文摘

本研究关注对识别的应用纳米颗粒(NPs)传感器基于反向传播(BP)神经网络优化的遗传算法(GA)的早期诊断癌细胞。在这项研究中,传统的比较和优化BP神经网络的预测值和实际值之间的误差,并进一步应用于NP传感器癌细胞的早期诊断。结果表明,均方根(RMS)和平均绝对误差(MAE)优化的BP神经网络比传统的相对小得多。silicon-coated荧光NPs的粒子大小约为105纳米,和silicon-coated荧光NPs的相对荧光强度略有降低,保持精度值在80%以上。荧光成像技术,发现表面有明显的绿色荧光的癌细胞,癌细胞还在暗场条件下发出明亮的绿色荧光。在这项研究中,一种酚醛树脂聚合物和大表面积CMK-2成功结合盟。NPs拥有良好的介电性质和bioaffinity选择性连着修改后的电极通过sulfur-gold债券准备NP传感器。传感器显示出稳定性好、选择性和抗干扰特性,提供一个早期癌细胞的检测的新方法。

1。介绍

在过去的几年里,人们越来越高的要求,微观检测技术已导致一个进化,在各种纳米材料在生物领域的应用。NPs指粒子粒径1 and100纳米之间,它是一种新的材料在分子水平上的研究,细胞水平、亚细胞水平(1]。NP-based纳米技术可以应用于肿瘤的诊断和治疗2]。

荧光团可以添加到NPs通过共价键或嵌入形成荧光NPs (3),用作检测荧光染料或标签。与普通荧光染料相比,荧光NPs亮度高,稳定性好,水溶性强,和良好的生物相容性4]。癌细胞成像技术在肿瘤的诊断具有重要意义。作为载体材料,荧光NPs可以提高生物信号便于检测(5]。透明质酸(HA)具有良好的应用前景在肿瘤疾病的诊断和治疗6]。nanodrug-carrying系统由NPs和HA相结合可以具体结合细胞表面上的受体蛋白检测癌细胞。沈et al。7)准备diamine-hyaluronic acid-iron-modified罗丹明荧光NPs癌症成像检测。结果证明,荧光NPs高灵敏度和稳定性。

传感器各领域发挥重要作用和化学传感器通常用于检测化学物质。电化学生物传感器利用生物活性物质作为敏感的元素。它转换成电化学信号输出等潜在的特征信号,电流,电容(8]。电化学生物传感器的原理如下。当生物活性物质的扩散具有生物灵敏度的层,相关化学反应发生。然后生物信号转换成电信号,可以定量分析。最后,可以确定活性物质的浓度处理的电信号9]。纳米材料在电化学传感器有许多功能。他们可以修改电极,加速电子转移的速率,促进催化反应,将生物分子固定住。他们可以进一步被用作标记,运营商控制开关的化学反应,以及反应物(10]。NPs在电化学生物传感器的引入可以有效地改善其灵敏度和重现性。

遗传算法(GA)是一种概率自适应迭代算法,可以处理不连续函数通过全球搜索(11),因为它发现全局最优的解决方案,不影响梯度信息。它可以用来优化BP网络(12]。当基于遗传算法优化的BP神经网络应用于NP传感器,它赋予纳米传感器与理想稳定通过调整权重和阈值13]。

在过去研究中描述这一节中,这是显示单独的神经网络方法不能提供令人满意的结果,寻找最佳的全球解决方案的诊断癌症细胞,这是一个伟大的研究挑战。在这项研究中,使用遗传算法优化BP神经网络。应用荧光NPs在电化学传感器,阐述了他们的基本特征。我——的修饰电极βcy /非盟NPs CMK-2 / GCE介绍了生物传感器应用于癌细胞的早期诊断,旨在探索荧光NP传感器对癌症细胞的诊断价值。

2。实验方法

2.1。我-βcy /非盟NPs / CMK-2 / GCE电极
2.1.1。制备CMK-2

(1)制备的酚醛树脂预聚物。3.25 g的酚溶解在0.5 g 20 wt %的氢氧化钠溶液。15分钟后,均匀混合物慢慢滴入5.5 g 37 wt %甲醛溶液,与温度调整到75°C,其次是回流1小时。后混合物冷却至25°C, 0.4 mol / L盐酸是用来调整 ,其次是蒸发处理。混合是然后用绝对乙醇稀释。氯化钠的白色粒子后被过滤,剩下的淡黄色的解决方案是酚醛树脂预聚物。

