绿蟾鱼的毒性及分子鉴定Lagocephalus lunaris日本九州海岸

摘要

绿蟾蜍鱼Lagocephalus lunaris栖息于热带和亚热带海域，肌肉、肝脏和性腺中含有高水平的河豚毒素（TTX）。2008年至2009年，因摄入河豚毒素而导致食物中毒l . lunais发生在日本西部。摘要对在日本九州海岸捕获的5个绿蟾鱼标本进行了毒性、毒素和种类鉴定。经生物测定，5个标本均有毒性。组织毒性最大，卵巢毒素含量最高(1810鼠单位[MU]/g)，其次为肝脏(341鼠单位[MU]/g)、肌肉(135鼠单位[MU]/g)、皮肤(79鼠单位[MU]/g)和肠道(72鼠单位[MU]/g)。液相色谱/质谱分析显示TTX为主要毒素。肌肉线粒体DNA 16S rRNA基因片段的核苷酸序列分析表明，4个样本的PCR产物部分序列与该样本相同月牙菜。其中一个样本的序列与褐背蟾蜍鱼的序列难以区分Lagocephalus wheeleri，无毒品种。

1.介绍

食入有毒绿蟾蜍鱼引致食物中毒事件Lagocephalus lunaris2008年至2009年在日本西部连续发生。如表所示1.，共有5起事件，包括11名受害者，没有死亡记录。患者表现出类似河豚毒素(TTX)中毒的症状，如瘫痪、恶心、呕吐和共济失调。众所周知，四齿鲀科河豚在肝脏和卵巢中有较高的TTX水平。在日本海岸有多达50种的四齿鲨科。其中有绿色的蟾蜍鱼月牙菜是一个臭名昭著的物种，因为它甚至在肌肉中都含有高水平的毒素，并导致严重的食物中毒[1.–3.］.第一例报道发生在1959年，当时有五个人吃了几片炸绿蟾鱼肉月牙菜在越南海被捕，并出现TTX中毒的典型征状和症状[4.,5.］.

绿蟾蜍鱼月牙菜通常分布于热带及亚热带海域，包括东海、南海及印度洋，但很少出现在日本近海及温带水域[6.–12].因此，很少受到重视月牙菜然而，值得注意的是，2008年和2009年的河豚鱼中毒事件是由月牙菜在日本海岸被捕获，病人误认为是棕背蟾蜍鱼Lagocephalus wheeleri。很难区分有毒物种月牙菜来自无毒的物种l . wheeleri这是日本允许食用的，因为这两个物种的外部形态非常相似[13常常被抓在一起[12］.在这项研究中，我们分析了毒性和毒素月牙菜从日本九州海岸采集，从食品卫生角度出发，采用PCR扩增方法对河豚进行鉴定。

2.材料和方法

2.1.材料

2001年3月，2008年11月和2009年2月，在日本九州海岸的长鳍鱼捕获了河豚鱼标本。它们被立即冷冻，运到东京海洋科学技术大学的实验室，储存在−使用前温度为20℃。将刺延伸至背鳍底部的河豚鱼被认定为绿蟾蜍鱼月牙菜根据形态学鉴定[13].一个典型的月牙菜如图所示1.。

2．2．毒性的测定

在部分解冻后，每个标本被切割成5个组织，如肌肉、皮肤、肝脏、肠和性腺(卵巢或睾丸)。组织样本在研钵中用杵磨碎，并用0.1%的醋酸均质。TTX根据日本食品卫生协会的官方指南在沸水浴中加热10分钟提取[14］.采用生物测定法测定每个样品的毒性，使用4周龄雄性ddY品系小鼠，体重为20 g，参照上述官方指南[14］.小鼠生物测定中的毒性用小鼠单位(MU)表示，其中一个MU定义为腹腔注射后30分钟内杀死小鼠的毒素量。所有的动物实验都是按照教育、文化、体育部管辖的学术研究机构适当进行动物实验和相关活动的基本准则进行的，并经东京海洋科技大学动物实验委员会批准。

