文摘

本研究的目的是审查的影响3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol联接蛋白43 (Cx43)在急性肺损伤(ALI)大鼠气管滴注法诱导的人工海水。不同剂量(50、150和450毫克/公斤)的3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol 7天之前建模的口服药物。海水吸入,4小时后的组织学变化,内容TNF -α,il - 1β在肺和il - 10的表达Cx43被检测到。此外,A549细胞缝隙连接通讯和人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)受到海水也被评估。组织学变化,增加内容,炎症因子,upregulation基因水平,在蛋白质水平和放松管制Cx43的肺刺激被海水被观察到。另一方面,预处理与3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol显著地抑制炎症的渗透,肺水肿,肺的炎症介质和内容。最重要的是,3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol调节Cx43基因和蛋白的表达水平,及其中间代谢物,白藜芦醇,也增强了缝隙连接通讯两个细胞系。本研究的结果表明,管理3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol inflammatorycellsin肺癌的治疗可能是有益的。

1。介绍

溺水是世界上第二个意外死亡原因(1]。据估计,每年有超过500000人死于溺水。基本上,有两种不同的结果溺水,溺水的当场死亡,生存从最初的呼吸暂停。然而,与下呼吸道受到水、幸存者可能遭受急性肺损伤(ALI),它的特点是发展肺部炎症和水肿2]。据报道,炎症因子分泌,肺水肿,炎症蔓延到整个肺部,甚至肺都密切相关的改变细胞之间的沟通(3]。

缝隙连接通道(GJCs),连接相邻细胞之间的细胞质、细胞膜通道,它们提供了一个途径,快速的离子交换、代谢物,和小细胞内信号分子,如Ca2 +环腺苷酸,等等。GJCs疾病病因的重要贡献是近年来深入研究[4],联接蛋白43 (Cx43)作为主要的肺泡上皮细胞之间的连接模式,参与各种急性/慢性肺部疾病的发生和发展5]。证据证明Cx43可能调节Ca2 +信号通路的方法,这将在急性肺损伤中发挥关键性的作用6]。

3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol(图1),有三个羟基被辟,是一个模拟的白藜芦醇。几项研究表明,它对反γ-射线效应通过抑制活性氧簇(ROS)的表达(7),充当PAF-induced冲兔血小板聚集抑制剂(8]。此外,我们之前的结果表明,3,5,4′-tri-O-acetylresveratrol可能引发的积累和集中白藜芦醇在肺9]。


图1
的结构3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol。

基于之前的证据,我们提出并证明了本研究的假设Cx43参与了炎症引起的海水滴注法通过影响细胞内的沟通。在3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol可以通过加强保护肺部Cx43的表达,抑制炎症反应和重建细胞间的沟通。

2。材料

2.1。动物的准备

男性Sprague-Dawley老鼠,体重180 - 220克,得到从动物中心(第四军医大学、西安、中国)。老鼠被安置在air-filtered,温控单元与12小时的明暗周期和免费的食物和水。所有实验动物保健和使用委员会批准的第四军医大学,按照美国国立卫生研究院的宣言指导护理和使用实验动物(85号出版物- 23,1985年修订)。

2.2。试剂

海水(同渗重摩1300更易与L, pH值8.2,SW 1.05,氯化钠6.518 g / L, 3.305 g / L, 2.447 g / L, 1.141 g / L,氯化钾0.725 g / L, 0.202 g / L, NaBr 0.083 g / L)是根据中国东海的主要成分由中国海洋。3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol获得药物化学与制药部门的高效液相色谱法纯度> 99%。白藜芦醇是购自西安草植物技术公司(西安,中国),纯度> 98%。路西法黄色CH双锂盐从σ化学公司购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒TNF -α和il - 1β从研发公司购买(研发系统公司,明尼阿波利斯,美国)。il - 10的酶联免疫试剂盒购自SenXiong科技工业公司(上海,中国)。Anti-connexins 43和反β肌动蛋白单克隆抗体来源于Anbo生物科技公司(常州,中国)。实时PCR相关试剂是由豆类生物科技(大连)有限公司,有限公司所有化学试剂的纯度至少在分析级。

