文摘

的目标。探讨母体免疫系统的变化在怀孕,我们研究自然的表达细胞毒性细胞因子受体(协助)和生产在术语胎盘蜕膜NK细胞和外周血。方法。术语外周血和蜕膜取自病人择期剖腹产。使用密度梯度离心法分离的淋巴细胞(及)外周血和蜕膜分离后的使用及酶消化。这些细胞和FITC染色anti-CD56和Per-CP anti-CD3单克隆抗体,和协助沾PE-conjugated anti-NKG2D, NKp46 NKp30, NKp44单克隆抗体。细胞因子,包括干扰素-γ肿瘤坏死因子-α、il - 10和TGF -β染色,然后由流式细胞术分析。结果。细胞阳性NKG2D较少,NKp46和NKp30 CD56 +比外周血CD3 -蜕膜细胞,但NKp44-positive CD56 +细胞CD3的百分比——在蜕膜淋巴细胞往往更高。结论。蜕膜的一些协助的下降表现可能与降低细胞毒性在怀孕,但NKp44表达的增加可能会影响蜕膜细胞因子增加生产。同样,协助在蜕膜的表达可能会连接到怀孕的维护。

1。介绍

在成功怀孕,有许多机制胎儿母体免疫系统(避免被拒绝的1]。据报道,自然杀伤(NK)细胞的细胞毒性活动是孕期抑郁,细胞毒性的抑制是多因素疾病,可能包括细胞和体液元素(2]。子宫蜕膜细胞有抑郁NK细胞毒性(3- - - - - -5]。据报道,凶手抑制性受体(吉珥)子宫NK细胞发挥作用在维持一个正常的怀孕。HLA-G,作为HLA抗原,在extravillous滋养层表示,NK细胞毒性抑制通过刺激吉珥HLA-G [6]。然而,抑制细胞毒性的元素没有被评估。

负责NK细胞的受体激活过程中自然细胞毒性是集体称为自然细胞毒性受体(协助)。协助由CD335 (NKp46) CD336 (NKp44) CD337 (NKp30)和CD314 (NKG2D) [7]。NKp46和NKp30表达在休息或激活NK细胞,而NKp44仅表现在激活NK细胞。协助仍不完全识别的配体分子的定义。NKp46 NKp44检测终端N-acetylneuraminic酸残留在仙台病毒神经氨酸酶(唾液酸)和流感病毒血凝素。NKp44检测分枝杆菌和HIVgp41游离8]。

马林R报道了NCR表现,如NKp46 NKp30, NKp44, NKG2D CD56 + CD3 -蜕膜NK细胞在怀孕的前三个月(9]。

然而,协助,出现在怀孕没有被研究过。

此外,在蜕膜细胞因子的作用是很重要的在怀孕的维护10- - - - - -13]。协助和胞内细胞因子之间的关系表达CD56 + NK细胞在外周血NK细胞和子宫内膜分析(14,15]。

NK细胞有两种类型:成熟的NK细胞(CD56dim + CD16 + CD56 + CD16 + CD3 -)和不成熟的NK细胞(CD56bright + CD16 -、CD56 + CD16-CD3 -) (16]。成熟的NK细胞,存在于外周血,几乎所有的NK细胞,,在蜕膜,有大量的未成熟的NK细胞,被称为子宫NK细胞(17- - - - - -19]。CD56 + CD3-CD16 - NK细胞的细胞因子生产高于CD56 + CD3-CD16 + NK细胞,这可能给前一个角色在维持妊娠(18,20.]。

研究免疫系统的变化在正常怀孕,我们首先分析了亚型在外周血和蜕膜NK细胞的正常怀孕;然后,我们分析的表达CD56 + CD3 - NK细胞协助;最后,我们评估外周血和蜕膜细胞因子生产怀孕。

2。材料和方法

获得知情同意后,母体外周血和蜕膜采集学期19例正常妊娠的选择性剖腹产血压正常的怀孕没有并发症。研究项目的协议是由一个适当构成伦理委员会批准的机构进行工作,这符合赫尔辛基宣言的规定。后胎盘、蜕膜样本仔细擦洗用纱布从子宫壁。患者没有劳动,没有胎膜早破。母亲的年龄平均为35.5岁(范围:20-44年),和妊娠期平均为37.8周(范围:37-39周)。样品在6小时内测量。

