Cell-SELEX识别“黏性”RNA适体序列

抽象的

cell - selex用于选择细胞结合适配体。我们采用了额外的选择压力，使用RNAse去除表面结合的适配体，并选择细胞内化的适配体。从针对两种不同胰腺癌细胞系的独立细胞selex程序中鉴定出了一个共同的RNA序列，表明在适体库中存在的大量其他可用序列中，对该序列存在强大的选择压力。该适配子对胰腺癌细胞系不是特异性的，在以前发表的内化适配子中也有类似的序列基序。所鉴定的序列形成一个结构基序，与表面蛋白结合，该表面蛋白要么高度丰富，要么与所选的适配子序列有很强的亲和力。在细胞selex过程中去选择(去除)这个序列可能会增加在细胞表面识别针对细胞类型特异性靶标的适配体的概率。

1.介绍

核酸适体是通过指数富集配体系统进化(SELEX)选择的核酸聚合物。虽然最初描述为小分子和纯化蛋白在体外选择配体[1，2[过程本身已经进化多年，现在经常用于选择可以与细胞结合的配体。Cell-Selex，随着程序已被称为，使用单元格生成绑定它们的适体，高亲和力[3.］．通过引入诸如计数器的步骤，已经结合到选择方案中，其中执行正面和负选择的循环。对细胞类型进行阳性选择，该细胞类型是适于适体结合的所需靶标。为负选择选择的细胞通常是与阳性细胞类型类似的细胞类型，但是在可以靶向的某些特征中变化。例如，如果希望生成将靶向某些癌细胞类型的适体，则相应的正常细胞类型将被用作否定选择目标。因此，从选择中除去与阳性和阴性细胞之间共享的共同靶标结合的适体，而优先选择显示癌细胞靶标的特异性的适体。使用这种类型的选择方案，已经生成了几种适体，其对目标细胞显示高亲和力和特异性[4］．

然而，细胞 - SELEX的主要缺点之一是，尽管执行正负选择周期，但我们经常为不显示目标细胞的特异性的适体选择。它们要么与等于亲和力的靶和对照细胞结合，或者在对照细胞上与靶细胞结合时显示适度的偏好[5］．诸如在阳性选择周期中增加严格度和使用竞争核酸(如转移rna (tRNA)或鲑鱼精子DNA)来掩盖适体库和细胞表面之间的非特异性相互作用等措施已被用于提高特异性，尽管有有限的好处[5］．

正如前面提到的，执行正负选择策略背后的想法是在目标细胞类型的细胞表面找到与相应的正常细胞不同或缺失的蛋白质。这是一个挑战，因为大多数显示在细胞表面的蛋白质是许多细胞类型共有的[6］．我们推断，细胞表面的高度丰富的靶点是被选择的适配体的非特异性的原因。这些常见的细胞表面目标也可能由于其电荷或结构而对适配体具有高亲和力，从而导致了这个问题。

我们假设，识别这些目标，或结合它们的适配体，可以缓解问题。这些相互作用可以被阻断，也可以在细胞selex过程中取消非特异性适配体序列，从而为选择特定细胞类型的适配体提供更好的机会。

2.材料和方法

2．1．Cell-SELEX

MiaPaCa-2和Panc-1细胞被镀(~2 × 10)⁶细胞/孔)，并于细胞selex前一天在DMEM + 10% FBS培养基中在6孔板中生长，在标准的细胞生长条件下。

DNA模板寡核苷酸、5 '引物、3 '引物的序列为5 ' - tcgggcgagtcgtctg --CCGCATCGTCCTCCCTA-3”(分别为a、T、C和G)、5 ' - gggggaattctaatacgactcactatagggagacgatgcgg -3 '和5 ' -TCGGGCGAGTCGTCTG-3 '等摩尔量的40个核苷酸随机区。由Oligos等公司合成DNA寡核苷酸。将DNA模板寡核苷酸退火到5 '引物上，然后用Exo-Klenow (NEB)填充模板，制备双链DNA模板。起始RNA库由天然嘌呤和2 ' -氟修饰嘧啶(TriLink Biotechnologies)和修饰的T7 RNA聚合酶体外转录生成，然后凝胶纯化。