(2)制备CMK-2。1.5 g的聚醚F127添加到上面的解决方案准备,与温度调整到45°C,紧随其后的是搅拌30分钟形成淡黄色透明的解决方案。然后转移到培养皿中混合物在45°C和干8个小时除去乙醇。温度再次调整到100°C为24小时热聚合形成透明薄膜,粉和发射在350°C 5小时氮条件下最终获得深棕色粉末。粉末分散在98%浓硫酸溶液,其次是回流24小时。模板聚醚F127移除后,CMK-2终于获得,如图1。


图1
CMK-2的准备。
2.1.2。制备修饰电极

玻碳电极(GCE)与0.2抛光μm和0.05μ米氧化铝湿粉,分别,然后进行超声波清洗绝对乙醇和超纯水,分别。控制体积(CV)方法用于扫描激活在5 L更易与硫酸溶液(14),与潜在的控制在-0.5 - -1.6 V,扫描速率设置为100 mV / s。然后用超纯水清洗电极和在室温下干燥。

1.8毫克CMK-2粉准备以上溶于1毫升的二甲基甲酰胺(DMF),紧随其后的是超声治疗1 h形成均匀分散的黑色悬挂。随后,2.5μL悬架应用于裸露的全球教育运动,在室温下干燥,并记录CMK-2 / GCE电极[15]。上面的电极放置在0.6 L更易与氯金酸(HAuCl4)(美国Sigma-Aldrich)电解沉积金(Au NPs)、解决方案与潜在控制在-0.5 - -1.6 V。简历的方法用于扫描的10倍,与扫描速度设置为50 mV / s,其次是用超纯水清洗步骤。然后在室温下干燥和记录为盟NPs / CMK-2 / GCE。上述电极浸在磷酸缓冲溶液包含1更易与L -我βcy(滨州志远生物技术,中国)装配12 h,紧随其后的是用超纯水洗净。然后在室温下干燥(16),像我,表示βcy /非盟NPs / CMK-2 / GCE,如图2。


图2
我的准备βcy /非盟NPs / CMK-2 / GCE。
2.2。BP神经网络提高了遗传算法

BP神经网络是一种前馈神经网络(17]。通常是由一个输入层、隐藏层和输出层(图3)。BP神经网络具有良好的自学习和自适应能力和强大的容错18]。


图3
BP神经网络。

在这项研究中,使用遗传算法优化BP神经网络的初始权重阈值,与一般的初始体重搜索全球所取代,所以神经网络的BP算法可以准确地调试解决方案空间,和搜索全局最优解19]。优化包括种群初始化、适应度函数选择、选择操作、交叉操作、变异操作(20.),如图4。


图4
通过遗传算法优化的BP神经网络。

BP神经网络的训练后,残差绝对值之和预测输出与期望输出之间设置为适应度函数 。 在哪里 代表了系数,它是1。 代表输出节点的值, 代表的期望输出值 点, 代表的预测输出值 点。每个个体的概率表达如下: 在哪里 代表了适应度函数 代表个体的概率 。在这项研究中,应用实数交叉方法和交叉操作方程 染色体 和 染色体 在点 如下: 在哪里 是在 。如果 基因的 个人选择变异处理,操作方程如下: 在哪里 是最大的 , 是最小的, 是迭代的数量, 的最大数量的演进, 和 内 。

最好的优化使用GA方法获得的重量值,和重量和阈值进行优化。它进一步之后,剩余的绝对值计算,然后,网络权重进一步修改。然后检查精度要求,和整个优化BP神经网络的过程就终止了。

