有限合伙人准备使用韦氏比重酚提取 大肠杆菌(0111:B4)获得Sigma-Aldrich公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。鼠标重组干扰素 γ和il - 4从Chemicon获得国际(美国泰梅库拉,CA)和研发系统(美国麦金利,NE),分别。兔多克隆抗体Stat6 (sc - 981), β肌动蛋白(sc - 1616), Bob-1 /鲍勃。1(sc-955), TATA-binding protein (TBP; sc-204), Oct-1 (sc-232), and Oct-2 (sc-233) were obtained from Santa Cruz Biotechnology (Hercules, CA, USA).

从美国获得了鼠标macrophage-like细胞株RAW264.7类型文化修正(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)和培养在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM;表达载体、大岛屿,美国纽约)补充10%胎牛血清(的边后卫;美国佛罗里达州西部生物、迈阿密、)和1%青霉素G /硫酸链霉素(表达载体)。对于所有实验,细胞亚文化直到70% ~ 80%汇合的单层。细胞被使用10 ng / mL重组小鼠il - 4为刺激前30分钟10 ng / mL鼠标干扰素 γ和/或100 ng / mL有限合伙人指定的时间了。鼠标B细胞白血病细胞系BCL1-B20 (RCB2618) [ 37理研生物资源中心)是经(日本东京)和RPMI1640培养补充了青霉素G /硫酸链霉素的边后卫10%和1%。

亚硝酸盐积累的文化上层的格里斯试验测量,如前所述[ 38]。简单地说,100 - μL整除文化的上层清液与同等容积的孵化格里斯试剂(1%磺胺/ 0.1% N——(1-naphthyl)乙二胺盐酸盐/ 2.5% H₃阿宝₄)在室温下10分钟。在550纳米样品的吸光度测量使用标(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国),和 没有 2 - - - - - - 内容决定使用亚硝酸钠作为标准。细胞蛋白质在每种文化也是由布拉德福德法( 39]。没有生产表示为nmol /蛋白质含量。

isothiocyanate-cesium氯胍的总RNA的制备方法和杂交分析北部进行如前所述[ 40]。在一些实验中,总RNA制备使用快速纯RNA工具包(豆类,大津,日本)。鼠标的互补脱氧核糖核酸探针诱导一氧化氮合酶( Nos2)和老鼠glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶( Gapdh)描述了其他地方 40, 41]。

互补脱氧核糖核酸的合成纯化使用高容量cDNA总RNA逆转录工具包(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。实时PCR探针和引物特定的鼠标 Nos2, Stat6, oct - 1, Oct-2如表1所示,可以在补充材料 http://dx.doi.org/10.1155/2013/369693,选择使用通用探针库分析设计中心(罗氏应用科学、巴塞尔、瑞士)。整除的cDNA放大使用LightCycler 480实时PCR系统(罗氏)和TaqMan基因表达主人混合(生命技术)根据制造商的指示。PCR循环条件如下:95°C的循环5分钟和95°C 10年代,30年代60°C, 72°C 10年代。转录水平计算相对于18 s rRNA作为内部控制水平。

细胞被播种在24-well板块和转染100海里的智能池siRNA针对鼠标Stat6(混合物的四个不同的小干扰rna寡核苷酸Stat6能够切中要害:AGGCUUCACCAUCGAGUAA, CCAAGACAACAACGCCAAA, GGAUGAAGUCCUGCGAAC,和UGGUCAUCGUGCAUGGUAA)使用Dharmafect Duo转染试剂按照制造商的指示(热科学)。小干扰rna寡核苷酸的ON-TARGETplus不属预定目标的池包含四个不同的不属预定目标的(热科学)作为消极的控制。小干扰rna转染在36小时后,这些细胞被预处理与il - 4 30分钟,与干扰素刺激 γ和/或有限合伙人总RNA的准备前8小时实时rt - pcr或为西方墨点法总细胞溶解产物。