第一轮(R1)用4 nmol的Sel III (2 ' -fluoro-嘧啶修饰的适配体库5 ' - tcgggcgagtcgtctg -)孵育细胞-CCGCATCGTCCTCCCTA-3 '如前所述[10])，在1ml DMEM (Gibco®)+ 10%胎牛血清培养基中，在37℃(组织培养箱)条件下培养1小时，用于细胞生长。孵育后，去除培养基，在含镁和氯化钙的DPBS缓冲液(Gibco)中严格洗涤细胞5次(5x)。接下来，用1 mL TRIzol®试剂(Thermo Fisher Scientific)直接裂解细胞，按照制造商的协议提取总RNA。随后，总RNA被逆转录[11]与适配体特异性引物。用RNAse (RiboShredder™，RS) (Epicentre Biotechnologies)处理反应混合物，去除RNA，乙醇沉淀cDNA后，进行PCR扩增，生成DNA模板，用于下一轮的转录。在第二轮(R2)中，为了增加选择的严格性，降低了RNA与细胞的比例;取400 pmol RNA, 0.5 × 10孵育⁶细胞/孔。将细胞与RNA池一起温育1小时并用与先前在R1中的相同的缓冲液洗涤5倍。然而，为了进一步提高选择的严格性，将细胞用蛋白酶 - 胰蛋白酶（Gibco）处理，意图除去与细胞表面蛋白结合的RNA，在Trizol提取总RNA之前。在第3轮（R 3）中，通过在胰蛋白酶治疗后添加RNase Cocktail（RiboShredder，RS）（震中生物技术）以进一步增加严格的R 2方案，以便仅为细胞内化RNA选择[11，12］．从第四轮(R4)到第七轮(R7)， R3的协议被重复，除了将rna细胞的孵育时间从1小时减少到30分钟，目的是进一步增加选择压力的严格程度。

2．2.高通量测序(HTS)数据分析

对于HTS，将每一轮(R1至R7)后获得的DNA模板进行PCR扩增，利用引物进行单向测序，采用融合法(Ion Torrent Personal Genome Machine®，Life Technologies™)。获得的PCR产物(每轮有单独的条形码)用3%琼脂糖- tae凝胶溶解，切出条带，用凝胶提取试剂盒(QIAquick gel extraction kit, Qiagen)从凝胶中提取DNA。接下来，从每一轮中收集的等摩尔数量的DNA扩增子被汇集到杜克测序和基因组技术共享资源的个人基因组机(PGM)系统上进行测序。使用Qubit/Bioanalyzer进行库库质量控制。按照制造商指南和建议，在Life Technology OneTouch 2仪器上使用Ion PGM Template OT2 200 Kit (cat# 4480974)进行乳剂PCR。将富集的模板珠加载到318 v2芯片上，使用Ion PGM sequencing 200 Kit v2 (cat# 4482006)进行测序。

对于HTS数据分析，首先过滤读取以仅包括长度为至少70nt的那些，并且在其间具有38-42nt可变适体序列的3'和5'适配器序列。收集Aptamer序列并根据丰度订购。群集质心被定义为在所有样本中具有最高读数的序列，并且不在先前定义的集群质心的4个不匹配范围内。然后将剩余的序列基于它们与质心的距离（由该序列与质心之间的错配数限定）纳入簇中。读取两个质心之间的距离的读数被认为是“暧昧”。