2.3。建模和分组

SD大鼠随机分为5组( )。(一)对照组:小鼠没有任何干预。(B)海水溺水组:大鼠与戊巴比妥钠麻醉(100毫克/公斤的身体wt,管理i.p)。一个heparin-filled blunt-ended聚乙烯导管插入左侧颈动脉监测平均动脉压和获得血液样本。气管的接触,20分钟后稳定的基线期之后,然后一个注射器(1毫升)插入气管和海水(4毫升/公斤)灌输以稳定的速度在4分钟到肺部。所有的老鼠都牺牲在4 h后海水滴注法。(C)3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol(50毫克/公斤)+海水溺水组:3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol管理日常口头建模前7天。(D)3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol(150毫克/公斤)+海水溺水组:3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol管理日常口头建模前7天。(E)3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol(450毫克/公斤)+海水溺水组:3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol管理日常口头建模前7天。

剂量的3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol(50, 150,和450毫克/公斤)这里使用是基于先前的剂量效应和时间进程在我们实验室进行研究。所有的老鼠都麻醉,通过建模后主动脉横断4小时抽血。肺部都搬了出来迅速从胸腔和加工在下面描述的礼仪。

2.4。组织学

最后的实验,从每个大鼠肺组织相同的叶与10%福尔马林固定24小时,然后嵌入石蜡。deparaffinization和脱水后,肺部被切成5μ米厚的部分切片机和与苏木精和伊红染色。

2.5。肺Wet-to-Dry重量比

肺wet-to-dry比(W / D)被用来量化肺水肿的大小。肺组织,获得4 h建模后,立即称重,然后不断地干体重在70°C 72 h和重了。wet-to-dry比率是通过把计算湿干重的重量。

2.6。细胞因子的测定

水平的肿瘤坏死因子-α,il - 1β,il - 10在肺组织利用商用ELISA试剂盒测定。简而言之,肺组织均质在酷磷酸盐(肺组织PBS 1: 5)。分析是根据制造商的指示。

2.7。免疫印迹分析Cx43

肺灌注了pH值7.4 PBS删除肺循环的血细胞,然后,每组的组织样本收集和总蛋白提取。蛋白质浓度测定BCA化验设备。蛋白质样本煮,12%分开SDS-polyacrylamide凝胶,electrotransferred硝化纤维膜,阻止了5%的脱脂奶粉与渐变20 Tris-buffered盐水,一夜之间和孵化与单克隆抗体4°C Cx43(1: 200)和β肌动蛋白(1:5000)。经过反复洗涤,二级抗体(anti-rabbit免疫球蛋白过氧化物酶共轭,1:10000)孵化,和乐队被使用可视化增强化学发光(ECL)系统(Amersham法玛西亚生物技术,阿灵顿高地,,美国)。结果表示比值β肌动蛋白水平在同一蛋白质样品。

2.8。测定Cx43 mrna在肺组织

肺样本的总RNA提取试剂盒试剂(豆类)。通过光谱分析RNA浓度进行了测试。Cx43和β肌动蛋白被实时PCR检查后,制造商的指令(豆类完美真实的时间)。Cx43基因的mRNA水平正常化β肌动蛋白。基因和引物如下:Cx43、(向前)5′-GGAAATCGAACGGCTGGGCGT-3′,(反向)5′-TCGCGTGAAGGGAAGAAGCGAT-3′;β肌动蛋白(向前)5′-GCACTGTGTTGGCATAGAGGTC-3′(反向)5′-ACGGTCAGGTCATCACTATCGG-3′。放大和检测进行了利用Bio-Rad我智商检测系统(爱丁堡生物科技发展有限公司,上海,中国。

2.9。细胞培养和治疗

人类的肺上皮细胞系A549(来自写明ATCC,罗克维尔市,医学博士,美国),在1640年保持10%胎牛血清中补充。人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)是维护在火腿F12medium补充10%胎牛血清。两个细胞系与100 U /毫升的青霉素治疗和100年μ克/毫升的链霉素在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司2和95%的空气。在孵化后白藜芦醇(200的存在与否μmol / L),海水总量(0.25毫升/ 1毫升)添加到A549和HUVEC细胞和细胞被刺激的4 h。

2.10。Scrape-Loading和染料转移技术

染料转移试验被用来评估缝隙连接通讯。后A549细胞冲洗2毫升PBS媒介被撤盘子。2毫升0.075%路西法黄色CH (LY),荧光membrane-impermeable细胞标记染料溶解在PBS,被添加到细胞,和两个刮线(每好等距平行,擦伤)是由轻轻传递diamond-tipped笔(齿顶圆直径0.25毫米)跨文化。盘子被放置5分钟37°C湿润5%股份有限公司2孵化器。染料溶液被丢弃,菜肴与PBS消除背景荧光冲洗两次。之后,细胞被倒置的共焦显微镜检查(FV1000 IX81,奥林巴斯)在发射/激发波长的528/425 nm。图像被计数量化供体和受体细胞的数量和计算单元耦合指数与接受者供体细胞的比例。染料的价值转移,定义为二级受体细胞的数量被路西法可视化黄色CH,被记录的一侧刮(图8)。

