通过绿色萃取方法中的各种茶提取物的抗氧化和抗黑素瘤效应

摘要

茶(茶树)含有抗氧化元素的高水平，是一个众所周知的饮料全球所消耗。这项研究的目的是不同浓度的绿茶，红茶，乌龙茶861，乌龙茶732，和茉莉绿茶的比较。这五种茶提取物的物已知具有抗氧化特性，还原能力，和金属离子螯合活性。目前的研究相比，对人的恶性黑色素瘤的抑制效应而言这五个提取物：A2058和A375。为了确定正常细胞和恶性黑色素瘤细胞之间的细胞活力，MTT测定施加到评估对人黑素瘤细胞的细胞毒潜力，与所有茶提取物表示随着茶的提取物浓度降低细胞存活力。细胞毒性上的HaCat（正常皮肤细胞）显示出在较低浓度下的茶叶提取物对细胞存活率没有影响。这些结果表明的保护抗氧化及黑色素瘤的生产，绿茶和显示时对恶性黑色素瘤细胞中测试的最低细胞活力茉莉绿茶不同茶树提取物的抗氧化作用。

1.介绍

从天然植物中提取的抗氧化化合物可以通过减少氧化应激，帮助人类皮肤保持生理健康状态[1］.通过减少活性氧(ROS)引起的氧化应激，抗氧化化合物可以防止ROS引起的皮肤损伤[2］.氧化产生自由基，可能导致连锁反应，这可能导致电池损坏。为了检测抗氧化剂的清除自由基的能力，1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）通常用于[3.］.研究了不同类型茶叶提取物的抗氧化活性。螯合能力涉及到中心金属离子与大分子(配体)连接，形成环状结构。铁还原电位分析是分析抗氧化性能的另一种方法，它涉及到抗氧化剂与2,4,5-三吡啶- s -三嗪铁(III) (TPTZ)配合物反应的还原能力的量化，该配合物形成黑色的铁(II)-TPTZ配合物[4］.A2058是从一个43岁男性患者，恶性黑色素瘤的高侵入性的细胞系。A375是从54岁的女性患者，恶性黑色素瘤细胞系。HaCaT细胞永生化人角质形成细胞，其用于表皮稳态的研究[5］.

黑色素瘤通常开始从黑素细胞，其是所述细胞产生黑色素。黑色素瘤往往在早期阶段，从皮肤上的痣黑色素细胞内的起源。然而，当治疗是无效的，黑色素瘤细胞迅速蔓延，发生转移性黑素瘤。紫外（UV）射线的黑色素瘤的已知原因之一[6］.我们的皮肤有能力保护我们不受外部因素的影响，控制体温，储存水分和脂肪。然而，皮肤癌是在长时间的阳光照射下发生的，导致良性或恶性肿瘤的癌变，这是目前患者死亡的主要原因[7］.

茶是世界闻名的饮料。茶多酚具有抗氧化作用，包括表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表没食子酸酯(ECG)。EGCG是茶叶中含量最丰富的儿茶素，占绿茶干叶总多酚的30%，从蒸煮或煎炸到使内源性多酚氧化酶(PPO)失活[8］.绿茶通常比乌龙茶或红茶具有更高的抗氧化潜力，因为它的EGCG和EGC含量较高。红茶还具有抗氧化特性，具有清除自由基、抑制脂质过氧化和螯合金属离子的能力[9］.没食子酸是红茶的主要成分之一，它能通过细胞毒性作用对抗癌细胞[10.］.乌龙茶是一种半发酵的84茶，含有大量的茶多酚和最强的抗氧化活性[11.］.茉莉花茶是绿茶的一种变体，与普通绿茶相比，茉莉花茶的香味传递过程多了一个步骤。茉莉花茶可以减轻食道肿瘤负担，但缺乏流行病学研究[12.］.

2.材料和方法

2.1。化学品和试剂

抗坏血酸（维生素C），乙二胺四乙酸（EDTA），L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA），二甲基亚砜（DMSO），1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH），乙醇，ferrouschloride（的FeCl₂·4H₂O），氯化铁（的FeCl_3.)、曲酸、甲醇、铁氰化钾(K_3.铁(CN)₆），3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT），3-叔丁基-4-羟基苯甲醚（BHA），和L-酪氨酸购自Sigma-Aldrich公司Company购买（圣路易斯，密苏里州，美国）。Dulbecco氏改进的Eagle培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS）购自Gibco BRL（Gaithersburg的，MD，USA）获得。