2.3。北部的污点

细胞（0.5×10⁶细胞/孔)在实验前一天被置于12孔板中，如上所述。400 pM的适体或对照文库与600细胞孵育μL DMEM + 10% FBS培养基在37℃(组织培养箱)条件下细胞生长1小时。孵育后，细胞在含镁和氯化钙的DPBS缓冲液中洗涤3x，并用胰蛋白酶处理使细胞从培养皿中分离出来。洗涤悬浮细胞，用TRIzol试剂分离总RNA。其次，总RNA (3μg/lane)在0.5x TBE缓冲液中溶解于15%尿素-聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad)中。溶解的RNA在0.5x TBE缓冲液中转移到尼龙膜(GeneScreen Plus™杂交转移膜)，20电压(4°C, 4小时)。转移后，尼龙膜进行紫外线交联(UV Stratalinker®2400,Stratagene)，并在室温下干燥过夜。膜用5ml杂交缓冲液(Perfect Hyb™Plus, Sigma)在40°C孵育2小时以进行阻断，随后用5 ' -[γ-³²P] - 在40℃下，-Radiolabeled探针BW28（5'-TcggGGCGAGTCGTCTG-3'）过夜。将膜在40℃下在含有0.1％SCS的0.5×SSC缓冲液中洗涤3次，并使用Strom 825磷仪（GE Healthcare）定量。对于加载控制，用放射性标记的U6小核聚体（Snorna）特异性探针5'-cacgaatttgcgtgtcatcctt-3'，剥离标记的膜并再生。

2.4。细胞结合和内化测定

定量条带用于计算与细胞结合的适体的相对数量。通过将适配体的带体积除以对照U6带计算出比值:

然后将每个适配体的比值除以与Sel 3文库结合的比值，计算相对富集度:

细胞经胰蛋白酶处理后与RS孵育，以评估适体内化。为了获得内化的MiaPaCa-2细胞结合适配体的相对数量，将RS(+)处理细胞的适配体和U6带的比例除以RS(-)处理细胞的比例。

3.结果和讨论

为了实现这一目标，我们对人胰腺癌细胞系MiaPaCa-2 (ATCC)进行了细胞selex治疗。我们通过使用由Magalhães等人首次描述的鸡尾酒RNAse (RiboShredder, RS)，在SELEX协议中加入了额外的选择压力。[11］．与细胞结合的适体通常被内在化。它们与细胞表面的蛋白质结合，这些蛋白质在细胞膜和细胞内部之间循环。因此，适配体通过“背载”运输机制进入细胞[4］．使用RNAse鸡尾酒的基本原理是选择被细胞结合和内化的适配体。被内化的适配体将受到RS的保护，并将进行繁殖以进行选择，而未结合的适配体，或只与细胞表面结合但未内化的适配体，将被RS的作用切割[11］．

经过七轮细胞 - SELEX后，从MIAPACA2选择的所选RNA（圆形1至7）进行高通量测序（HTS）[13]为了鉴定在选择期间富集的适体。获得了两种主要序列，在圆形上表现出逐步的富集（表1（一种）;补充文件S2，在线提供的补充材料https://doi.org/10.1155/2017/4943072)。为了验证HTS数据，我们还克隆了最后一轮SELEX(第7轮)，并进行了Sanger测序。HTS鉴定的序列与Sanger测序的序列相同(见表)1(b),图1)。

接下来，我们对HTS数据进行生物信息学分析，通过跟踪SELEX轮的百分比富集来监测选择的进展(图)2)。有趣的是，获胜的序列在细胞selex的早期高度富集。甚至在进行了一轮细胞选择之后，富集率也超过了88%。到第二轮时，浓缩百分比达到99%以上，随后的几轮浓缩很少。这种早期富集可能是胰腺癌细胞表面存在的蛋白质或其他大分子的结果，这些蛋白质或大分子与这些适配子序列具有高度亲和力(见表)1(a))。此外，在细胞selex过程中，tRNA或鲑鱼精子DNA等非特异性阻断剂的缺失可能会加重这些细胞表面残基对这些适配子序列的“粘性”问题，导致它们非常早的选择。

此外，为了确定适体的早期选择不是由污染引起的，进行了一个对照实验，其中使用与细胞SELEX相似的反应条件进行了一轮“模拟”SELEX，但没有细胞。逆转录和PCR反应后未发现可检测到的RNA，说明RNA适配体的早期选择不是污染的结果(数据未显示)。

我们还使用另一种胰腺癌细胞系pan -1 (ATCC)进行了独立的SELEX。采用与MiaPaCa-2相同的方法，进行7轮细胞selex，并对第7轮细胞进行克隆和测序。有趣的是，我们获得了相同的适体物种，尽管有不同的百分比代表，正如在MiaPaCa-2选择的第七轮中所呈现的(表)1(c))。这些数据支持了一种假说，即某些种类的核酸适配体由于胰腺癌细胞上存在高亲和力或高丰富的细胞表面结合物而被优先选择。值得注意的是，M7-14的适配子序列占第1轮中出现的序列的63%以上(见表)1(a))。

