文摘
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病的动脉壁与自身免疫反应有关。在先前的研究中,我们观察到的存在actin-specific从颈动脉粥样硬化患者血清的抗体。扩展我们的以前的结果评估的可能作用肌动蛋白作为抗原细胞介导免疫反应在颈动脉粥样硬化的目标。外周血单核细胞(PBMC) 17患者和16名健康受试者被检测为细胞因子通过细胞增殖试验和ELISA生产。肌动蛋白诱导增殖反应在47%的患者PBMC样本,如果从2.6到21.1,而没有一个健康受试者的样本(病人与健康受试者,)。糖尿病患者的存在能显著增生性反应肌动蛋白()。干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α从患者PBMC的浓度高于在健康受试者和PBMC增殖比nonproliferating的肌动蛋白。我们的数据首次证明肌动蛋白的角色作为目标自身抗原的细胞免疫反应在颈动脉粥样硬化患者。优惠促炎Th1激活表明肌动蛋白可能导致内皮功能障碍,组织损伤,颈动脉粥样硬化和系统性炎症。
1。介绍
动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病的动脉壁免疫反应中起到至关重要的作用。动脉粥样硬化斑块的特点是存在炎症细胞浸润主要由巨噬细胞和T淋巴细胞通过分泌炎症介质,调节动脉粥样硬化过程。浸润T淋巴细胞激活T细胞表达CD25表面(1),主要表达了Th1表型在先进的病变2,3]。在这种背景下,负责T淋巴细胞识别抗原激活在动脉粥样硬化可能是相关的。加速动脉粥样硬化患者据报道各种自身免疫性疾病(4- - - - - -6),这表明自身免疫机制的参与(血管硬化7]。虽然感染与免疫机制的激活有关,一些证据表明,动脉粥样硬化的主要抗原目标修改内生结构(8]。不同自体抗原或修改自体分子已经被确认为目标的体液和细胞免疫反应在动脉粥样硬化疾病患者能够激活促炎反应行为是危险的信号。这些患者的氧化应激,越来越多的报道(9),是蛋白质的主要事件导致结构修改10]。
氧化低密度脂蛋白(LDL)是最好的自身抗原的特征。特别是,它已经表明,大约10%的T淋巴细胞浸润人类动脉粥样硬化斑块是特定的氧化低密度脂蛋白(11]。除了LDL,修改其他自体分子氧化应激成为目标的自身免疫反应在动脉粥样硬化(12- - - - - -14]。两个类别的自身抗原,与动脉粥样硬化的压力诱导热休克蛋白和抗原表达的细胞死亡(15,16]。动脉粥样硬化斑块中细胞死亡可能发生细胞凋亡或坏死(17,18]。凋亡细胞的吸收由巨噬细胞和树突细胞的某些子集产生抗炎反应和发挥重要作用在维持外周免疫耐受(19,20.]。相反,坏死细胞的吸收,甚至延迟凋亡细胞的吸收可能会导致免疫激活和风险发展的自身免疫(21]。
在先前的研究中,通过使用分子克隆策略识别内皮自身抗原,我们提供的证据血清抗体anti-actin颈动脉粥样硬化患者,我们建议,肌动蛋白是一个autoantigenic分子潜在的临床兴趣颈动脉粥样硬化(22]。
我们设计了本研究确认和扩展我们之前的结果的可能作用肌动蛋白作为目标抗原的免疫反应在颈动脉粥样硬化。为此,我们评估循环T淋巴细胞的增殖反应从病人和健康受试者,获得刺激在体外肌动蛋白。
我们也调查的能力actin-specific循环T淋巴细胞产生促炎细胞因子干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α和抗炎细胞因子il - 4和il - 10。
2。材料和方法
2.1。主题