启动子/增强子区域的鼠标 Nos2基因(−996 ~ + 104;参见[ 23)从老鼠基因组DNA分离(WI Promega,麦迪逊,美国)通过PCR可以天涯DNA聚合酶(表达载体)。表2列出了PCR引物补充。的gene-specific正向和反向引物含有限制性内切酶网站( MluI和 BglII、职责);PCR产品消化了 MluI和 BglII1.0%的琼脂糖凝胶分析,使用DNA提取和纯化工具包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)根据制造商的指示。纯化PCR产品(104−996 ~ +)subcloned成一个 MluI- - - BglII消化pGL2荧光素酶报告质粒(Promega),以及由此产生的质粒被指定为pnos - 996。一系列的缺失突变体的5′侧翼的区域 Nos2基因是由限制性内切酶消化pnos - 996 ( SmaI772年− 尚驰−333, PstI−44)。另一个系列的近端5′侧翼地区缺失突变体,对应于该地区之间+ 104−143−86−62或−17日由使用正向和反向PCR引物包含生成的 MluI和 BglII网站,分别(补充表2)。PCR产品消化 MluI和 BglII和subcloned pGL2荧光素酶报告质粒。

位点突变的近端 κ10月B站点和站点是由一个两轮PCR方法的修改( 42]。在短暂的, κB站点(5′-GGGACTCTCC-3′)突变5′-ccAC atcgat3,小写字母表示突变序列和斜体表示 ClaI网站,使用两套PCR引物包含突变序列(补充表2)。10月网站(5′-ATGCAAAA-3′) 5′-突变 cgtacgAA-3′,小写字母和斜体显示突变序列 BsiWI网站,分别使用两套引物。的详细施工方法变异记者构造图1中描述的补充。由此产生的突变体结构经测序。

RAW264.7细胞被播种到24-well盘子1×10的密度⁴细胞在DMEM /补充10%的边后卫和培养转染前16个小时。细胞被瞬变与荧光素酶报告质粒转染pRL-TK参考 Renilla荧光素酶质粒(Promega)使用FuGene转染试剂(罗氏)根据制造商的指示。在一些实验中,CREB-binding蛋白(CBP)表达载体( 43克里斯托弗·k博士](请证明玻璃、加州大学圣地亚哥)或控制向量(pCMV) cotransfected荧光素酶报告质粒。24小时后,细胞预处理与il - 4 30分钟,与干扰素刺激 γ和/或有限合伙人为8小时。萤火虫, Renilla荧光素酶活动是化验使用Promega提供的试剂根据他们的指示。标准化的转染效率,荧光素酶的活动 Nos2是归一化 Renilla荧光素酶活性。

核和胞质提取准备使用一个修改的方法Dignam et al。 44,如前所述 45]。刺激后,冰冷的PBS的细胞被洗,收获,resuspended在300年 μL低渗的缓冲区(10毫米玫瑰,pH值7.9,10毫米氯化钾,EDTA 0.1毫米,0.1毫米EGTA,德勤1毫米,1毫米PMSF和10 μ克/毫升的亮抑酶肽、antipain抑肽酶、抑肽素)10分钟在冰上。细胞细胞溶解在0.6% NP-40涡流10秒钟。细胞核被离心与胞质分离12000 g×30秒,和上层清液保存为胞质分数。600年剩余核洗了 μL的缓冲区,在缓冲resuspended C(20毫米玫瑰,pH值7.9,25%的甘油,0.4 M氯化钠,1毫米EDTA, EGTA 1毫米,1毫米德勤,1毫米PMSF和10 μ亮抑酶肽的g / mL, antipain、抑肽酶和胃酶抑素),简单地用在冰上。核提取物通过离心12000 g×10分钟;蛋白质浓度测定采用布拉德福德法( 39)与蛋白质染色试剂(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。