2.1。隔离的蜕膜和外周血淋巴细胞

蜕膜细胞悬浮液由蜕膜组织的修改罗维奇的方法(21]。蜕膜碎片后洗了PBS和母体的血液被组织确定了宏观和切碎的剪刀,然后孵化有限公司37°C的5%2rpmi - 1640年连续搅拌介质(GIBCO,大岛,纽约,美国)含0.25% Trypsin-EDTA (GIBCO)。90分钟后,细胞悬液过滤是一个100年μ米尼龙网康宁细胞过滤器(美国康宁公司那里,MA)与rpmi - 1640洗了三次,离心机在400 g。细胞颗粒被resuspended rpmi - 1640含10%胎牛血清(的边后卫)(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),然后分层到Lymphoprep (AXIS-SHILD,奥斯陆,挪威)解决方案,在400 g离心20分钟。细胞从接口被洗了三次吸气PBS和调整浓度1 x107细胞在RPMI /毫升。细胞生存能力被证实是> 95%台盼蓝死去。外周血淋巴细胞也使用Lymphoprep分离。

2.2。抗体标记

一百毫升的外周血和蜕膜淋巴细胞(1 x106细胞/ 100μ20 l)贴上μl (FITC-conjugated anti-CD56单克隆抗体(克隆B159,正欲,富兰克林湖,新泽西,美国),PE-conjugated anti-CD314 (NKG2D) (Clone1D11 eBioscience,圣地亚哥,美国),anti-CD335 (NKp46)(克隆BAB281,贝克曼库尔特、沥青、钙、美国),anti-CD336 (NKp44)(克隆Z231,贝克曼),anti-CD337 (NKp30)(克隆Z25,贝克曼),PerCP-conjugated anti-CD3抗体(克隆SK7,正欲),和PerCP-conjugated anti-CD16(克隆3 g8, BioLegend,圣地亚哥,美国)。

2.3。流式细胞术

Antibody-labeled细胞流式细胞仪分析了使用Fluorescence-Activated细胞分选仪(流式细胞仪)石中剑(becton dickinson,富兰克林湖,新泽西,美国)。流式细胞分析仪利用15 mW 488海里的氩激光激发。门上设置了散射(FSC)和侧散射(SSC)点阴谋排除非细胞的碎片和专注于淋巴细胞。设置了门周围的淋巴细胞,跨界车的荧光标签1 (FL1) FL2,和FL3信号被补偿使用FITC -调整,体育,或PerCP-conjugated抗体。与抗体的结果表示为细胞或淋巴细胞的百分比。对于每一个实验,1 x105细胞和淋巴细胞进行评估。细胞标记抗体阳性的比例量化使用CELLQuest (becton dickinson)和数据分析使用FlowJo软件(美国或树明星,亚什兰)。

2.4。细胞因子检测

流式细胞仪是用来评估细胞内细胞因子。评价细胞因子是由活化后的生产PMA / ionomycin根据福井的方法等。14]。孤立的细胞被孵化与佛波醇12-myristate 13-acetate (PMA) (25 ng / ml), ionomycin (1μM)和Brefeldin-A (5μg / ml) 4小时。激活细胞被染色和共轭anti-CD56 anti-CD3抗体permeabilized。然后,他们又沾PerCP-conjugated anticytokine特定于干扰素-单克隆抗体γ(克隆4 s。B3、BioLegend)、肿瘤坏死因子-α(克隆Mab11 BioLegend), il - 10(克隆JES3-9D7, BioLegend),和一圈(TGF -β1)(克隆TW4-2F8 BioLegend)。

2.5。统计分析

所有的值表示为平均值±标准偏差(SD)。数据分析使用t测试或Mann-WhitneyU测试GraphPad棱镜6(美国圣地亚哥,CA)的信心认为显著P < 0.05。

3所示。结果

我们分析了分布在外周血和蜕膜NK细胞的细胞亚群。分析CD56 + CD3 -细胞(NK细胞)在CD56-positive淋巴细胞在正常怀孕表明CD56 + CD3 -细胞的百分比在CD56-positive淋巴细胞蜕膜细胞(6.3±2.5%)低于外周血(8.7±4.5%)(图1)。当CD56 + CD3-CD16 +细胞(成熟的NK细胞)中CD56 +淋巴细胞在相同的条件下,分析了CD56 + CD3-CD16 +细胞的百分比在CD56 +淋巴细胞在蜕膜(45.9±15.5%)低于外周血(89.6±5.9%)(图2(一个))。当CD56 + CD3-CD16 -细胞(未成熟的NK细胞)中CD56 +淋巴细胞在相似的条件下,分析了CD56 + CD3-CD16 -细胞的百分比中CD56 +淋巴细胞蜕膜(54.1±15.5%)高于外周血(10.4±5.9%)(图2 (b))。