2.11。统计分析

与SPSS 13.0统计分析进行了窗户。数值变量表示为±SD方法。统计上显著差异的实验条件是由单向方差分析(方差分析)其次是Dunnett测试。一个 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。的影响3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol组织病理学变化

结果表明,4个小时后海水吸入引起肺水肿,肺泡损伤,炎症细胞的浸润肺组织和肺泡(图2(b)),但预处理不同剂量的3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol可以显著改善肺损伤(数据2(c)和2(d))。


图2
肺组织的微观发现沾hematoxylin-eosin (×200)。(一)对照组;(b)海水溺水组:水肿、出血,增厚,肺泡隔和浸润的炎症细胞在肺样本观察;(c) 3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol(50毫克/公斤)组;(e) 3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol(450毫克/公斤)。肺损伤明显减轻,3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol,尤其是高剂量的3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol。
3.2。的影响3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol肺部水肿

观察肺部水肿,我们观察到肺湿/干重比(图3)。湿/干比率显著增加海水溺水组与控制( , )。然而,管理3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol显著降低了肺部水肿。


图3
的影响3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol海水愿望后肺部水肿的老鼠。数据平均±标准差, 。(一)对照组;(B)海水溺水组;(C)、(D)和(E)不同剂量的3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol组。* 相对于对照组;* 与* * 。
3.3。的影响3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol TNF -α,il - 1β,il - 10水平

我们也检查的影响3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol肿瘤坏死因子的水平α,il - 1β和肺组织中il - 10。如图4海水滴剂,四个小时后,TNF -α和il - 1β内容显著增加。预处理的3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol明显抑制这些炎症介质的表达。同时,释放il - 10的升高了3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图4
的影响3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol TNF -α(一)、il - 1β(b)和il - 10 (c)的肺部组织。(一)对照组;(B)海水溺水组;(C)、(D)和(E)不同剂量的3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol组。肿瘤坏死因子的值α,il - 1β,il - 10也增加了海水滴注法。3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol预处理下调肿瘤坏死因子的水平α和il - 1β和调节il - 10的水平。* 相对于对照组;* 与* * 。
3.4。的影响3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol Cx43表达

Cx43 mRNA表达使用实时PCR检查肺样本4 h后海水接触(图5)。结果表明,海水愿望Cx43 mRNA水平增加( ),而预处理不同剂量的3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol明显调节Cx43 mRNA水平( )。


图5
的影响3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol Cx43 mRNA的表达。Cx43 mRNA的表达水平在正常的肺为“1”,及其在其他组织表达较正常表达。(一)对照组;(B)海水溺水组;(C)、(D)和(E)不同剂量的3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol组。Cx43 mRNA的表达增加了海水,3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol预处理调节Cx43 mRNA的表达。* 相对于对照组;* 与* * ;* * 与* * * 。

然后我们进行免疫印迹研究Cx43的蛋白质水平的变化(图6)。当挑战与海水,Cx43蛋白质的活性模式相反的信使rna。即肺Cx43的蛋白质含量下降4 h后海水接触( )。


图6
的影响3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol Cx43在海水刺激肺部。(一)对照组;(B)海水溺水组;(C)、(D)和(E)不同剂量的3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol组。蛋白质定量后,免疫印迹进行调查Cx43内容4 h后海水管理。比率Cx43蛋白质和β肌动蛋白在三个独立的实验得到的密度扫描使用图像分析系统。* 相对于对照组;* 与* * ;* * 与* * * 。
3.5。白藜芦醇对染料的影响在A549和HUVEC转移

类似的细胞数量最初装满染料在所有治疗组(数字7(一)和7 (b))。然而,与对照组的比率相比,有更少的标记邻近细胞的海水组,与白藜芦醇治疗显著增加标签相邻细胞的数量。