2．3.毒素的分析

从样本中提取的组织的等量。2表2.通过Vivaspin 500 (MWCO 5000, VivaScience AG，汉诺威，德国)超滤。所得滤液经液相色谱/电子喷雾电离-质谱(LC/ESI-MS)分析其毒素谱[15］.简单地说，LC/ESI-MS在联盟Zspray MS 4000 LC/ESI-MS系统(Waters, Milford, Mass, USA)上进行。分析柱为develsil C30-UG-5 (1.5 × 250 mm, Nomura chemical, Seto, Japan)，色谱条件为25℃。流动相为20 mM七氟丁酸，10 mM含1%乙腈的甲酸铵(pH 4.0)洗脱，流速为0.10 mL/min。将洗脱液诱导到ESI-MS检测器的离子源块中，采用脱溶温度为350℃、离子源块温度为100℃、锥电压为45 kV的正离子模式电离。

２.４.线粒体16S rRNA基因片段的DNA提取及PCR扩增

使用DNeasy Blood & Tissue试剂盒(Quiagen K.K.， Tokyo, Japan)按制造商说明从每个样本的肌肉中提取细胞总DNA。简而言之，将25 mg等量的普通肌肉与180μL缓冲ATL和40μL蛋白酶K溶液，在55℃下培养1小时 h、 并在20000时离心 ×g，15分钟 所得上清液用4 μL RNase A (100 mg/mL)孵育2 min，再加入200μL缓冲液AL在70°C孵育10分钟，然后加入200μL乙醇。用DNeasy Mini Spin柱纯化DNA。准备工作按柱进行，每柱500洗一次μL缓冲剂AW1和缓冲剂AW2，依次洗脱200 μL AE缓冲区。

利用通用引物(16SarL, 5 ' -CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3 '和16SbrH, 5 ' -CCGGTCGAAACTCAGATCACGT-3 ')进行常规PCR扩增线粒体16S rRNA基因的部分区域(约615 bp) [16].对50例患者进行PCR检测 μL反应缓冲液含4μL 2.5 毫米dNTPs，1.5 μL 20μ每个引物的M, 0.4μDNA聚合酶，5μL 5 × EXBuffer和5μL提取模板DNA (1μg).采用热循环仪PC-801 (Astec，福冈，日本)进行PCR。放大条件为变性98°C 30 s，退火53°C 30 s，延伸70°C 60 s 30个循环。PCR产物在含有SYBR安全DNA凝胶染色剂(Invitrogen公司，Carlsbad，加州，美国)的2%琼脂糖凝胶中进行电泳分析，并使用荧光图像分析仪(las4000 mini, fujifilco公司，东京，日本)进行观察。

2.5. DNA测序

扩增后，以PCR产物为模板直接测序。采用ABI PRISM 3130基因分析仪(Applied Biosystems, Foster, california, USA)对DNA进行测序。为鉴定河豚种类，在日本日立公司的DNASIS Taxon V3.0 for Fugu (Hitachi Solutions Ltd, Tokyo, Japan)和东京海洋科技大学实验室河豚线粒体序列原始数据库中检索序列。

3.结果与讨论

绿色蟾蜍鱼的毒性如表所示2.。通过生物测定，所有5个个体都表现出毒性，尽管个体毒性存在显著差异。各器官毒性最大，卵巢最高，为1810 MU/g，其次为肝脏(341 MU/g)、肌肉(135 MU/g)、皮肤(79 MU/g)和肠道(72 MU/g)。根据TTX对人体的估计最低致死剂量(10,000 MU)，将河豚的毒性分为四个级别;极强毒(大于1000 MU/g)、强毒(100-999 MU/g)、弱毒(10 - 99 MU/g)、无毒(小于10 MU/g)。因此，卵巢的毒性水平被认为是极强毒性，肌肉和肝脏是强毒性，皮肤和肠道是弱毒性。值得注意的是，5个肌肉样本中2个(2号和4号)的强毒水平超过100 MU/g，而东海(261 MU/g)、台湾(140 MU/g)和泰国(243 MU/g)的强毒水平超过100 MU/g [8.,10,11]这些结果表明，在九州海岸获得的绿蟾蜍鱼也具有足够的毒性，通过摄入肌肉导致河豚鱼中毒，并且对人类以及热带和亚热带水域的食用有害。另一个问题是有毒的绿蟾蜍鱼是否意外迁移到日本沿海地区全年都在它们身上盘旋或栖息。