需要指出的是，虽然在理论上识别的共同序列(s)在两个独立的选择与一个(库的可变区)非常低，我们推断当起始DNA模板被转录时，特定序列可能在起始RNA库中多次表示，然后用于单独的选择。因此，在独立的选择中出现相同的序列不一定是交叉污染的结果。

由于在两种选择的早期循环中出乎意料地高的富集该序列，克隆了初始SEL 3（文库），并测序了11个“随机”克隆。这些克隆的序列对准证实了可变区的随机性（补充图S1），表明该适体序列的早期富集不是初始起始文库中的偏差的结果。

RiboShredder (RS)(细胞selex协议中使用的RNase)是一种专有的、优化的内、外RNase混合物，完全降解修饰和未修饰的RNA。在之前的研究中，我们一直观察到我们测试的所有2 ' -氟嘧啶修饰的RNA适配体在使用该酶处理后都被完全降解。其他2 ' -氟修饰RNA适配体的独立实验室也进行了类似的观察[11］．为了进一步测试这一观察结果，我们对5 ' -[γ³²-P]-M7-14适体与RS处理(使用类似的条件在细胞selex中使用)。未观察到可检测的条带(与未处理的5 ' -[相比γ³²-P]-M7-14适配体)，在12%的聚丙烯酰胺-尿素凝胶中溶解，并进行了放射自显影(数据未显示)，表明该适配体本身并不具有核酸酶抗性。

接下来，为了研究所选适配体的细胞结合特性，我们使用荧光标记的适配体进行了流式细胞仪(FCM)分析[14］．我们观察到非常温和的结合(补充图S2)。当我们对不同轮的选择进行类似的分析时，我们观察到绑定没有增加(数据未显示)。用生物素和链霉亲和素结合的荧光染料末端标记的方法可能会引起适体的低聚化，从而干扰细胞的结合和内化。另一种可能——与前者并非相互排斥——是这里使用的荧光标记方法影响了所选适配体的二级结构。

为了在不需要标记的情况下评估所选适配体的细胞结合和内化，我们进行了Northern blot分析。将MiaPaCa-2细胞与适体孵育，从细胞中分离出的总RNA使用5 ' -[γ-³²P]-放射标记探针(BW28)，与适体库的3′不变区域互补(图3(一个))。与控制库相比，所有选择的适配体都显示出了与细胞结合的富集(图)3 (b))。pan -1和HPDE的数据相似[15](人胰腺导管上皮细胞)(正常胰腺细胞)用于实验(数据未显示)。

当我们结合RS处理进行同样的实验时，我们观察到一部分被选择的适配体被细胞内化了(图)3 (c))。值得注意的是，尽管所有的适配体大小相同(70个核苷酸)，但它们在变性尿素-聚丙烯酰胺凝胶中的迁移模式略有不同(图)3 (b)和3 (c))。高度稳定的结构，如在尿素-聚丙烯酰胺凝胶中未完全变性的适配体，可能是这种异常迁移模式的原因。值得注意的是，所选的适配体具有高的G(鸟苷)含量，可以诱导高度结构的G-四重奏的形成。

有趣的是，在先前发表的Gourronc等人的报告中，作者进行了正面阴性细胞 - SELEX策略，意图为特定于人乳头瘤病毒16-6-6 / E7转化的扁桃体上皮细胞进行选择的适体[5］．这些作者通过使用HPV16 E6/E7转化的扁桃体上皮细胞作为阳性，而相应的非转化的人扁桃体上皮细胞(HTEC)作为阴性SELEX靶细胞进行了几轮严格的阳性-阴性选择。当我们将我们的适配体(M7-14)序列与该组选择的一个优势适配体(C3)进行比对时，我们发现C3的可变区与M7-14的部分可变区相同64%(图)4(一))。它非常不太可能对来自两个不同文库产生的两个不同的图书馆具有40-nt随机区域（4⁴⁰不同的序列）可以单独使用超过50％。

