文摘
客观的。调查TAM的作用受体在类风湿性关节炎(RA)滑膜组织确定TAM受体表达,滑液水平的可溶性TAM受体,和可溶性TAM受体之间的关系、关节炎症和疾病活动。方法。TAM受体表达决心通过免疫组织化学的滑膜风湿性关节炎和骨关节炎(OA)患者。可溶性(s) Tyro3、sAxl方向党,他们的配体Gas6 ELISA测定的RA的滑液( )和OA ( )通过多路免疫测定RA患者和细胞因子水平样本。斯塔姆受体之间的相关性分析与局部细胞因子水平;系统性疾病参数如红细胞沉降率(ESR)、类风湿因子(RF),和anticyclic citrullinated肽抗体(ACPA);和疾病活动分数(DAS28-ESR)在RA患者。结果。TAM受体表达在不同位置的滑膜组织(衬里、副线和血管),和一个类似的表达模式是RA和OA患者中观察到的。滑液sTyro3和方向党在RA和OA患者相比,显著提高而sAxl和Gas6水平没有显著差异被发现。在RA样本,sTyro3水平,但不是方向党,积极与当地促炎细胞因子和相关红细胞沉降率的系统性因素。此外,分层分析显示高sTyro3水平较高的正相关DAS28-ESR射频和ACPA积极RA患者的两倍。结论。sTyro3风湿性关节炎患者滑液的与当地相关炎症分子和系统性疾病活动。这些发现表明,减少负控制TAM受体细胞激活的滑液由于其脱落,主要sTyro3,有利于RA患者关节炎症。
1。介绍
类风湿性关节炎(RA)是一种常见的自身免疫性疾病,慢性和放纵的炎症、增生synoviocytes,破坏关节软骨和骨。在关节炎的关节滑膜是由先天和适应性免疫细胞渗透,加上tissue-resident成纤维细胞的增殖,导致血管翳组织形成关节软骨和骨界面。总而言之,这最终导致关节软骨的破坏和损失矩阵和骨组织(1,2]。骨关节炎(OA)是一种与年龄相关的肌肉骨骼疾病,其特征是关节破坏,包括软骨的分解矩阵(3]。在滑膜组织层面,骨关节炎的关节显示高度的相似性与RA增加巨噬细胞和淋巴细胞的存在。尽管不是一种自身免疫性疾病,滑膜炎症,风湿性关节炎的特征之一,往往是在OA (4- - - - - -6]。然而,主要区别是缺乏中性粒细胞在OA关节,一个细胞经历细胞凋亡和间隙的TAM受体介导的分辨率几种类型的炎症(7,8]。
TAM受体酪氨酸激酶家族由Tyro3,妳,Mer (MERTK基因名称)。TAM受体表达,在别人,单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和发挥重要作用的自然抗炎反馈机制和凋亡细胞的吞噬作用8- - - - - -11]。两个主要TAM受体蛋白质配体增长Arrest-Specific 6 (Gas6)和蛋白S (Pros1)。Gas6是所有三个TAM的配体受体亲和力最高的但对于妳,而Pros1只能激活Tyro3和海洋博物馆12,13]。TAM受体配体作为桥接分子之间TAM受体之一,磷脂酰丝氨酸(PS),表示为一个“吃我信号”表面上的凋亡细胞,从而有效地opsonising凋亡细胞TAM受体介导efferocytosis [8,12,14]。此外,激活TAM受体诱发,其中,抑制细胞因子的信号(soc)蛋白1和3,降低生产的众多细胞因子(9,14,15]。虽然我们最近表明,Mer,妳在小鼠模型发挥保护作用的RA, TAM的确切功能受体在RA患者在很大程度上仍是个未知数16- - - - - -18]。TAM可以裂解细胞表面受体,导致脱落的可溶性ectodomain,因此一种可溶性受体(19,20.]。这些可溶性TAM(斯塔姆)受体可以抑制TAM受体激活的免疫调节和抗炎效应降低膜结合受体,通过中和TAM的配体作为诱饵受体(21,22]。可溶性妳(sAxl)主要结合Gas6,而可溶性Tyro3 Pros1 (sTyro3)最高的亲和力。然而,祖文萃等人表明,可溶性Mer(方向党)不能结合TAM受体配体,因此不可以作为诱饵受体(13]。方向党和sAxl等离子体水平升高是系统性红斑狼疮(SLE)患者中观察到,这些水平积极与疾病活动,炎症过程,肾炎(23- - - - - -25]。此外,等离子体方向党水平升高与干燥综合征患者的疾病活动(26]。
到目前为止,没有描述关于国产斯塔姆受体水平在RA患者中,和斯塔姆受体的功能在这个疾病在很大程度上仍是个未知数。因此,在本研究中,我们调查了TAM受体的表达在滑膜组织和斯塔姆受体水平的风湿性关节炎患者滑液的使用OA样本作为控制。此外,我们分析了滑液之间的关系斯塔姆受体水平和细胞因子水平,全身性的参数和RA患者的疾病活动的分数。
2。材料和方法
2.1。RA和OA患者
类风湿性关节炎( )(7 21个女性,男性,平均年龄: 年)和膝关节OA ( )5(7女性,男性,平均年龄: 年)患者的风湿病(内梅亨大学医学中心,奈梅亨,荷兰)和它们Maartenskliniek(荷兰)。除了性别和年龄,以下的实验室参数RA患者记录:红细胞沉降率(ESR)、c反应蛋白(CRP)。RA患者组,16的28个病人(57%)双阳性类风湿因子(RF)和anticyclic citrullinated肽抗体(ACPA)(> 10国际单位/毫升),2是单身射频积极和3是单身ACPA阳性,而7的28 RA患者(64%)射频和ACPA双重否定(< 10国际单位/毫升)(25%)。11 RA患者,疾病活动分数决定。疾病活动分数计算使用28-Joint疾病活动Score-erythrocyte沉降率(DAS28-ESR)和三个变量基于28关节和ESR的评估,根据欧洲联盟对风湿病的建议(欧拉描述)27]。疾病活动分数低于3.2表示低疾病活动,而得分在3.2和4.0之间和分值4.0分以上代表中等和高疾病活动,分别。RA和OA患者的临床和人口特征提出了在桌子上1。