２.２.茶叶提取物的加工与制备

所有五种茶提取物都是用类似的方法制备的。绿茶在280-300°C下搅拌5-6分钟[13.］.茉莉花绿茶、红茶、乌龙茶在室温下在室内自然干燥(室内萎蔫)。然后，乌龙茶的茶叶被搬到一个竹篮，翻来覆去，把茶叶弄伤。用CTC(切、撕、卷)机反复卷干。焙烤的乌龙茶732还要在100-120°C下焙烤4小时，以产生焙烤风味。红茶由CTC机器碾压，用于擦伤和损坏茶叶，然后在40°C氧化茶多酚(茶发酵)2-3小时。所有五种茶叶的最后干燥是在80-120°C。所有5片茶叶都用85-95°C的热水提取，每公斤茶叶用5升热水，制成固体含量为5%的肉汤，用10微米PP滤袋过滤。真空浓缩后，浓度提高到20% w/v。添加麦芽糖糊精，使提取液的麦芽糖糊精比例为2:1(20%茶叶可溶性含量，10%麦芽糖糊精w/v)。 The tea concentrates were then frozen at −35°C, followed by lyophilization for 72 hours (0–50 hours at below 0°C, 50–72 hours increasing to 45°C) and pulverization to produce a fine tea extract powder.

２.３.抗氧化作用的测定

2.3.1。DPPH自由基清除活性测定

DPPH测定法是一种抗氧化测定法，用于监测抗氧化剂清除自由基的能力，其中稳定的自由辐射呈深紫色[14.］.DPPH溶液遇到自由基清除化合物时会变成亮黄色。1、5、10、50和100 (μg/ml)加入DPPH溶液中。DPPH与抗氧化剂反应释放氢，在517 nm处吸光度值降低，呈亮黄色，清除DPPH能力强。以维生素C为阳性对照。自由基清除活性的计算公式为:

2.3.2。金属螯合活性测定

铁离子(Fe^２＋)进行了测试。将不同浓度范围的茶叶样品溶于DMSO中，加入10μ的FeCl L的溶液₂·4H₂O(2毫米)。二十μL加入二茂铁，混合10分钟[15.］.反应后，监测562 nm处的吸光度。以EDTA作为阳性对照。金属螯合活性的计算公式为(1）.

2.3.3。降低功耗分析

对于提取物的还原能力的能力的测定，将不同浓度范围各茶提取物与85混合 μL 67mm磷酸钠缓冲液(pH 6.8)和2.5μL (20% K)_3.铁(CN)₆考察提取物的还原能力。将混合物在50℃保存20分钟，在室温下离心10分钟 ．然后将上清液与2%的FeCl混合_3.以BHA溶液为阳性对照，在700 nm波长下测定吸光度[7］.高吸光度值对应着高的金属离子还原能力。

2.4。细胞系培养

人黑色素瘤细胞系从台湾生物资源收集研究中心获得:A2058 (BCRC编号60039)，A375 (BCRC编号60263)，HaCat(人皮肤角质形成细胞)在角质形成细胞- sfm (Gibco，美国)补充牛垂体提取物和人重组表皮生长因子[16.］.

2．5．MTT试验

MTT法测定细胞活力[17.］.细胞被电镀，密度为  cells/well in a 96-well plate and incubated for 24 hours before the additions of the 1, 10, and 50 (μg/ml)，然后在每孔中加入MTT溶液。然后丢弃培养基，在每孔中加入DMSO。测定福马赞盐在595 nm处的吸光度，计算细胞活力如下式:

3.结果

3．1.DPPH自由基清除活性测定

DPPH法旨在检测抗氧化剂清除自由基的能力。当DPPH自由基被中和后，溶液由蓝紫色变为淡黄色，在517 nm处测定吸光度。颜色越浅，抗氧化能力越强。表格1以维生素C为阳性对照，以麦芽糊精为阴性对照，对5种不同茶叶提取物进行了实验研究。总的来说，茶提取物浓度越高，清除DPPH的能力越强。然而，对于所有五种茶提取物，50μG /ml往往表现出高于或相当于100的抗氧化能力μ克/毫升。结果表明，绿茶对自由基的清除作用最大。乌龙茶提取物861的抗氧化性明显高于乌龙茶提取物732，这可能是由于它们在加工过程中的不同。

３．２．金属螯合活性测定

在氧化环境中，二茂铁与铁形成络合物^２＋．当有螯合材料存在时，这种复杂的结构就会发生错位。当铁^２＋与二茂铁在562 nm处发生反应，表现出较高的螯合能力。五种不同的茶提取物含有铁^２＋清除活性在1-100范围内μ克/毫升。其中乌龙茶提取物价值最高 在100μ克/毫升。茉莉绿茶表现出最高的螯合能力 10点μ克/毫升。与其他化合物相比，它具有获得更高的螯合能力所需的最低浓度。

