文摘

本研究旨在确定关键microrna在流通,预测持续的β细胞破坏和再生的新诊断的儿童1型糖尿病(近年来)。我们比较血清microrna的表达水平新发病近年来儿童和年龄健康对照组及相关microrna表达β细胞功能和血糖控制水平。全球血清microrna的测序分析从两组内转至池(n= 275年和129年,分别地。)和一个对照组(n= 151)。我们确定了十二个调节人类microrna内转至患者(mir - 152、miR-30a-5p mir - 181 a, miR-24, mir - 148 a, mir - 210, miR-27a, miR-29a, miR-26a, miR-27b, miR-25, mir - 200 - a);其中的几个microrna与细胞凋亡和胰腺β-细胞网络。此外,我们认为miR-25与残余β细胞功能相关的负面(美国东部时间:−0.12,P= 0.0037),积极与血糖控制(糖化血红蛋白)(美国东部时间:0.11,P= 0.0035)3个月后发病。总之这项研究表明miR-25可能是一个“组织”microrna的3个月后血糖控制诊断新发病近年来儿童,因此支持循环microrna的角色作为组织生理病理学的预测生物标志物和潜在干预的目标。

1。介绍

1作为自身免疫性disease-type糖尿病(近年来)胰岛素生产细胞的免疫介导的破坏结果反映在胰腺自身抗体的出现。的破坏这些细胞意味着进步,不可逆损失的内源性胰岛素的分泌,导致日常用外源性胰岛素治疗。

时诊断与近年来估计一个孩子失去了约。80 - 90%的胰岛素生产β细胞功能/质量。最初的胰岛素治疗后不久,几个孩子经历一段时间的增加内源性胰岛素分泌降低外源性胰岛素的需要,称为缓解阶段(1]。再生潜力存在在这个时间间隔尤其是儿童提供了独特的干预治疗的可能性,也就是说,与胰腺β-细胞生长因子维持个体胰岛素的分泌,改善血糖控制和更少的并发症在眼睛,肾脏和神经。

研究的假设是,潜在的新生物标志物(血清microrna和/或microrna的模式)与新诊断儿童内转至可以预测破坏或内生残余β细胞的再生功能。microrna是小非编码rna参与转录后的调控的蛋白质翻译通过信使rna不稳定或抑制(2,3]。microrna在坚实的组织和细胞培养样本,和一些研究证实他们的存在在血液、体液唾液,尿液和血清(4- - - - - -7]。血清microrna的稳定性已经调查了在恶劣条件下包括沸腾,低/高pH值,扩展存储和冻融循环参与血清样本相比没有显著差异(8]。综合这些结果表明,血清microrna是稳定的,他们可能反映了细胞障碍在各种慢性疾病。此外,一些microrna显然有一个角色例如,在代谢途径miR-33a / b抑制在非人灵长类动物提高血浆高密度脂蛋白胆固醇和降低甘油三酸酯(9,沉默miR103/107似乎有益对胰岛素敏感性的影响可能通过其目标基因在肥胖小鼠caveolin-1关键调节器的胰岛素受体(10]。

因此,当前的研究的目的是确定新的生物标志物(关键microrna / microrna的模式),这是毁灭的预测或内生残余β细胞的再生功能通过调查microrna的血清样本最近诊断为近年来患者和年龄组。

2。方法

2.1。研究群

血清样本两个独特内转组和一个对照组microrna的表达进行分析。

2.2。国际缓解期组(Hvidoere队列)

Hvidoere缓解期组是一个纵向,观测的新诊断近年来儿童收集通过18儿科中心主要在欧洲11]。血液样本集中确定糖化血红蛋白,刺激c -肽、胰高血糖素、肠促胰岛素激素、细胞因子、免疫学、和前瞻性地收集了DNA meal-stimulated测试1、6和12个月后糖尿病发病。275患者被纳入研究。

2.3。丹麦缓解队列

丹麦缓解期组包括新的发病近年来儿童在四个丹麦儿科中心接受治疗。类似于Hvidoere队列研究设计,除了包含三个月meal-stimulated测试。129名儿童被包括在研究[12]。

2.4。哥本哈根青春期健康控制孩子(研究)

健康对照组由男孩和女孩之间的6.7和13.7年,从哥本哈根地区公立学校招募作为混合的横断面和纵向研究的一部分,哥本哈根青春期研究[13,14]。信息在性别、年龄、青春期的阶段,身高和体重记录。代谢参数的血液样本进行分析(葡萄糖、胰岛素、胆固醇和甘油三酯)。151名儿童被纳入本研究。

2.5。microrna的净化、Solexa测序和定量rt - pcr

工作流程分为三个步骤:(i)初步筛选的高通量测序Solexa使用混合血清样本,(ii)中存在大量个体的血清样本中验证安排在多个训练集和测试集,和(3)统计评价的诊断或预后价值血清microrna测定系统。