2.2。人类的滑液
RA和OA患者的滑液是在磋商联合诊所获得缓解压力和水肿引起的膝关节疼痛或肿胀(滑膜炎症)。所有材料被认为是多余的材料;因此,伦理批准并不是必需的。程序执行按照荷兰的行为准则负责在医学研究中使用人体组织(https://www.federa.org/code-goed-gebruik)。从所有的病人获得书面知情同意。在收集、滑液离心机在1700 x g 10分钟4°C,紧随其后的是30分钟10000 x g在4°C去除细胞。浮在表面的整除,储存在-80°C。降低粘度,滑液样本解冻和治疗与75 U /毫升的透明质酸酶(H3506;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)15分钟37°C和随后在1000 x g离心10分钟4°C。样本整除,储存在-20°C,直到进一步分析。
2.3。方向党,检测滑液sAxl sTyro3, Gas6水平通过酶联免疫吸附试验(ELISA)
滑液sAxl (DY154),方向党(DY6488) sTyro3 (DY859)和Gas6 (DY885B)浓度测定使用DuoSet夹心ELISA试剂盒购自研发系统(明尼阿波利斯,美国)。所有ELISA根据制造商的说明进行使用DuoSet ELISA辅助试剂包2 (DY008;研发系统)。的检测sAxl Gas6,滑液样本稀释30倍,而对于检测方向党和sTyro3分别样本稀释10和5倍。滑液样本稀释剂稀释剂(DY995;研发系统)。吸光度与修正450 nm波长540 nm的检测使用一个微型板块读者(CLARIOstar BMG LABTECH)。
2.4。多路复用ELISA检测滑液细胞因子水平
细胞因子在RA患者的滑液测定使用磁bead-based Bio-Plex 200系统多路复用免疫测定(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。滑液的稀释1:4与Bio-Plex样品稀释剂(10014641;Bio-Rad实验室)。根据协议执行的分析是由制造商指定的试剂(稀释剂、校准器,阻塞试剂,和detecting-antibody混合物)包含在套件。数据分析与Bio-Plex经理执行软件(Bio-Rad实验室)。
2.5。TAM受体对人体滑膜组织的免疫组织化学
RA和OA滑膜组织获得膝关节手术期间内梅亨大学医学中心(奈梅亨,荷兰)被用来确定蛋白质的表达妳的Mer, Tyro3。这种材料被认为是手术剩余材料。程序执行按照荷兰的行为准则负责在医学研究中使用人体组织(https://www.federa.org/code-goed-gebruik)。石蜡包埋滑膜组织部分deparaffinized和水化。抗原检索进行三羟甲基氨基甲烷/乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液pH值(9)加热到60°C Mer和柠檬酸缓冲(pH值6)加热到60°C为妳和Tyro3。内源性过氧化物酶被3%的过氧化氢。部分被封锁与10%正常山羊血清和1%牛血清白蛋白(BSA)在TBS 20分钟前在RT孵化与兔子反妳(1:600;C89E7;细胞信号传导,丹弗斯、马、美国),兔子反Mer (1: 2000;ab52968;Abcam,剑桥,英国),兔子反Tyro3 (1: 500;ab109231; Abcam), or rabbit anti-human IgG (1 : 74000; X0936; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) overnight at 4°C. Subsequently, sections were incubated with biotinylated goat anti-rabbit IgG (1 : 400; PK-6101; Vector Laboratories, Peterborough, UK) for 30 minutes at RT. A biotin-streptavidin horseradish peroxidase detection system was used according to manufacturer’s protocol (PK6101; Vector Laboratories). Bound complexes were visualized with diaminobenzidine (DAB) by incubation for 10 minutes at RT. All antibodies were diluted in 1% BSA in TBS. Sections were counterstained with hematoxylin. Pictures were taken with the Leica DMR microscope (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) at 20x and 40x magnification.