图1
比例的CD56 + CD3 -细胞在淋巴细胞在外周血和蜕膜怀孕。CD56 + CD3 -淋巴细胞百分比的蜕膜细胞在外周血低于。
(一)
(一)
(b)
(b)
图2
(a)中CD56 + CD3-CD16 +细胞百分比CD56 + CD3 -细胞在外周血和蜕膜怀孕。CD56 + CD3-CD16 +淋巴细胞百分比的蜕膜细胞在外周血低于。(b)的百分比CD56 + CD3-CD16 -在CD56 +细胞CD3细胞在外周血和蜕膜怀孕。CD56 + CD3-CD16 -淋巴细胞百分比的蜕膜细胞在外周血高于。

接下来,我们分析了百分比的协助CD56 + CD3 -淋巴细胞(NK细胞)在外周血和蜕膜在正常怀孕。NKG2D的百分比(CD314) + CD56 + CD3 -淋巴细胞之间的细胞分别为79.0±10.2,87.7±7.3在蜕膜和外周血,分别(图3的百分比),而NKp46 (CD335) + CD56 + CD3 -淋巴细胞之间的细胞分别为31.3±7.5,85.9±10.7在蜕膜和外周血,分别(图4)。在这两种情况下,似乎蜕膜中的值低于外周血(p≦0.0011, p≦0.0001)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
(a)的百分比CD314 (NKG2D) + CD56 +中细胞CD3−细胞在外周血和蜕膜怀孕。CD314的百分比(NKG2D) +在蜕膜淋巴细胞在外周血低于。(b)代表点的情节分析CD314 (NKG2D) + CD56 + 3 -淋巴细胞之间的细胞通过流式细胞术是从怀孕。门被设置在CD3 -淋巴细胞分析CD314 + CD56 + NK细胞。
(一)
(一)
(b)
(b)
图4
(a)的百分比CD335 (NKp46) + CD56 +中细胞CD3−细胞在外周血和蜕膜怀孕。的百分比CD335 (NKp46) +淋巴细胞在外周血蜕膜低于。(b)代表点的情节分析CD335 (NKp46) + CD56 + CD3 -淋巴细胞之间的细胞通过流式细胞术是从怀孕。门被设置在CD3 -淋巴细胞分析CD335 + CD56 + NK细胞。

NKp30的百分比(CD337) + CD56 + CD3 -淋巴细胞之间的细胞分别为8.0±2.6,52.0±21.0在蜕膜和外周血,分别和前有值低于后者(p < 0.0001)(图5)。细胞阳性NKG2D (CD314) NKp46 (CD335)和NKp30 (CD337)中CD56 + CD3 -蜕膜细胞也低于外周血。NKp44的百分比(CD336) + CD56 + CD3 -淋巴细胞之间的细胞分别为11.8±3.5,0.6±0.7在蜕膜和外周血,分别(图6蜕膜的值),显示高于外周血(p≦0.0001)。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
(a)的百分比CD337 (NKp30) + CD56 +中细胞CD3−细胞在外周血和蜕膜怀孕。CD337的百分比(NKp30) + CD56 + 3 -细胞在外周血淋巴细胞低于。(b)代表点的情节分析CD337 (NKp30) + CD56 + CD3 -淋巴细胞之间的细胞通过流式细胞术是从怀孕。门被设置在CD3 -淋巴细胞分析CD337 + CD56 + NK细胞。
(一)
(一)
(b)
(b)
图6
(a)的百分比CD336 (NKp44) + CD56 + CD3 -细胞间细胞在外周血和蜕膜怀孕。的百分比CD336 (NKp44) + CD56 + CD3 -淋巴细胞之间的细胞是高于外周血。(b)代表点的情节分析CD336 (NKp44) + CD56 + CD3 -淋巴细胞之间的细胞通过流式细胞术是从怀孕。门被设置在CD3 -淋巴细胞分析CD336 + CD56 + NK细胞。
3.1。细胞因子的生产外周血和蜕膜细胞在血压正常的怀孕

CD56 +细胞的比例从外周血(n = 4)和蜕膜(n = 8)产生干扰素-γ在血压正常的怀孕,6.4±5.8%和7.8±3.5%,分别显示无显著差异(图7 (a))。肿瘤坏死因子-的百分比α第CD56 +细胞之间的细胞从外周血和蜕膜细胞在血压正常的怀孕2.7±2.2%和6.9±3.8%,分别与后者细胞百分比高于前(P < 0.0485)(图7 (b))。的百分比IL-10-producing CD56 +细胞从外周血和蜕膜分别为0.3±0.1%和5.9±3.0%,分别清晰地表明蜕膜细胞产生il - 10的比例高于外周血(图(p < 0.0046)7 (c))。TGF -的百分比β第CD56 +细胞在外周血和蜕膜1.5±0.5%和5.3±1.6%,分别与蜕膜细胞表现出更高的速度比从外周血(图(p < 0.0012)7 (d))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图7
细胞因子的生产从CD56 +细胞在正常怀孕。(一)无显著差异的百分比中发现干扰素-γ生产CD56 +淋巴细胞在外周血和蜕膜之间。(b)的百分比TNF -α生产CD56 +淋巴细胞在蜕膜高于外周血。(c) il - 10在蜕膜生产CD56 +淋巴细胞的比例都高于外周血。(d)的百分比TGF -β生产CD56 +淋巴细胞在蜕膜高于外周血。

