding活动是专门与野生型Nos210月(wt 10月号)寡核苷酸(图6 (c),弄2)和免疫球蛋白的共识10月主题kappa链(搞笑κ)基因(wt搞笑κ10月)[46(4)道,而突变体Nos210月寡核苷酸(巷3)EMSA没有竞争。尽管OCT-binding活动与野生型的竞争Nos210月时的共识搞笑κ10月的主题是用作探针(巷6),竞争相比是低效率的搞笑κ10月主题(巷8)。

抗体super-shift分析被执行来识别结合的转录因子Nos210月网站(图6 (d))。抗体对八聚物转录因子- 1 (Oct - 1) super-shifted OCT-binding活动(巷2),和一个抗体Oct-2减少乐队(s)迁移Oct - 1以下复杂(巷3)。这些结果表明,OCT-binding复杂主要包含Oct - 1表达和一些Oct-2起来从而治疗与il - 4没有影响10月蛋白质的绑定Nos210月的网站。我们还证实,il - 4对oct - 1没有抑制作用或Oct-2 mRNA和蛋白表达在原始264.7细胞(补充图2)。

3.5。超表达IL-4-Mediated CBP部分变弱的抑制Nos2推广活动

oct - 1和Oct-2共激活剂与显示BOB.1 /票据。1(官方标志:Pou2af1),促进OCT-dependent转录(47- - - - - -49]。因为Nos210月绑定活动不是由il - 4修改,共激活剂和/或辅助因子可能与OCT - 1 IL-4-mediated抑制的目标。检查水平的内生BOB.1 RAW264.7细胞蛋白质,西方墨迹图进行与干扰素与细胞溶解产物刺激γ和/或有限合伙人(图7(一))。尽管BOB.1组成型表达的蛋白在小鼠B细胞系BCL1-B20(巷1),没有可检测水平的BOB.1蛋白干扰素的观察γ和/或LPS-stimulated RAW264.7细胞(通道2 ~ 5)。这些结果表明,共激活剂/辅因子除了BOB.1参与Oct-1-dependent转录激活和IL-4-mediated抑制Nos2基因。

因为IL-4-induced Stat6与共激活剂CREB-binding蛋白质(CBP)在小鼠巨噬细胞(巨噬细胞和CBP表达19),我们海关与边境保护局表达载体转染到RAW264.7细胞,研究il - 4的抑制作用Nos2启动子活动。如图7 (b)美国海关与边境保护局表达载体,转染干扰素疗效γ- - - LPS-inducedNos2启动子活性和部分减毒IL-4-mediated干扰素引起的抑制子活动γ和/或有限合伙人。综上所述,这些研究结果表明模型的IL-4-mediated抑制Nos2启动子活性取决于共激活剂/辅因子功能促进Oct-1-dependent转录激活的Nos2基因;此外,il - 4的转录镇压可能由这共激活剂/代数余子式的封存IL-4-induced Stat6。

4所示。讨论

我们之前和其他人表明Stat6函数作为负调节的il - 4的抗炎活动或IL-13正无穷γ全身巨噬细胞基因表达(19- - - - - -21,50]。尽管Stat6所需的il - 4或IL-13-mediated抑制老鼠Nos2干扰素引起的γ和有限合伙人在小鼠巨噬细胞50),Stat6-mediated抑制的分子机制仍有待阐明。在目前的研究中,我们探讨了参与IL-4-mediated抑制的机制Nos2基因的老鼠macrophage-like细胞株RAW264.7。我们最初确认Stat6 IL-4-mediated抑制的是必要的Nos2基因表达用siRNA击倒(图2)。然后,我们调查的机制IL-4-induced Stat6抑制转录的激活Nos2使用基因瞬时转染试验包含一系列的荧光素酶报告基因5′的缺失突变体和基因定点突变体Nos2监管区域。我们的研究结果表明,10月站点位于近端启动子区域Nos2所需基因的转录激活干扰素引起的γil - 4 /有限合伙人和转录镇压的RAW264.7细胞。这些结论是基于以下的观察。突变的10月网站长篇的上下文中Nos2启动子构建(pnos - 996 Luc)显著减少了启动子活动正引起的γ和/或有限合伙人和IL-4-mediated抑制启动子活动(图4)。最小启动子构建鼠标Nos2基因(Luc pnos - 62),其中包含一个10月网站和塔塔框,保留了干扰素反应γ10月/有限合伙人和il - 4,而突变的网站几乎完全废除这个响应(图5)。