2.6。统计分析
所有的数据进行了分析与GraphPad棱镜软件(版本5.03,圣地亚哥、钙、美国)。数据显示为点阴谋的意思或相关性。使用学生的未配对比较组间进行 - - - - - -测试或协方差分析(图基的事后多重比较检验测试)。连续数据之间的相关性评估使用皮尔逊相关系数。值低于0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。微分在RA滑膜TAM受体的表达
免疫组织化学显示RA患者滑膜组织的差异表达TAM受体在不同的格子里滑膜(图1)。Tyro3-positive细胞识别主要在衬里细胞,而细胞亚系。此外,Tyro3也观察到的表达与血管,特别是内皮细胞。另一方面,血管内皮细胞被Mer负,而Mer-positive细胞中观察到内壁和副线。关于妳的表情,只有细胞滑膜衬里是积极的,没有染色亚系或血管。OA患者滑膜组织被用来控制,同时具有类似区分三个TAM受体的表达。
学习如果斯塔姆受体水平增加在风湿性关节炎患者滑液,sTyro3,方向党,sAxl, Gas6 ELISA测定水平。在RA患者,sTyro3和方向党水平升高而OA患者( 和 ,)(图2(一个)和2 (b))。然而,sAxl和Gas6水平没有显著差异观察RA和OA患者( 和 ,)(图2 (c)和2 (d))。事实上,sAxl Gas6水平与水平在等离子体的RA患者和健康对照组(数据没有显示)。sTyro3之间存在正相关性和方向党配体Gas6滑液(数字3(一个)和3 (b))。另一方面,之间没有显著的相关性被发现与Gas6 sAxl方向党之间也没有,sAxl, sTyro3滑液的RA患者(数字3 (c)- - - - - -3 (f))。值得注意的是,没有差异sTyro3和方向党水平在男性和女性之间的滑液(补充图。S1)观察增加sTyro3和方向党在滑液受到患者的年龄(补充图。S2)。
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3.2。sTyro3与RA滑膜液的促炎细胞因子水平呈正相关
膜结合TAM受体参与自然抗炎反馈机制(8),存在高浓度的斯塔姆滑液,特别是sTyro3和方向党(如图2),可能会增加在RA关节炎症。因此,我们下一个调查如果增加数量的斯塔姆受体配合关键在RA关节炎症分子的存在。事实上,sTyro3水平呈正相关,TNF水平滑液的-α( , ),il - 1β( , ),CXCL8 /引发( , ),和il - 10 ( , )(数据4(一)- - - - - -4 (d)),但是不与il - 6 ( , )(表2在RA患者。除了局部炎症标记物,sTyro3水平也积极与红细胞沉降率(ESR) ( , )(图4 (e)与c反应蛋白水平()和弱却不显著 , )(图4 (f)系统性炎症指标)。相比之下,方向党和地方之间没有显著的相关性被发现血液或ESR、CRP水平细胞因子水平(表2)。类似于sTyro3, Gas6滑液也和大多数的分子呈正相关,除了il - 6, ESR、CRP(表2)。因此,滑液内存在sTyro3显示RA关节炎症的控制,影响疾病的恶化。
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3.3。sTyro3水平RA滑膜液与系统性疾病相关参数和疾病活动的分数
除了炎症有一定的联系,这也是调查如果sTyro3水平关节疾病与全身性疾病相关参数和活动的分数。事实上,sTyro3水平表现出显著相关性DAS28-ESR分数( , )(图5(一个))和sTyro3活动水平高的疾病患者(> 4.0)明显高于低(< 3.2)或中等(3.2 - -4.0)DAS28-ESR分数( )(图5 (b))。此外,sTyro3水平显著高于在类风湿因子(RF)和anticitrullinated蛋白抗体(ACPA)双阳性患者相比,双重否定患者( )(图5 (c))。由于低数量的单一射频(3)和ACPA(2)积极的RA患者登记在这项研究中,统计分析是受损的,虽然他们的意思是sTyro3值与负面的RA患者的两倍。没有明显的方向党和DAS28-ESR(图之间的相关性被发现5 (d)(图)、疾病活动5 (e))或射频,ACPA(图5 (f)),以及Gas6(数字5 (g)- - - - - -5(我))。在一起,这些结果表明sTyro3与RA炎症机制和疾病相关的活动。