4所示。讨论

我们评估协助蜕膜CD53 + CD3 - NK细胞在怀孕和证明协助CD56 + CD3 - NK细胞,如NKp46 NKp30,和NKG2D表达下调的蜕膜比外周血更大程度。据报道,蜕膜NK细胞的细胞毒性活动是孕期抑郁2- - - - - -5)和细胞毒性的抑制可能是多因素疾病,可能包括细胞和体液元素(1,2]。从我们的实验中,NK细胞cytotoxity可能抑制因为协助较低的表达比外周血蜕膜。

马林R报道的NCR表现蜕膜CD56 + CD3 - NK细胞,如NKp46 NKp30, NKp44,和NKG2D在怀孕的前三个月(9]。在蜕膜,NKp46和NKp30 NK细胞的表达低于在妊娠前三个月,和NKG2D的表达在妊娠前三个月高。

NK细胞亚型在怀孕期间已报告,如CD56 + CD3-CD16 - NK细胞和CD56bright CD16 - NK细胞,称为子宫NK细胞,占70 - 80%的蜕膜NK细胞(18]。在我们的实验中,有显著的CD56 + CD3 -和CD56 + CD3-CD16 - NK细胞显著减少CD56 + CD3-CD16 +蜕膜与外周血中NK细胞怀孕。下降百分比的CD56 + CD3-CD16 + NK细胞,我们报道这样的下降百分比的CD56 + CD3-CD16 + NK细胞对于妊娠前三个月的怀孕(19]。同样的模式据说NK细胞亚型的存在。然而,CD56 + CD16-NK蜕膜细胞的百分比在对于妊娠前三个月的期限低于蜕膜。这可能影响协助的表达式。然而,协助的表达可能会有所不同从术语对于妊娠前三个月的蜕膜;需要进一步评估。

NK受体配体在侵入胎盘滋养层细胞中表达,据Vacca [22]。此外,汉娜报道,NKp30的配体和组织内检测到NKp44蜕膜(20.]。NK受体表达的减少可能是由于增加了与各自的配体的相互作用,根据一份报告,配体结合的差别可以诱导对这些NK受体(23,24]。NKp30的差别,对这些受体可能依赖于配体结合。随着胎盘体重增加可能会导致配体表达的增加,NKp30受体可能进一步下调。

NK细胞功能受损的downmodulation肿瘤与协助,据说是由于ligand-induced受体调制,比如从肿瘤细胞表面配体的脱落,见NKG2D [25]。我们因此可以说,从胎盘滋养层的脱落碎片的差别可能导致对这些NKG2D受体(26]。对胎儿组织可能抑制NK细胞cytotoxity因为协助减少更多的表达与外周血相比。这可能抑制蜕膜NK细胞活性的怀孕。

据报道,细胞因子的作用,如干扰素-γ肿瘤坏死因子-α、IL4 IL10, TGF -β,在维持妊娠蜕膜是很重要的10- - - - - -13]。

NKp44比外周血调节在蜕膜。我们认为蜕膜NKp44 NK细胞被激活,因为NKp44表示只有在激活循环NK细胞(7]。我们分析了在外围和蜕膜细胞因子表达CD56 + NK细胞。肿瘤坏死因子等细胞因子的表达水平α、IL10 TGF -β增加更多的蜕膜比外周血CD56 +细胞。

CD56 + CD3-CD16 - NK细胞的细胞因子生产高于CD56 + CD3-CD16 + NK细胞,因此可能给怀孕的前一个角色维护(16]。由于NKp44表达的增加,细胞因子的表达可能会增加更多的与外周血CD56 +细胞。细胞因子表达式,起源于NKp44可能发挥作用在维持妊娠。我们需要分析NCR-positive细胞的细胞因子表达CD56 + CD3-CD16 + CD56 + CD3-CD16 - NK细胞。

在正常怀孕,蜕膜的一些协助的表达减少,外周血多,这可能与减少NK细胞的细胞毒性。然而,正如一些函数的NK细胞被激活,从而产生一些细胞因子,一个适当的平衡NK细胞细胞因子的生产可能产生和NK细胞的细胞毒性,可能扮演一个角色在维持妊娠。

的利益冲突

作者没有与公司的关系,可能会有经济利益在手稿中包含的信息。

确认

这项工作是支持的补助金的高科技研究中心教育部的项目。