2.3。荧光NPs修改哈
2.3.1。Silicon-Coated荧光NPs

1.5毫克的异硫氰酸荧光素(FITC)(美国Sigma-Aldrich)溶解在15毫升的重蒸馏的绝对乙醇,紧随其后的是超声治疗。解决方案是那么滴入无水乙醇蒸馏处理,其次是磁搅拌24小时。随后,混合是离心机和无水乙醇清洗n-hexanol上层清液交替,直到没有荧光。然后在真空干燥和储存在黑暗21]。7.5毫升的环己烷,2.5毫升n-hexanol,和1.88毫升的Triton x - 100混合均匀,紧随其后的是磁力搅拌,直到它是清楚的。随后,250μ添加L的超纯水,紧随其后的是搅拌15分钟,形成一个相对稳定的微乳液体系(22]。

图5显示了FITC-APTES的制备过程。0.25毫克的FITC和apt(美国Sigma-Aldrich)溶解在0.6毫升环己烷的混合物和0.6毫升n-hexanol,紧随其后的是超声治疗完全溶解它们。然后混合物滴入上面的微乳液体系做好准备。搅拌30分钟后,成核发生。125年μL原硅酸乙酯的混合物和3-aminopropyltriethoxysilane添加23),加上50μL氨水。磁搅拌后24 h,几滴丙酮被添加到反乳化。随后,绝对乙醇洗交替的示例和超纯水24]。最后,H2N-SiO2/ FITC-APTES-NPs获取并存储在冰箱在4°C,供以后使用。


图5
FITC-APTES的准备。
2.3.2。HA共价修饰

2.5毫克钠公顷(NaA)溶解在20毫升超纯水的超声波治疗,有0.02毫克的碳化二亚胺(EDC)和N-hydroxysuccinimide (NHS) (Ballingweier试剂公司,中国)补充道,分别,紧随其后的是磁搅拌2 h激活羧基在哈25]。6毫升以上的荧光NPs准备然后补充说,其次是搅拌下24小时的黑暗。超纯水用于多个洗涤。未反应的HA和其他小分子杂质通过离心去除(26]。最后,HA共价改性silicon-coated荧光NPs获得和储存在4°C,供以后使用。

2.3.3。Silicon-Coated荧光NPs的表征和决心

HN-SiO的电子显微镜图像2/ FITC-APTES-NPs测量使用JEOL - 2100电子显微镜(JEOL公司、日本)。那些时光阿凡达的那些时光阿凡达一个Nicolet 370壳体红外光谱仪(Nicolet,美国)用于获取一个红外光谱。荧光光谱测量与日立f - 4600荧光分光光度计(日立、日本)的乐器。LSM 5帕斯卡激光模块激光扫描共焦显微镜(德国卡尔蔡司)是用来描述细胞培养的结果。Bio-Rad模型680分光光度计(Bio-Rad公司,美国)是用来测试MTT结果。

2.4。培养和癌症细胞的存活率
2.4.1。培养的癌细胞

人类宫颈癌海拉细胞在含12%胎牛血清的DMEM培养,青霉素,链霉素37°C (27]。海拉细胞在增殖阶段是胰蛋白酶化处理和播种(104-10年5细胞/)。60 mg / L H2N-SiO2/ FITC-APTES-NPs被添加到孵化细胞4 h。上层清液被删除后,样品冲洗磷酸盐缓冲剂和可视化使用LSM 5帕斯卡激光扫描显微镜激光模块。

2.4.2。存活率检测

H2N-SiO2/ FITC-APTES-NPs稀释使用磷酸缓冲配置解决方案50,100,150,200,250,和300毫克/毫升。海拉细胞被播种在104-10年5细胞/在一个96孔板,和上述不同浓度的磷酸缓冲然后转移到96孔板,其次是孵化一夜之间在37°C (28]。中被移除后,10μL(1毫克/毫升MTT(美国Sigma-Aldrich)解决方案添加到每个文化4个小时的细胞,与上层的移除。100年μL十二烷基硫酸钠(SDS)被添加到每个文化细胞15分钟,以便MTT完全与细胞反应。Bio-Rad模型680标仪是用来测量吸光度在580海里。

2.5。统计数据

在这项研究中,数据被SPSS19.0加工,所有的实验数据都表示为 ( )。均方根(RMS)应用于分析预测之间的偏差值和期望值平均绝对误差(MAE)的评价。的 - - - - - -测试是用于对比组。 是阈值的意义。