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4所示。讨论
在这项研究中,我们表明,在RA患者中,当地sTyro3和方向党水平增加OA患者相比,而sAxl和Gas6水平在RA和OA患者的血浆水平在正常范围内作为健康对照组。此外,滑液水平升高sTyro3与当地相关炎症介质,全身性的参数,和疾病活动评分,表明sTyro3在RA病理作用。
适当efferocytosis在体内平衡或炎症已被证明限制后续的免疫反应。这种效应在免疫耐受的维护至关重要。TAM受体的作用被描述在各种自身免疫性疾病,包括风湿性关节炎、多发性硬化症(MS)、和系统性红斑狼疮(SLE) [28,29日]。在RA的背景下,妳的表达已经被描述在关节的病人30.]。此外,最近的一项研究使用小鼠模型的K / BxN serum-transfer关节炎表明妳所表达的是一种独特的残雪的子集3CR1+tissue-resident巨噬细胞,形成一个内部免疫屏障的滑膜衬里(31日]。这些发现强化我们的数据关于妳在衬里细胞的检测。此外,我们所知,这是第一个工作描述Tyro3的表达和Mer人体滑膜组织的RA患者。
虽然在等离子体测量,徐等人发现了一个类似的结果sTyro3升高和方向党在RA OA患者相比,只有sTyro3水平与一些临床RA的特性,虽然相关性很弱(32]。此外,吴等人报道sTyro3和方向党等离子体水平升高在RA患者与健康对照组相比,虽然等离子sTyro3没有与RA的临床特征23]。在我们的研究中,使用滑液而不是等离子体,我们发现sTyro3水平存在显著的正相关性炎症和疾病活动的成绩,表明滑液sTyro3是一个更可靠的方法相比,RA关节炎症等离子sTyro3水平。虽然我们的研究的重点是当地TAM的分析表达式,等离子体,我们相信我们的数据是互补和强化的结果到目前为止已发表的研究(23,32]。有趣的是,斯塔姆水平变化并不一致,当比较不同关节炎相关的自身免疫性疾病。等离子体水平升高方向党和sAxl报道在系统性红斑狼疮患者23- - - - - -25),而Sjorgen综合征患者提出海拔只有方向党(26]。系统性红斑狼疮、干燥综合征、方向党而不是sTyro3水平似乎与炎症和疾病相关的活动(23,24,26),这表明sTyro3可以更具体的RA疾病病理学。
TAM受体可能是不同监管,表示在不同的细胞类型,在这项研究中,或表现出不同的功能在不同的自身免疫性疾病14]。这可以解释观察可溶性TAM受体的水平的差异以及它们之间缺乏相关性。因此,进一步的研究关于TAM调制的受体在关节炎的背景下是必要的。此外,它被描述,炎症性自身免疫性疾病常常为管制金属蛋白酶活动(33),这表明斯塔姆受体水平的变化在RA患者的确可能是由于微分脱落机制的激活。例如,TAM受体可以减少TAM-mediated抗炎细胞因子信号,从而增加生产,减少膜结合TAM充当诱饵受体,受体捕捉TAM受体配体,从而减少膜结合受体的激活(21,22,34]。的金属蛋白酶ADAM17被描述为一个关键酶的蛋白水解乳沟TAM受体(19,20.,34]。虽然大多数研究在老鼠身上进行,有一些迹象表明ADAM17还负责乳沟TAM受体的人类。例如,慢性肾脏疾病患者增加了等离子体水平方向党和ADAM17 sAxl增加表达单核细胞(35]。此外,不同的工作已经表明ADAM17表达更高的血清和滑液或组织RA OA患者相比(36- - - - - -38]。因此,更高水平的RA滑膜斯塔姆,尤其是sTyro3,损害的重要内源性抗炎分支控制关节炎症。