图形2.用LC/ESI-MS对样品号的肌肉提取物进行分析。2.质谱图在m/z 320扫描TTX (C₁₁H₁₇O_8.N_3., 319.27 Da），m/z 304，用于除氧剂Tx（C₁₁H₁₇O_7.N_3.， 303.27 Da)， m/z 302为anhydroTTX (C₁₁H₁₅O_7.N_3., 301.26 Da）和m/z 290表示NORTX（C₁₀H₁₅O_7.N_3., 289.25 Da)。在选定的m/z 320离子质谱图中，在保留时间为7.98 min时的峰与TTX标准品在保留时间为8.01 min时的峰一致(图3)2.顶部)。在m/z 304和m/z 302保留时间分别为9.72 min和9.90 min的峰分别为脱氧ttx和无水ttx;，但由于缺乏TTX类似物的标准，未能详细鉴别。总离子电流质谱显示TTX是肌肉提取物的主要毒性原理(图)2.底部)。样品肝提取物。2显示与肌肉提取物相同的毒素分布(数据未显示)。LC-ESI/MS测定的样品提取物的毒素量与生物测定的毒性评分密切相关。Brillantes等人检测到TTX以及4-epi-TTX和4,9- anhydrottx在肌肉和肝脏提取物中月牙菜在泰国进行的高效液相色谱分析[11]此外，Ngy等人确定，在柬埔寨，TTX为主要毒素，无水TTX为次要毒素月牙菜质(LC /12］.此外，他们报告没有检测到麻痹性贝类毒素月牙菜标本来自泰国和柬埔寨。很可能是绿色的蟾蜍鱼月牙菜优选地累积TTX及其类似物。

根据Ishizaki等人的方法，采用直接DNA测序分析方法对河豚标本进行物种鉴定[17]。从用于毒性试验的绿蟾蜍鱼样本的肌肉中分离总DNA，并使用16SarL和16SbrH引物进行线粒体16S rRNA基因特异性PCR。图3.显示样本中扩增的部分16S rRNA区域的DNA序列，以及绿蟾鱼的真实DNA序列月牙菜和布朗支持蟾鱼l . wheeleri月牙菜和l . wheeleri长度为612 英国石油公司和611 后者在基因序列第279位删除了一个核苷酸月牙菜序列中有30个核苷酸序列的替换月牙菜。

4份样品(编号2-5)PCR产物的部分序列与样品的部分序列一致月牙菜. 然而，除卵巢外没有毒性的1号样品的顺序与对照组不一致月牙菜,但l . wheeleri，无毒品种，并注明样品编号。1在分子鉴定中不被认为是绿色蟾鱼，尽管其背部的刺有广泛的延伸。有可能样品编号。1可能是l . wheeleri还有其他的，因为河豚属的自然杂交鱼类经常被发现[18,19]。需要进一步研究，通过微卫星DNA分析和形态学特征详细鉴定该物种。

摘要台湾发生鱼乾及掺假鱼乾鱼子食物中毒事件。黄教授和他的同事们将致病鱼鉴定为月牙菜利用细胞色素中376核苷酸区序列进行核苷酸序列分析和pcr -限制性片段长度多态性分析B线粒体DNA的基因[1.,3.］.在本研究中，我们分析了一段线粒体DNA的16S rRNA基因片段，证实16S rRNA标记在河豚物种鉴定中是有用的和适用的。