下面的寡核苷酸(有义链)中使用了EMSA: wt号10月( 33];5′-tcgaCAGTT ATGCAAAATAGCT-3′;狗号10月5′-tacgaCAGTT CGTA CGAATAGCT-3′;和wt搞笑 κB 10月( 46),5′-tcgaTAATAA TTTGCATACCT-3′。突显出序列和斜体代表10月和突变序列的共识序列,分别。绑定的反应,核提取物(5 μ在12.5 g蛋白)孵化 μL(总量)包含20毫米玫瑰(pH值7.9),氯化钾50毫米,0.1毫米EDTA, 1毫米德勤,5%的甘油,200 μ1.25 g / mL BSA, μ克保利(dI-dC)在室温下15分钟。(³²P]标记的寡核苷酸(0.5 ng, 5×10⁵cpm)然后添加到反应混合物在室温下孵化15分钟。分析了反应产物通过5%的聚丙烯酰胺凝胶电泳0.25×此种缓冲(硼酸三22.3毫米,22.2毫米和0.5毫米EDTA)。在一些实验中,兔子oct - 1抗体,Oct-2和Bob-1 /鲍勃。1在电泳前添加。分析了干凝胶通过放射自显影法和磷光检测。

细胞被刺激和resuspended后收获里帕缓冲区(0.1% SDS, 1% NP-40 5毫米EDTA, 0.5%钠脱氧胆酸盐,150毫米氯化钠,50 mM玫瑰(pH值8.0),2 μg / mL亮抑酶肽,20毫克/毫升抑肽酶,20 μg / mL Na₃签证官₄,氟化钠10毫米,1毫米PMSF和2毫米德勤)和离心机在4°C, 12000 g×10分钟;上层清液被恢复为总细胞溶解产物。在一些实验中,核提取物被用作样品。布拉德福德的蛋白浓度测定方法( 39使用蛋白质染色试剂(Bio-Rad)]。等量的蛋白质变性在SDS样品缓冲(62.5毫米Tris-HCl (pH值6.8)包含2% SDS、20%甘油、5% 2-mercaptoethanol,和0.2%溴酚蓝),由SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离,转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(微孔,贝德福德,妈,美国)。5%脱脂牛奶的膜被封锁TBS-T [50 mM Tris-HCl (pH值7.4)包含150毫米氯化钠和0.1% Tween-20],孵化与初级抗体在4°C,一夜之间,与TBS-T洗了三次。屁股被孵化1小时在室温下与二次抗体结合辣根过氧化物酶与TBS-T再洗。墨迹是使用一种SuperSignal西部Pico化学发光底物工具包(美国皮尔斯,罗克福德,IL)。

学生的 t 成对的数据被用来测试与棱镜5软件统计上显著差异(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。结果表示为均值±SEM至少三个实验。一个 P 值小于0.05被认为是具有统计学意义。

我们最初评估是否il - 4抑制干扰素引起的生产 γ和/或有限合伙人在macrophage-like细胞株RAW264.7(图 1(一))。RAW264.7细胞治疗中单独或il - 4与干扰素刺激前30分钟 γ48小时内,和/或有限合伙人和文化上层清液被收割的分析没有生产。如图 1(一)没有生产,il - 4显著抑制RAW264.7细胞与干扰素刺激 γ和/或有限合伙人。对干扰素研究il - 4的抑制作用 γ和/或LPS-induced Nos2mRNA表达,细胞使用il - 4的30分钟,与干扰素刺激 γ和/或有限合伙人8小时;总RNA然后由北方杂交(图准备和分析 1)。与之前的研究结果相一致( 12, 28, 34- - - - - - 36与il - 4],预处理抑制干扰素 γ和/或LPS-induced Nos2信使rna表达。

il - 4的生物活性已被证明是主要由转录因子Stat6 [ 16, 17]。因此,要确定抑制 Nos2基因表达的il - 4是由Stat6,我们撞倒Stat6使用SMARTpool Stat6 siRNA针对老鼠。实时rt - pcr和免疫印迹分析证实,siRNA-mediated Stat6击倒Stat6转录和蛋白表达水平显著降低了控制核治疗相比(数字 2(一个)和 2 (b))。同意Stat6水平下降,IL-4-mediated抑制 Nos2基因表达干扰素引起的 γ和/或有限合伙人被废除的细胞转染Stat6核(图 2 (d))。这些结果表明,IL-4-mediated抑制 Nos2基因表达取决于Stat6。