降低膜结合Tyro3滑膜细胞有直接影响减少关节炎症的控制,有利于sTyro3之间的正相关和局部炎症参数或在RA疾病活动。然而,大部分的知识Tyro3的抗炎特性是通过三重TAM受体敲除的研究,尽管一些研究探索Tyro3个人消炎。例如,中和anti-Tyro3抗体恢复Pros1的影响在人类减少促炎细胞因子的刺激牙龈上皮细胞系Porphyromonas gingivalis有限合伙人(39]。因此,联合TAM的可用性通过清道夫受体配体的性质sTyro3可能有更强的影响在一个缺陷控制在RA关节炎症。在这一点上,TAM受体配体,尤其是Gas6参与炎症的决议40在实验性关节炎[]和现在的保护作用41]。另一方面,方向党勉强结合TAM受体配体(13),削弱其作为诱饵受体的贡献。出于这个原因,减少Mer表面表达的影响由于其脱落的滑液并不足以减少抗炎反馈,解释为什么方向党之间没有相关性观察和细胞因子水平或疾病活动。
sTyro3和sAxl作为有效的配体拮抗剂通过阻断Pros1 Gas6,分别,而方向党表示弱抑制活动向两个配体(13]。在这里,我们表明,sTyro3水平与疾病表型相关,射频和ACPA阳性患者表现出更高的sTyro3水平的两倍。先前的研究已经表明,Gas6和Pros1限制DC成熟的免疫反应的抑制和减少T抗原呈递细胞(42,43]。与射频相关的明显的疾病活动和ACPA双阳性患者可以解释的阻塞TAM配体由于高架sTyro3 RA患者。虽然我们没有见过的显著增加Gas6滑液的RA患者,有增加的趋势( ,图2 (d))。在实验性关节炎,Ruiz-Heiland等人发现水平的提高循环Gas6后诱导的小鼠关节炎模型(44),可以推测是企图控制组织炎症。因此,这可以解释之间的正相关性Gas6 sTyro3和方向党。另一方面,增加当地可溶性TAM受体可以清除TAM配体,只有Gas6就是例子。因此,减少可用性Gas6会损害这个分子由于降低了膜的抗炎功能TAM受体激活。事实上,TAM的保护作用受体配体Gas6 Pros1已经被我们组小鼠关节炎模型(16,17,41]。在这些研究中,Gas6 Pros1过度降低关节炎严重程度,通过减少炎症和通过抑制促炎细胞因子的表达。虽然我们没有测量Pros1在这项研究中,我们认为高水平的滑液sTyro3可能确实清除TAM配体,降低其抗炎功能在RA的组织炎症。
总之,在目前的研究中,我们表明,sTyro3和水平方向党在RA患者的滑液增加,而只有sTyro3与炎症和疾病有关的参数。这表明sTyro3 RA疾病病理作用,特别是在射频和ACPA-positive病人。进一步需要功能性的研究来阐明发展的sTyro3 RA的作用,调查是否sTyro3是一个标记,将有助于评估RA疾病活动和局部炎症。
数据可用性
所有相关数据在论文及其支持信息文件。
附加分
关键信息。TAM受体表达在不同的地点在滑膜组织(衬里,副线,血管)。可溶性Tyro3和可溶性Mer水平增加RA患者相比,OA患者滑液。在RA患者中,滑液中可溶性Tyro3积极与关节炎症和疾病有关的活动。
的利益冲突
没有利益冲突。
确认
我们感谢Birgitte沃尔格林帮助免疫组织化学染色,Monique Helsen执行,影院ELISA和实验风湿病学部门有用的对话。这项工作是支持的荷兰关节炎基金会(rf15 - 2 - 403和rn19 - 1 - 204)。
补充材料
图S1:滑液中的可溶性TAM受体水平的男性和女性类风湿性关节炎。可溶性Tyro3 (sTyro3) (A)、可溶性Mer(方向党)(B),可溶性妳(sAxl) (C)和Gas6 (D)水平在男性和女性类风湿性关节炎患者的滑液( )。提出了数据点的情节与意味着未配对 - - - - - -测试。图S2:可溶性TAM受体水平和年龄之间的关系。可溶性Tyro3之间的关系(sTyro3) (A)、可溶性Mer(方向党)(B),可溶性妳(sAxl) (C)和Gas6 (D)水平滑液和类风湿性关节炎患者的年龄在岁( )。数据提出了皮尔森值( )和值( )为每一个相关性。(补充材料)