3所示。实验结果

3.1。遗传算法优化BP神经网络
3.1.1。位移测量

在位移测量的实验,控制室的温度是恒定的。最后探针和赛璐玢使用酒精擦拭表面,防止灰尘和污渍影响测量结果。探测和目标物质之间的角为90°。在测量之前,激光预热。调查符合铝工件表面紧密,运动的距离是每次都控制在0.05毫米。上层位置机是用于读取通道CH1和CH2的价值,并且绘制一条曲线来显示位移和接收功率之间的关系(图6)。


图6
位移和接收功率之间的关系。
3.1.2。比较分析优化GA-BP和传统BP方法的准确性和错误值

在BP神经网络的参数,2意味着输入和1意味着输出。7隐层节点集,和目标误差是0.0001。培训的数量是1500,Trainingfu训练函数。GA人口大小设置为100,交叉概率为0.2,变异概率为0.05。设置的参数后,功率值和位移值作为神经网络的输入和输出重复训练,分别。与此同时,相关的网络参数的调整,使培训结果达到预期值。测试数据、电位移阶段移动0.1毫米/步骤。功率计是用于获得预测输出值和BP神经网络的预测输出值由GA优化。

此外,评估和优化GA-BP-based传统方法的准确率,测试位移的精度参数评估。

从图的图形表示7,描述精度值增加一个小传统和优化的测试位移变化情况。然而,应该注意的是,的精度值优化GA-BP神经网络更好的比传统的BP神经网络方法。GA-BP方法获得的最终精度值是94.54%比86.78%的最终精度值获得传统的BP神经网络方法。


图7
传统和GA-BP优化神经网络的精度值。

比较的传统BP神经网络和遗传算法优化的BP神经网络,介绍了RMS和梅误差值。发现RMS和优化BP神经网络的美更小,如图8。


图8
比较传统的和优化的BP神经网络。

图8描述了错误值对测试位移(mm)正常的BP预测价值和真正的价值。它还描述了错误率GA-BP预测值和真实值之间的对应的位移测试。可以看出,误差值最小化接近0的情况下GA-BP-based方法是最小化不多而单独使用BP预测。同时,它可以指出错误值的变化最小化,而利用遗传优化BP神经网络的方法,比传统BP神经网络方法。

3.2。Silicon-Coated荧光NPs的表征
3.2.1之上。形态和粒径

很明显从图9(一个)silicon-coated荧光NPs具有良好的形态,好分散,和相对均匀的粒度,球体的形状。很明显从图9 (b)NPs的粒径约105海里。

(一)
(一)
(b)
(b)
图9
silicon-coated荧光NPs的形态和粒径。电子显微图注:(a)和(b)粒度分布。
3.2.2。的红外光谱

获得红外光谱测量的FITC, FITC-APTES前兆,H2N-SiO2/ FITC-APTES-NPs, HA-SiO2/ FITC-APTES-NPs。很明显形成图10 ()FITC的特征峰isothiocyano组的2186厘米1在FITC-APTES前体并不拥有特征峰。进一步表明FITC和apt之间发生偶联反应时,isothiocyano组结合胍组FITC-APTES前体是成功的准备。

(一)
(一)
(b)
(b)
图10
红外光谱的修饰电极。注意:(a)红外光谱FITC FITC-APTES前兆和(b)红外光谱的H2N-SiO2/ FITC-APTES-NPs和HA-SiO2/ FITC-APTES-NPs。

很明显从图10 (b)H2N-SiO2/ FITC-APTES-NPs氨基的特征峰出现在3433厘米1。硅在1100厘米的特征峰1表明,NPs包含氨基酸组做好准备。的HA-SiO2的伸缩振动峰/ FITC-APTES-NPs NH 3058厘米1。的伸缩振动峰CH在2990厘米1和羧基团体的特征峰在1711厘米1和1736厘米1。这些山峰都是由集团的伸缩振动引起的,表明HA成功结合的表面荧光NPs通过酰胺键。