检查的机制IL-4-induced Stat6抑制 Nos2基因表达,我们孤立的5′监管区域的鼠标 Nos2基因(104−996 ~ +转录启动网站)使用PCR从老鼠基因组DNA。然后我们将扩增片段克隆到pGL2荧光素酶报告质粒(指定为pnos - 996)和分析瞬时转染的荧光素酶活性测定RAW264.7细胞(图所示 3)。当细胞与干扰素刺激 γ孤独,一个小但在观察荧光素酶活性显著增加,而预处理与il - 4抑制干扰素 γ全身的荧光素酶活性降低50%。仅与LPS刺激强烈诱导荧光素酶活动;il - 4也抑制LPS-induced荧光素酶活性,抑制作用的大小是小于的干扰素 γ全身的荧光素酶的活动。荧光素酶活动的协同诱导时观察到的细胞被刺激结合干扰素 γ有限合伙人,预处理与il - 4也抑制荧光素酶的活动。

确定监管区域负责IL-4-mediated抑制 Nos2,一系列的5′的缺失突变体 Nos2基因进行了分析。远端增强器的删除元素(区域2)降低干扰素 γ全身的荧光素酶活性(pnos pnos - 772 - 333);然而,有限合伙人和干扰素 γ加上LPS-stimulated荧光素酶活动是与全身的活动启动子构建。此外,与il - 4预处理抑制干扰素诱导的荧光素酶活性 γ与这些记者和有限合伙人在细胞转染结构。删除NF-IL-6站点(pnos - 143)减少本构活动与干扰素 γ和/或LPS-induced荧光素酶活性,表明这个网站有助于整体推广活动;IL-4-mediated抑制荧光素酶活性还观察到与此结构。尽管NF -的删除 κB站点(pnos - 62)只有轻微影响荧光素酶活动,删除的八聚物(10月)网站几乎完全废除了活动(pNOS-44)。

因为10月网站在近端启动子区域似乎是关键的转录调控 Nos2这个网站的基因位点突变, κB网站创建的长篇pnos - 996荧光素酶荧光素酶活性(图构造和分析 4)。虽然变异的近端 κB站点减少LPS-induced荧光素酶活性和IL-4-mediated荧光素酶活性,抑制il - 4的干扰素的抑制作用 γ——或干扰素 γ加上LPS-induced荧光素酶活性还观察到。尽管如此,10月网站进一步降低了干扰素的突变 γ——和/或LPS-induced荧光素酶活性,抑制il - 4的影响也减少,这表明10月网站负责调停il - 4的抑制作用。的重要性来确定10月网站的积极的和消极的监管 Nos2基因, κB和10月网站是突变的上下文中pnos - 333远端增强剂的地区已被删除。的突变 κB明显减少了LPS-induced荧光素酶活动,虽然il - 4的抑制作用还观察到细胞与干扰素刺激 γ——或干扰素 γ+有限合伙人。10月网站突变时,干扰素引起的荧光素酶活性 γ和/或有限合伙人和il - 4的抑制作用明显降低。这些结果表明,10月网站似乎调解il - 4的抑制作用的转录调控 Nos2在RAW276.7细胞基因。