我们招收17连续患者无症状严重或preocclusive颈动脉狭窄≥70%或症状性狭窄接受动脉内膜切除术(CEA) Sapienza大学的罗马。患者分组,根据他们的动脉粥样硬化斑块的组织学类型分类后Stary et al。23]。13名患者类型V斑块和4患者类型VI斑块。总之,V型斑块被定义为病变中突出新纤维结缔组织形成了。VI型斑块被定义为损伤破坏的损伤表面,血肿或出血和血栓形成的存款已经开发和可能被称为复杂的病变。病人报告在表的基线特征1。我们还招募了16个性别和年龄健康受试者作为控制。排除标准为患者近期感染(< 1个月)、自身免疫性疾病、恶性肿瘤和入学前炎性疾病。健康受试者的入选标准是没有心肌梗塞、冠状动脉旁路手术、冠状动脉造影和血管成形术或支架或者两者兼有,脑血管意外,或周围性血管疾病。他们都没有ultrasonographically明显颈动脉或股动脉动脉粥样硬化性疾病。所有血液变量包括动脉粥样硬化的危险因素在“正常”的范围值。调查符合赫尔辛基宣言中概述的原则。入学之前获得知情同意。
2.2。血液样本
静脉外周血是肝素管从17个病人(手术前)和16名健康受试者。外周血单核细胞(PBMC)是由密度梯度离心法分离血浆(Lympholyte, Cedarlane、加拿大)和被用于扩散试验。PBMC样本存储在−80°C到使用。
2.3。肌动蛋白扩散分析
一式三份PBMC的文化(细胞/毫升)刺激了7天兔肌肌动蛋白(Sigma-Aldrich、米兰、意大利、20μg / mL)、植物凝集素(PHA,巴勒斯康有限公司Beckenham,英国2μg / mL)积极控制试验,或人血清白蛋白(HSA Sigma-Aldrich 10μg / mL)作为一个消极的控制,或如果离开了。肌动蛋白中内毒素污染,由定量显色鲎变形细胞溶解产物测定(qcl - 1000, BioWhittaker Walkersville, MD), < 0.03内毒素单位/μ克蛋白质。中和内毒素可能效果,所有细胞培养在多粘菌素B(10的存在μg / mL, Sigma-Aldrich)。
细胞增殖是评估3H-methyl-thymidine合并分析如前所述[24]。增生性反应表示为刺激指数(SI,比率平均cpm在刺激文化,如果文化)。在健康受试者平均刺激指数+ 3个标准差作为积极的阈值水平。
2.4。细胞因子测定
干扰素-γ肿瘤坏死因子-α、il - 4和il - 10含量文化上层清液循环T淋巴细胞与商用量化酶联免疫吸附试验(ELISA)集(OptEIA集,BD生物科学、钙、美国)所推荐的制造商。检测的局限性是干扰素- 1 pg / mLγ2对肿瘤坏死因子- pg / mLα、il - 4和il - 10。
2.5。统计分析
结果表示为算术方法或中位数和四分位范围。Mann-WhitneyU和Wilcoxon非参数测试是用于调查的意义未配对,配对数据。单变量分析的所有检查反是作为actin-specific细胞反应的预测因子。确切概率法和Mann-WhitneyU测试是用来评估不同的离散和连续患者的团体之间的临床特点。一个被认为具有统计显著性值小于0.05。
3所示。结果
3.1。肌动蛋白循环T淋巴细胞的增殖反应
在选定的人口健康的主题,我们决定意味着SI值1.13和0.29的SD和我们计算的价值2.0截止积极性。肌动蛋白诱导增殖反应8 17例(47%)患者PBMC样本,如果从2.6到21.1(图1)。PBMC健康受试者的样本不扩散对肌动蛋白的反应。如果平均值之间的差异在患者和健康者显著(4.4和1.1,由Mann-WhitneyU测试)。单变量分析表明,糖尿病患者的存在能显著增生性反应肌动蛋白(,图2)。
3.2。细胞因子的生产
患者PBMC样本产生干扰素-的浓度更高γ和肿瘤坏死因子-α从健康受试者(图比PBMC3)。在患者,干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α在PBMC样品中浓度高,扩散对肌动蛋白比nonproliferating(图3)。没有观察到显著差异对il - 4和il - 10(图生产3)。我们发现干扰素-之间存在正相关关系γ浓度和SI (;)(图4)。