3.3。降低功耗分析

对茶提取物的铁离子螯合活性进行了研究，见表3.．在实验过程中，通过监测其溶液颜色的变化来确定茶叶提取物的还原性能，当Fe(II)-TPTZ络合物形成时，其溶液颜色由淡黄色变为蓝紫色。颜色越深，还原力越好。表格3.表明红茶提取物和乌龙茶提取物861的还原力 在50岁μ克/毫升, 在50岁μ分别g / mL。结果表明，当浓度达到100时，还原能力下降μ克/毫升。

3．4．MTT试验

用MTT法测定茶叶提取物对细胞发育的影响，MTT法是一种评估细胞活力的比色法。这种分析是基于脱氢酶的细胞系，从浅黄色的MTT的四唑变成蓝色的MTT的福玛氮。从图1，可以看出，当浓度为1时μ米和10μm, 5种茶提取物的HaCat活力表现出相同的规律。如图所示2， 5种茶提取物在A375细胞株上的活力模式与图中A2058细胞株的活力模式相似3.，因为两者都是恶性黑色素瘤细胞。红茶提取物和乌龙茶提取物732对A375细胞活力呈剂量依赖性降低，绿茶提取物和茉莉花绿茶提取物对A2058细胞活力呈剂量依赖性降低。

4.讨论

茶是一种受欢迎的传统饮料，以其抗癌、抗氧化等生理功能而闻名。在本研究中，茶叶提取物由茶树进行了分析;这些是绿茶、红茶、乌龙茶和茉莉花绿茶。本研究通过测定5种不同茶叶提取物对DPPH的清除能力、螯合活性和还原能力来研究其抗氧化作用。以维生素C为阳性对照，麦芽糊精为阴性对照，测定其抗氧化能力，并与不同类型、不同浓度的茶进行比较。研究发现，高浓度的茶叶提取物对人体细胞有深远的影响。5种茶提取物均表现出较强的DPPH清除能力和螯合活性。与乌龙茶提取物861相比，乌龙茶提取物732是通过额外的高温焙烧步骤制成的。热处理可降解儿茶素，这可能是乌龙茶提取物732清除DPPH能力较低的原因。

在这项研究中，所有茶叶提取物的浓度为50μg/mL对DPPH的清除能力最强(表2)1）.事实上，茶多酚是茶中的主要抗氧化剂[18.］.五种茶叶提取物进行调查他们的螯合作用进一步分析。乌龙茶提取物861具有最高的螯合值 在测试的最高浓度(100μ克/毫升）（表2）.然而，所有的茶提取物都显示出最高的还原能力在50μ克/毫升（表3.）.这种模式与表中DPPH的清除能力相似1［19.，20.］.

黑色素瘤是一种恶性肿瘤，始于一种特定类型的皮肤细胞，当异常细胞影响身体的某些部位并无法控制地增殖时，黑色素瘤就会被激活。21］.研究人员还研究了五种茶提取物对两种不同的黑色素瘤细胞(A2058和A375)以及作为非癌细胞系的HaCat细胞的细胞毒性潜力[22采用MTT法测定。用不同浓度(1、10和50)处理这些细胞系μM)，以作比较。对于HaCat细胞，五种茶提取物在50μM的影响较小，24小时治疗后，所有细胞的存活率均超过65%。因此，茶提取物对非癌症的人体细胞没有毒性作用。A375和A2058都是受损的、高度侵袭性的黑色素瘤细胞系[23］.所有五种茶提取物在10μ米和50μM在测试的两种人类黑色素瘤细胞上都显示出细胞毒性。茶叶的非热加工可能会影响茶产品的生物活性，因此通过采用绿色物理加工可以实现食品质量的改善。

五，结论

综上所述，本实验通过5种茶提取物的DPPH自由基活性、螯合活性和还原能力来证实其抗氧化活性。高浓度的茶提取物有可能成为一种癌症治疗方法。结果表明，所有五种被研究的茶提取物都是有前途的天然抗氧化剂和潜在的抗黑色素瘤药物，对非癌症人类细胞没有毒性。

的利益冲突

作者在发表本研究方面没有利益冲突。

作者的贡献

陈一辉，黄俊银，林益驰，林一凡，卢怡如，刘立恒，王慧敏，构思和设计实验;Yihui Chen进行实验并分析数据;I-Fan Lin贡献了试剂、材料和分析工具;黄俊银，林益驰，林一凡，陆益茹，刘立恒，王慧敏撰写论文。陈一辉、黄俊银对这项工作贡献相当。

致谢

基金资助:台湾科技部项目(no . MOST 104-2221-E-005-096-MY2和no . MOST 104-2628-E-005-004-MY3)。作者也感谢台湾高雄医科大学干细胞研究中心KMU-TP104G00、KMU-TP104G01和KMU-TP104G02-05的项目。

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