为了进一步确认10月网站的监管的重要性 Nos2,这个网站是由定点诱变突变的上下文中的最小启动子构建(pnos - 62),其中包含10月网站TATA盒,104个基点的5′非翻译区;这种构造的能力协调应对干扰素 γ和/或有限合伙人在瞬时转染化验(图然后评估 5)。突变的10月网站几乎完全废除了干扰素引起的荧光素酶活性 γ和/或有限合伙人,这表明所需的10月网站的转录激活转录镇压的最小启动子构建和il - 4是通过这个网站介导的。

检查是否il - 4诱发或调节核转录因子(s)专门(s)绑定到10月序列,核提取物是从RAW264.7细胞准备和分析通过EMSA使用放射性标记的寡核苷酸(图10月对应序列 6)。本构DNA结合活性观察到核提取物治疗细胞,此绑定活动并没有增强通过干扰素 γ(图或有限合伙人单独或组合 6(一)通道1,3,5,7)。此外,这些本构OCT-binding活动并非由il - 4修改治疗(通道2,4,6,8)。一个时间进程的实验表明,没有观察到显著增加OCT-binding活动核提取物RAW264.7细胞干扰素治疗 γ和有限合伙人(图 6 (b))。观察到OCT-binding活动是专门与野生型 Nos210月(wt 10月号)寡核苷酸(图 6 (c),弄2)和免疫球蛋白的共识10月主题kappa链( 搞笑 κ )基因(wt搞笑 κ10月)[ 46(4)道,而突变体 Nos210月寡核苷酸(巷3)EMSA没有竞争。尽管OCT-binding活动与野生型的竞争 Nos210月时的共识 搞笑 κ 10月的主题是用作探针(巷6),竞争相比是低效率的 搞笑 κ 10月主题(巷8)。

抗体super-shift分析被执行来识别结合的转录因子 Nos210月网站(图 6 (d))。抗体对八聚物转录因子- 1 (Oct - 1) super-shifted OCT-binding活动(巷2),和一个抗体Oct-2减少乐队(s)迁移Oct - 1以下复杂(巷3)。这些结果表明,OCT-binding复杂主要包含Oct - 1表达和一些Oct-2起来从而治疗与il - 4没有影响10月蛋白质的绑定 Nos210月的网站。我们还证实,il - 4对oct - 1没有抑制作用或Oct-2 mRNA和蛋白表达在原始264.7细胞(补充图2)。

oct - 1和Oct-2共激活剂与显示BOB.1 /票据。1(官方标志:Pou2af1),促进OCT-dependent转录( 47- - - - - - 49]。因为 Nos210月绑定活动不是由il - 4修改,共激活剂和/或辅助因子可能与OCT - 1 IL-4-mediated抑制的目标。检查水平的内生BOB.1 RAW264.7细胞蛋白质,西方墨迹图进行与干扰素与细胞溶解产物刺激 γ和/或有限合伙人(图 7(一))。尽管BOB.1组成型表达的蛋白在小鼠B细胞系BCL1-B20(巷1),没有可检测水平的BOB.1蛋白干扰素的观察 γ和/或LPS-stimulated RAW264.7细胞(通道2 ~ 5)。这些结果表明,共激活剂/辅因子除了BOB.1参与Oct-1-dependent转录激活和IL-4-mediated抑制 Nos2基因。

因为IL-4-induced Stat6与共激活剂CREB-binding蛋白质(CBP)在小鼠巨噬细胞(巨噬细胞和CBP表达 19),我们海关与边境保护局表达载体转染到RAW264.7细胞,研究il - 4的抑制作用 Nos2启动子活动。如图 7 (b)美国海关与边境保护局表达载体,转染干扰素疗效 γ- - - LPS-induced Nos2启动子活性和部分减毒IL-4-mediated干扰素引起的抑制子活动 γ和/或有限合伙人。综上所述,这些研究结果表明模型的IL-4-mediated抑制 Nos2启动子活性取决于共激活剂/辅因子功能促进Oct-1-dependent转录激活的 Nos2基因;此外,il - 4的转录镇压可能由这共激活剂/代数余子式的封存IL-4-induced Stat6。