3.2.3。荧光性质

很明显从图(11日)后FITC FITC-APTES前体与恰当的反应形式,整体的荧光强度降低。尽管H的荧光强度2N-SiO2/ FITC-APTES-NPs和HA-SiO2/ FITC-APTES-NPs略有降低,峰值仍相对较高。这表明H2N-SiO2/ FITC-APTES-NPs和HA-SiO2/ FITC-APTES-NPs有相对良好的荧光性能。HA-SiO的荧光共焦显微镜图像2/ FITC-APTES-NPs表明荧光NPs均匀分布(图11 (b))。

(一)
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(b)
(b)
图11
silicon-coated荧光NPs的荧光性能。注意:(a) FITC的荧光光谱,FITC-APTES, H2N-SiO2/ FITC-APTES-NPs, HA-SiO2/ FITC-APTES-NPs和(b)荧光共焦显微镜HA-SiO的形象2/ FITC-APTES-NPs。
3.2.4。的化学稳定性

FITC-APTES的形成是否会引起荧光染料的泄漏是探索。的HA-SiO2/ FITC-APTES-NPs沉浸在超纯水80 h和与HA-SiO相比2/ FITC-NPs荧光强度。发现HA-SiO的荧光强度2/ FITC-NPs明显下降前10小时,表明染料渗漏严重。10个小时后曲线逐渐稳定。HA-SiO的荧光强度2/ FITC-APTES-NPs慢慢减少。HA-SiO的相对荧光强度2在每个时间段/ FITC-APTES-NPs高于HA-SiO2(图/ FITC-NPs保持超过80%12)。这表明HA-SiO2/ FITC-APTES-NPs具有良好的荧光稳定性。


图12
染料渗漏的结果。
3.2.5。肿瘤细胞检测海拉

在肿瘤疾病的诊断,特定的标记往往作为辅助手段。哈能具体地认识到独特哈粘附因子的蛋白质受体肿瘤细胞表面结合肿瘤细胞的表面。在这项研究中,HA-modified荧光NPs是使用激光共焦显微镜(图可视化13)。左边是一个亮场光学图像,右边是一个暗视野荧光图像。两个对应的细胞。在荧光亮场图像,表面有明显的绿色荧光癌细胞,这表明HA-modified荧光NPs癌细胞的表面(图覆盖(13日))。在暗场图像,细胞发出明亮的绿色荧光(图13 (b))。因此,HA-modified荧光NPs是癌细胞的早期诊断的新方法。

(一)
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(b)
(b)
图13
HA-SiO的荧光成像技术2/ FITC-APTES-NPs。注意:(a)荧光成像和(b)具有亮暗场荧光成像。
3.2.6。细胞存活率

在这项研究中,采用MTT法来确定细胞的存活率。活细胞在肝癌治疗后,mitochondrial-specific脱氢酶在细胞中会导致肝癌形成不溶于水的蓝紫色水晶甲瓒,不会形成的死细胞。测量不同浓度的吸光度HA-modified荧光NPs在580 nm,细胞在DMEM培养设置为空白组,并与荧光细胞培养NPs被设置为对照组。较低的生存率显示更大的毒性HA-modified荧光NPs癌细胞。结果发现,随着浓度的增加,肿瘤细胞的存活率逐渐减少(图14)。保持良好的荧光强度和细胞存活率,50毫克/毫升荧光NPs被选为细胞培养实验。


图14
细胞存活率之间的关系和HA-SiO的浓度2/ FITC-APTES-NPs。
3.3。修改后的电极的表征
3.3.1。表征CMK-2

Rigaku公司SA-HF3 (Rigaku公司、日本)是用于获得CMK-2的x射线衍射图像。发现有一个明显的衍射峰出现在2θ,这表明CMK-2具有明显的二维六角形结构(图(15日))。JEOL - 2100仪器(JEOL公司、日本)用于获取传输EMS CMK-2的形象。指出,它有一个清晰的条纹结构和统一的大小,表明CMK-2(图有一个相对好的条纹结构15 (b))。

(一)
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(b)
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图15
CMK-2的表征。注意:(a)衍射图像和(b) EMS。
3.3.2。修饰电极的电化学性质

电化学阻抗谱(EIS)可以用来描述不同的电极。在这项研究中,电极的阻抗变化在改性研究,并进一步,电化学阻抗谱。裸露的玻璃碳电极的电化学阻抗(GCE) CMK-2 / GCE,非盟NPs / CMK-2 / GCE,和我-βcy /非盟NPs / CMK-2 / GCE测量在1更易与L Fe (CN)63 - / 4磷酸盐缓冲剂(图(16日))。频率变化范围是0.01 -10千赫。