10月网站Nos2近端启动子区域已被证明在LPS-induced起着至关重要的作用Nos2基因表达(31日- - - - - -33,51- - - - - -53]。八聚物图案(ATGCAAAT)是一种守恒的DNA结合元素中发现许多基因的启动子/增强子地区,包括组蛋白等基因表达H2B基因,小核RNA基因,修复基因(54]。POU homeodomain家族成员OCT - 1和10月Oct-2识别网站的老鼠Nos2基因(32,33,51- - - - - -53]。提出了研究结果符合前面的观察的八聚物图案Nos2启动子是LPS-induced所需子活动。此外,我们的研究结果证明在干扰素这个主题的重要作用γ全身的推广活动和IL-4-mediated负调控的启动子活动。据我们所知,这是第一个示范的10月网站Nos2启动子区域介导转录镇压老鼠巨噬细胞il - 4。

陆的先前的研究显示,LPS诱导Oct-2 RAW264.7细胞中表达,trichostatin,组蛋白脱乙酰酶抑制剂,抑制LPS-inducedNos2表达式通过抑制LPS-induced Oct-2表达式(53),这表明Oct-2激活是一个关键步骤的转录激活Nos2基因。虽然我们还观察到一个Oct-2 mRNA和蛋白表达增加RAW264.7细胞处理有限合伙人(补充图2),il - 4的抑制Nos2基因并不是由于下调oct - 1或Oct-2表达式:EMSA表明,尽管八聚物绑定活动,这主要是由于oct - 1和少量的Oct-2, RAW264.7细胞中核提取物,观察il - 4没有影响观察的竞拍活动八聚物(图6)。此外,实时rt - pcr和免疫印迹分析表明,il - 4对oct - 1的表达没有抑制作用,Oct-2信使rna和蛋白质(补充数据)。这些证据表明,oct - 1和Oct-2表达的下调是不可能il - 4抑制的机制Nos2基因转录活动。

oct - 1的转录活动和Oct-2增强的lymphocyte-specific共激活剂BOB.1 /票据。1 (47- - - - - -49,55]。因此,可想而知,共激活剂或辅助因子的功能与oct - 1 / Oct-2 IL-4-mediated转录镇压的可能目标Nos2,也就是说,IL-4-activated Stat6竞争共激活剂/辅因子与oct - 1相互作用。因此,如果这个共激活剂的抑制是由竞争/辅因子,共激活剂/辅因子的超表达减弱il - 4的转录镇压。然而,BOB.1已被证明是一个lymphocyte-specific共激活剂,和巨噬细胞系的细胞不表达BOB.1 [48,56];我们还证实,RAW264.7细胞不表达BOB.1,甚至在与干扰素刺激γ和/或有限合伙人(图7(一))。这些发现表明,共激活剂/辅因子除了BOB.1功能与oct - 1或Oct-2分子目标的IL-4-mediated抑制Nos2基因。我们曾表明IL-4-induced Stat6与巨噬细胞共激活剂CBP;事实上,CBP实际上是在老鼠巨噬细胞中表达的19]。因此,我们测试的可能性与CBP表达载体转染IL-4-mediated抑制的影响Nos2启动子活动。与CBP表达载体转染部分减毒的抑制作用,il - 4干扰素γ/ LPS-induced子活动,这表明CBP和另一个共激活剂/辅因子功能与oct - 1可能参与转录镇压。oct - 1已被证明与组件交互的通用转录机械,包括真沸点,TFIIB, TFIIH [57- - - - - -60]。还需要进一步的研究来检验是否IL-4-activated STAT6直接或间接地与这些组件和/或其他辅活化因子/辅因子和抑制的Oct-1-dependent转录调控Nos2基因。

一氧化氮产生的间接宾语是一个标志性分子参与M1的经典活化的巨噬细胞。伊诺发挥抗肿瘤和杀菌剂的活动对细胞内病原体和功能作为一个潜在的host-destructive中介(3,61年]。M1巨噬细胞的功能的能力,通常是由TLR配体如有限合伙人和诱导t细胞细胞因子IFN派生而来γ负受抗炎细胞因子,包括il - 4和IL-13。两种细胞因子,在M2巨噬细胞激活另一种途径,通过诱导没有被证明能够调节生产精氨酸酶我催化水解的精氨酸,伊诺的常见基质,从而没有合成与底物竞争[8]。因为感应精氨酸酶我il - 4 / IL-13也受Stat6 [62年),il - 4 / IL-13-induced Stat6似乎积极直接对M2巨噬细胞表型的诱导基因的表达,参与M2表型,如精氨酸酶我,通过抑制基因参与了M1表型,如Nos2。

5。结论

总之,我们证明的负调节鼠标Nos2il - 4基因的小鼠巨噬细胞细胞系取决于Stat6。我们的分析的5′侧翼监管区域Nos2基因显示10月网站需要在近端启动子区域- il - 4的监管。我们的结果表明模型共激活剂/辅因子的功能与oct - 1是一个分子的IL-4-mediated抑制的目标Nos2基因和IL-4-activated Stat6压制Oct-1-dependent转录与这共激活剂/代数余子式竞争。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢Christopher k博士玻璃提供了表达向量。这项工作是支持的补助金从教育部科学研究,科学和日本的文化。

补充材料

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