致谢

作者感谢日本宫崎县的Kawaminami-tyo渔业合作协会提供河豚标本。这项研究部分得到了日本厚生劳动省的资助。

参考文献

1. 黄德福、谢永华、萧耀忠、陈世国、郑振安，“食物中毒相关的干鱼片中河豚毒素和鱼类物种的鉴定，”食品保护杂志，第65卷，第2期，第389-3922002页。视图:谷歌学者
2. C.-K。如何,学术界。陈省身,研究。黄,L.-M。王,学术界。李:“河豚毒素中毒。”美国急诊医学杂志第21卷第2期1，第51-54页，2003。视图:出版商网站|谷歌学者
3. 谢永文，黄佩安，潘宏辉，陈建斌，黄德发，“与食物中毒有关的假干鲻鱼子中河豚毒素和鱼类种类的鉴定”，食品科学杂志，第68卷，第1期，第142-146页，2003年。视图:谷歌学者
4. T.川端康成，“河豚中毒——特别强调小仓市因食用冷冻河豚而发生的中毒事件，”食品卫生研究，第10卷，第5期。1，页71-80,1960。视图:谷歌学者
5. T. Noguchi和J. S. Ebesu，《河豚中毒:流行病学和治疗》，毒理学杂志》，第20卷，第2期。1，页1 - 10,2001。视图:出版商网站|谷歌学者
6. 从台湾进口“河豚”的分类及毒理学检验日本食品卫生学会杂志，第20卷，第2期。6，第437-441页，1979。视图:谷歌学者
7. T. Kawabata, A. Toda, K. Matsumoto, T. Harada，“从进口调味干鱼产品中检测河豚毒素”，食品卫生研究第31卷第1期10，第827-837页，1981。视图:谷歌学者
8. K. Shiomi, H. Inaoka, H. Yamanaka和T. Kikuchi，“在两种河豚鱼中检测到类似河豚毒素的化合物(Lagocephalus lunaris lunaris和河豚niphobles),“Toxicon，第23卷，第2期。2，第331-336页，1985。视图:谷歌学者
9. 黄德福、野口哲、荒川、安倍晋三、桥本，「台湾几种河豚的毒理学研究，」日本水山盖世酒店第54卷第5期第11页，2001-2008,1988。视图:谷歌学者
10. D.-F。黄,彭译葶。花王,H.-C。杨,s。Jeng, T. Noguchi, K. Hashimoto，《台湾河豚的毒性》日本水山盖世酒店，第58卷，第4期，第1541-1547页，1992年。视图:谷歌学者
11. S. Brillantes, W. Samosorn, S. Faknoi和Y. Oshima，《在泰国着陆和销售的河豚的毒性》，渔业科学，第69卷，第6期，第1224-1230页，2003年。视图:出版商网站|谷歌学者
12. L. Ngy, S. Taniyama, K. Shibano, C. f Yu, T. Takatani, O. Arakawa，“柬埔寨西哈努克村沿海水域河豚毒素的分布”，日本食品卫生学会杂志，第49卷，第5期，第361-365页，2008年。视图:出版商网站|谷歌学者
13. 河豚中毒和毒性Lagocephalus lunaris”,食品卫生研究，第32卷，第11期，第1049-1066页，1982年。视图:谷歌学者
14. M. Kodama和S. Sato，食品安全法规的标准分析方法，化学，日本卫生部劳动和福利署，日本食品卫生协会，东京，日本，2005年。
15. T. Matsumoto, Y. Nagashima, H. Kusuhara, S. Ishizaki, K. Shimakura, K. Shiomi，“河豚体内河豚毒素的药代动力学红毛羚羊通过单一给药技术，”Toxicon第51卷第1期6，第1051-1059页，2008。视图:出版商网站|谷歌学者
16. S. Palumbi, A. Martin, S. Romano, W. O. MacMillan, L.斯蒂斯和G. Grabowski，PCR的简单傻瓜指南，2.0版2002年，美国夏威夷火奴鲁鲁，夏威夷大学科瓦罗海洋实验室动物学系。
17. S. Ishizaki, Y.横山，N. Oshiro等，“利用PCR扩增和16S rRNA片段的限制性分析对河豚物种的分子鉴定”，比较生物化学与生理学D部分， vol. 1, no. 11，页139-144,2006。视图:谷歌学者
18. Y.Masuda、N.Shinohara、Y.Takahashi、O.Tabeta和K.Matsuura，“河豚鱼之间自然杂交的发生，黄鳍豚和t . vermucularis，位于日本九州阿里亚克湾，“日本水山盖世酒店(第57卷)7，页1247-1255,1991。视图:谷歌学者
19. 《河豚属六种鱼类的核型研究》东方鲀属(Tetraodontidae鲀形目)。”渔业科学第61卷第1期4，第594-598页，1995。视图:谷歌学者

版权

版权所有©2011 Yuji Nagashima等人。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。