(一)
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(b)
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图16
修饰电极的电化学性能。(一)电化学阻抗曲线。(b)光谱。

裸露的全球教育运动的电子转移电阻很小,约500人Ω。它由CMK-2修改后,电子传递阻力迅速增加至3800人Ω。其原因可能是介孔硅材料本身不导电。电沉积非盟之后,阻抗值降低,这表明非盟NPs具有良好的导电性和促进铁(CN)的转移63 - / 4。后与我——相结合βcy,电子转移电阻继续增加到2100人Ω。我可能是有机物βcy抑制铁(CN)的转移63 - / 4。综上所述,它可以确认我βcy /非盟NPs / CMK-2 / GCE成功做好准备。图16 (b)显示的简历光谱光GCE CMK-2 / GCE,非盟NPs / CMK-2 / GCE,和我-βcy /非盟NPs CMK-2 / GCE 1更易与L Fe (CN)63 - / 4磷酸缓冲溶液。阻抗图的变化(16日)对应于图16 (b)。

3.3.3。峰电流与扫描速度

图17显示了我——的CA光谱βcy /非盟NPs / CMK-2 / GCE磷酸盐缓冲剂在不同扫描速度。扫描速度控制在100 - 400 mv / s,和结果表明,扫描速度继续增加提供当前的最高峰值为0.35 V。


图17
我的简历光谱βcy /非盟NPs / CMK-2 / GCE在不同扫描速度。
3.3.4。最优解决方案的pH值

在这项研究中,溶液的pH值的影响确定修改后的电极随着峰值电流之间的关系曲线和pH值。基本的解决方案是15μ与不同的pH值mol / L磷酸盐缓冲剂。它指出,随着溶液的pH值逐渐增加从1.0到4.0,峰值电流信号也增加。当pH值超过4.0时,响应信号迅速减少(图(18日))。也许,当溶液的酸度增加,质子的数量逐渐减少,影响电极上的反应。当pH值控制在1.0 - -6.0的范围,减少潜在的峰值有一个线性关系试验溶液的pH值。拟合线的斜率是-60 mV,这是非常接近理论值-59 mV。它表明,在电化学反应,质子数等于电子(图18 (b))。当 ,峰值电流是最高的。因此, 被选为最佳pH值。

(一)
(一)
(b)
(b)
图18
修饰电极的pH值的影响。注意:(a)峰值电流之间的关系曲线值和pH值和(b)之间的线性相关性曲线峰值减少潜在的修饰电极和pH值。
3.3.5。修改的时间

我-βcy债券通过S-Au黄金NPs债券,但是这种共价键需要一定时间来达到一种稳定状态。因此,达到稳定状态所需的时间是在我——探索βcy修改。15的还原峰电流μmol / L磷酸盐缓冲剂记录随着时间的推移,如图19。


图19
随着时间的推移减少峰值电流。

结果表明,当我——的修改时间βcy小于15 h,还原峰电流逐渐增加的时间。经过15 h,峰值电流趋于稳定。在这项研究中,修改时间设置为15 h。

4所示。结论

在这项研究中,使用遗传算法优化BP神经网络,并识别NP传感器是用于诊断癌细胞,旨在实现早期诊断癌症细胞的荧光成像。RMS和梅的优化的BP神经网络进行了分析,观察比传统的更小。此外,修改后的电极我-βcy /非盟NPs / CMK-2 / GCE成功制备和应用于传感器。这个传感器显示稳定性好、选择性和抗干扰特性,提供一个早期癌细胞的检测的新方法。准备HA-modified荧光NPs具有良好的荧光稳定性,和HA共价修饰荧光NPs能具体地绑定到癌细胞。该方法可用于荧光成像技术检测。这项研究提供了很好的理论依据临床诊断和预防癌症。然而,实际实施结果利用宫颈癌细胞是普遍适用的其他肿瘤细胞,及其进一步验证将是未来研究方向的研究工作。

数据可用性

所有数据提供了主要的手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。