值得注意的是，C3可变区和相应的M7-14可变区(M-fold程序预测)的二级结构[7]）有非常相似的结构图案（数字4（b）和4（c）)。有趣的是，这些可变区域具有域状特征，即使在适体序列的其余部分缺失时，它们仍然保持相同的二级结构(图)1(一)，4（b）,4（c）)。

我们用5 ' Alexa488荧光染料化学合成了VR M7-14区域(21个核苷酸)的部分(固相磷酰胺合成)，与全长适体(M-fold程序预测)保持相同的二级结构，并使用Panc-1细胞进行流式细胞分析。我们观察到，VR M7-14区域确认了其细胞结合的性质，表明“粘性”属性可以归因于这个“域”结构(补充图S3)。

从两个独立的选择和由单独组执行的选择中获得类似的序列，其中靶细胞和Aptamer文库都不同，强烈表明存在强烈的选择压力，以在存在的大量其他序列上选择这些序列。在适当的图书馆。目前尚不清楚这些序列是否与特定细胞表面靶标结合或这些序列是否通过一些其他机制介导内化。

此外，这些作者还提到了这样一个事实:尽管进行了正-负选择，并使用tRNA等阻断剂来减少非特异性结合，但大多数选定的适配体对HPV16转化细胞仅表现出适度的特异性。C3对与HPV-16转化细胞的结合表现出非常温和的偏好，而非用于阴性选择的对照非转化细胞。这些作者还提到了流式细胞术的困难，即荧光标记的适配体用于细胞结合试验时的适度变化。有可能某些适配子序列或结构不适合3 '端生物素-链霉亲和素荧光标记方法，而我们通常使用这种方法进行细胞结合分析。

总之，这些数据表明，我们选择了一种主要的适体序列，其与低亲和力结合到高度丰富的细胞表面大分子或与对较小的表面靶标结合的结合。这些高度或高亲和力的目标负责产生在Selex期间非常早期接管选择的适体，并且 - 一旦选择 - 这些适体物种以牺牲其他序列繁殖（图2、表1)。这些大分子似乎是常见的细胞表面蛋白，因此，针对它们选择的适体并不显示出细胞selex所期望的特异性。

我们假设，通过使用已确定的序列作为这些相互作用的阻断剂，我们可以掩盖这些共同的目标，从而允许选择相对稀少的目标。另一种方法是在选择过程中使用互补的寡核苷酸来阻止这些核酸适体序列的扩增。值得注意的是，这种方法以前已经成功地用于针对复杂蛋白质组(血浆)的选择，其中与最丰富的蛋白质(凝血酶原)结合的显性适配子序列被去选，以使SELEX重定向针对较少丰富的靶点[16］．这些方法有望提高细胞selex策略的特异性。

4.结论

我们进行了细胞 - SELEX，目的是鉴定特异性结合胰腺癌细胞的适体;通过使用RNase施加另外的选择压力以除去表面结合的适体，然后选择用于细胞内化适体选择。从针对两种不同胰腺癌细胞系的独立细胞selex程序中鉴定出了一个共同的RNA序列，表明在适体库中存在的大量其他可用序列中，对该序列存在强大的选择压力。由于Aptamer的结合/内化可以通过Northern印迹可靠地检测到北方印迹，因此我们没有筛选许多其他细胞系粘合。可以想到，即使不具体对胰腺癌细胞系，也可以是“胰腺特异性的胰腺特异性”。然而，在先前公布的抗无关细胞系中的类似序列基序的鉴定导致我们相信所鉴定的序列形成与共同表面蛋白结合的结构基质，其具有高度丰富或对所选适体具有很强的亲和力序列。在细胞selex过程中去选择(去除)这个序列可能会增加在细胞表面识别针对细胞类型特异性靶标的适配体的概率。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

致谢

作者要感谢杜克大学基因组与计算生物学中心基因组分析与生物信息学共享资源的Olivier Fedrigo博士和David Corcoran博士，感谢他们的高通量数据和分析。他们还感谢加拿大安大略省多伦多大学健康网络的曹明声博士提供的HPDE细胞。

补充材料

参考

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