(一)
(一)
(b)
(b)
图7
染料转移在A549细胞(a)和HUVEC幻灯片(b)。面板显示的A549细胞和地区HUVEC scrape-loaded染料((a)和(D)控制;(B)和(E)海水;(C)和(F)白藜芦醇)。绿色表示路西法黄色,包括细胞最初装满染料和受体细胞与缝隙连接的捐助者。
(一)
(一)
(b)
(b)
图8
量化G染料转移的控制,G海水,G白藜芦醇(* ),(一)A549细胞;(b) HUVEC。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们表明,(i)气管内的滴剂的海水(4毫升/公斤)诱发明显的组织学变化,肺水肿,以剂量依赖的方式和炎症;(2)海水刺激能明显抑制细胞培养细胞之间的沟通;(3)预处理与3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol可以有效缓解seawater-induced肺损伤;(iv)白藜芦醇,中间代谢物的3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol,可以重建或加强海水受损细胞之间的沟通。

尽管几种有前景的药物治疗研究了阿里和ARDS患者,这些药物治疗明显降低死亡率(10]。白藜芦醇(3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol)是一种多酚化合物是一种植物抗毒素合成了各种各样的植物。它有大量的药理特性,如抗氧化、抗炎、心脏保护,细胞周期抑制、神经保护11]。然而,白藜芦醇有一些自己的短缺。例如,它是不稳定的半衰期较短,它有一个低生物利用度(12]。虽然白藜芦醇的模拟,3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol可能在一定程度上克服这些缺点。证据表明这种模拟是有效地抑制活性氧簇(ROS)的表达式(7和PAF-induced冲兔血小板聚集8]。更重要的是,它可能导致积累和浓度的白藜芦醇在肺部。

ALI / ARDS基于起源可以分为两类:直接(或肺)阿里和间接(肺外)(13]。海水drowning-induced急性肺损伤(SWD-ALI)属于直接阿里。临床研究表明白细胞和中性粒细胞明显增加在大多数急性肺损伤(ALI) /急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者血浆与双边扩散或局部肺泡浸润在胸部x光片(14]。我们之前的结果还表明,炎症细胞的渗透15)和肺泡壁渗透性伊文思蓝(16SWD-ALI鼠模型中)明显增加,这在一定程度上解释了海水drowning-induced急性肺损伤的可能机制。

炎症反应是一系列的复杂的病理过程,包括释放细胞因子、生长因子和趋化因子,和迁移的中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞组织空间。所有上述病理过程需要协调细胞之间的沟通。证据表明,侧翼细胞刺激之间的通信由Cx43的出现和发展奠定了基础,在肺组织炎症17]。在目前的研究中,我们发现海水接触导致upregulation Cx43的基因水平,放松管制Cx43蛋白和分泌炎症因子,如肿瘤坏死因子-α和il - 1β,而预处理3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol减少炎症因子的内容。此外,il - 10,作为一个著名的抑制炎症因子,增加了3,5、4′-tri-O-acetylresveratrol。更重要的是,3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol显著调节Cx43表达的基因和蛋白质水平,及其中间代谢物的重建贡献在A549和HUVEC细胞沟通。

肺水肿是急性肺损伤的另一个关键问题,结果从呼吸膜屏障(BBB)功能障碍,毛细血管通透性增加(18,19]。在肺泡空间液体积累丰富的蛋白质可能会增加ALI / ARDS的死亡率。证明了,在一声枪响肺损伤兔模型中,移动通信中扮演了一个重要的角色在毛细血管通透性增加和液体泄漏到肺泡空间20.]。此外,发现抑制Cx43 mRNA和蛋白表达导致单个细胞渗透性的增加(21]。在目前的研究中,我们发现海水吸入导致肺部水肿和海水刺激也抑制HUVEC细胞通讯。然而,3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol可以缓解肺部水肿老鼠遭受海水滴剂,及其代谢中间体,白藜芦醇,恢复细胞沟通受制于海水接触。

联接蛋白43 (Cx43)起着关键作用的调节炎症和微血管通透性,增加在基因水平是在蛋白质水平上抑制海水刺激。这可能意味着,海水刺激将增强转录,但抑制Cx43的翻译。我们观察到的促进作用3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol Cx43 SWD-ALI和两种细胞刺激被海水。我们的研究结果表明,3、5、4′-tri-O-acetylresveratrol减轻海水滴剂诱导炎症和肺水肿Cx43的可能通过激活。

作者的贡献

l . Ma和李y作者同样导致了纸。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由2012国科金表面支持项目:低氧诱导因子1的机制α(HIF-1α)在海水中drowning-induced急性肺损伤(SWD-ALI)项目(81270124)。除此之外,本文的版权无关与上述公司提供的实验材料。