4所示。讨论
在这项研究中,我们首次展示了肌动蛋白的角色作为目标自身抗原的细胞免疫反应在颈动脉粥样硬化患者。作为其他候选人自身抗原,观察肌动蛋白诱导促炎Th1激活,其特点是高干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α表达式。Th1反应,而不是抵消增加抗炎il - 4和il - 10生产,可能导致组织损伤,内皮功能障碍,和系统性炎症12]。进一步描述这些将建立是否监管人口能够抵消。我们的研究结果支持先前的研究表明炎症性自身免疫反应是不限于局部动脉粥样硬化病变但也可以导致系统性炎症在动脉粥样硬化患者12- - - - - -14]。炎症在动脉粥样硬化是由细胞因子调节的不同影响内皮功能障碍。不同的细胞因子促进职业——以及antiatherogenic过程,从而调节斑块发展和临床结果14,25,26]。干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α调解proatherogenic过程通过促进单核细胞活化和通过影响胶原蛋白合成和粘附分子的表达,组织因子和基质金属蛋白酶(27,28]。
我们发现actin-specific t细胞激活符合之前的研究,我们确定了肌动蛋白作为候选人自身抗原的体液免疫反应患者的颈动脉粥样硬化(22]。肌动蛋白是真核细胞球状蛋白质非常丰富。它可以聚合的ATP和其结构在进化非常保守。Anti-actin抗体已经与系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病(29日),一种疾病内皮损伤中发挥着关键作用。Anti-filamentous肌动蛋白抗体描述自身免疫性肝炎1型的绑定域名α辅肌动蛋白肌动蛋白上被证实是一个主要的肌动蛋白抗原决定基(30.]。Anti-actin抗体也发现在52 - 85%的患者自身免疫性肝炎或慢性活动性肝炎、原发性胆汁性肝硬化患者的22%,和患者的腹腔疾病和自身免疫性溶血性贫血(31日- - - - - -34]。此外,nonmuscleα辅肌动蛋白4和细胞质β肌动蛋白被鉴定为immunodominant参与卵巢自身免疫性卵巢自身抗原(35]。
在自身免疫性疾病是一个有趣且极其重要的方面了解丰富的和高度保守的自体蛋白可以成为自体免疫反应的抗原目标。自我破坏公差的机制之一可能是细胞凋亡。它已经表明,癌细胞凋亡可能使肌动蛋白免疫原性,让它的表面36,37]。此外,许多自身抗原,特别是肌动蛋白,代表proapoptotic半胱氨酸蛋白酶的底物。以这种方式产生的多肽可以释放到细胞外空间或可以作为neoantigens,从而产生自身免疫反应(38,39]。有趣的是,一些研究显示凋亡细胞的存在,特别是巨噬细胞和平滑肌细胞,在动脉粥样硬化发展的所有阶段40,41]。
在我们的研究中,我们观察到一个积极的协会之间的存在糖尿病和肌动蛋白的反应。胰腺β细胞死亡的凋亡,诱导由多个压力,很大程度上有助于2型糖尿病的发病机制42]。糖尿病的可能性,以增加氧化应激和细胞凋亡,可能会触发肌动蛋白的自身免疫反应是有趣的和需要进一步调查。
我们研究的一个限制是它没有提供一个因果联系的人类t细胞肌动蛋白和动脉粥样硬化。在活的有机体内实验模型需要解决这个问题。
5。结论
我们的研究需要研究的参与自身免疫反应在动脉粥样硬化的发病机制,领先一小步表明肌动蛋白作为候选人自身抗原的目标细胞介导免疫反应在颈动脉粥样硬化患者的比例。我们的发现在这里呼吁进一步研究肌动蛋白被特异性T淋巴细胞识别抗原表位。这些抗原表位的识别可能有用设计新颖的预防策略。