2.5.1。血清池和microrna的净化

血清池准备从所有三个军团。从100年Hvidoere队列μL血清从275名儿童池,从丹麦队列200人μL血清从129名儿童池,最后200μL血清从151名健康控制儿童池。总RNA提取血清池使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。此外,总RNA中所有个体三个军团(Hvidoere,丹麦和健康对照组)被孤立和储存在−候选人microrna的80°C后测试。

2.5.2。Solexa测序

混合样本3组(5 - 10μg RNA)测序在Solexa测序平台(Illumina公司)。页面净化后的30岁以下的小RNA分子基地和结扎一对Solexa 5′和3′端适配器,使用适配器被放大的小分子RNA引物17周期,和碎片在90个基点(小RNA +适配器)从琼脂糖凝胶被孤立。纯化的DNA直接用于集群生成和使用Illumina公司基因组测序分析分析仪IIx根据制造商的指示。图像文件生成的音序器,加工生产digital-quality数据。屏蔽后适配器序列和移除受污染的读取,读取被处理干净在网上如前所述(分析8]。后比较对照组血清microrna的概要文件和病人,不同小组(所定义的拷贝数> 100和2倍改变表达式)表示microrna是派生的。

2.5.3。定量rt - pcr的成熟的microrna

成熟的microrna量化进行了使用Taqman microrna的探针(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)根据制造商的指示。简单地说,2μL的总RNA reverse-transcribed cDNA茎环结构RT使用lamv逆转录酶和引物(应用生物系统公司)。实时PCR进行使用TaqMan PCR试剂盒应用生物系统公司7300序列检测系统(应用生物系统公司)。所有的反应,包括non-template控制,运行一式三份。24候选人microrna被存在重新进行分析对个人样本。我们检查了候选人microrna的表达水平的一个子集群组成的108名患者(月丹麦缓解期组和12个月的样本样本Hvidoere队列)和54控制。

2.6。统计数据

的群体比较每个microrna的分别研究了群组功能,年龄和性别在对数刻度。所有的比较都是调整业务的多个测试方法。

microrna协会统计评估疾病进展(端点:刺激c -肽和糖化血红蛋白)是由多重线性回归分析调整年龄和性别。microrna的表达了转换值(给定microrna的Ct值之间的差异和引用microrna(三个microrna let-7家族)的结合;所有的值代表一式三份的geometricmean措施)。刺激研究了c -肽在对数尺度获得正态分布,而糖化血红蛋白是正态分布。结果理解为实际糖化血红蛋白值的变化(%)和c -肽刺激对应的百分比变化范围25百分位和75百分位(四分位范围)的值相关的microrna。数据分析使用SAS(9.2版本,SAS研究所;卡里,NC)。一个P值< 0.05的被认为是具有统计学意义。

2.7。伦理批准

伦理审批获得Hvidoere和丹麦缓解阶段研究允许样品分析microrna (KA 99063 KA 04010通用、职责)。哥本哈根青春期研究(ClinicalTrialsGov ID NCT01411527)包括额外的遗传和表观遗传研究伦理委员会批准(KF 01 282212和V200.1996/90)。

3所示。结果

3.1。比较血清microrna表达水平之间的两个儿科1型糖尿病组和一个同龄对照组

血清microrna是纯化从从每个队列(血清样本1月后诊断为糖尿病组),和microrna的存在和水平被全球Solexa测序鉴定。我们确定了总共240个不同的microrna从这些军团;这相当于约。15%的所有已知的人类microrna(1527人类microrna miRbase18标识)。47个microrna满足我们的标准之间的微分表达式糖尿病组和对照组(> 100拷贝数和二倍改变表达式)。这些24 microrna (mir - 103、miR-10a mir - 125 b, mir - 134, mir - 199 a, mir - 200 c, miR-21, miR-26b, miR-29b, mir - 340, mir - 320 a, mir - 222, mir - 152, miR-30a-5p, mir - 181 a, miR-24, mir - 148 a, mir - 210, miR-27a, miR-29a, miR-26a, miR-27b, miR-25,和mir - 200 a)被选为进一步分析中存在的一个子集(n每个队列= 54)的样本。始终我们发现所有24 microrna调节Solexa测序和qPCR分析。的组合的三个microrna let-7家庭被用作参考正常化microrna的表达水平来衡量存在。通过回归分析调整了年龄、性别、和多个测试我们发现12个microrna (mir - 152、miR-30a-5p mir - 181 a, miR-24, mir - 148 a, mir - 210, miR-27a, miR-29a, miR-26a, miR-27b, miR-25,和mir - 200 a)明显差异表达或糖尿病组和对照组之间的一个糖尿病组和对照组(表1)(P< 0.05)。的这12个microrna的值呈现在图1。

3.2。合格的microrna与儿童疾病进展与新发病1型糖尿病

合格的microrna的微分表达式模式之间的案件中存在的分析和控制分析的两组糖尿病协会与疾病进展。疾病进展被评估的血糖控制糖化血红蛋白或残余β细胞功能估计刺激c -肽。在丹麦队列miR-25测量在发病后1个月与糖化血红蛋白水平相关的消极和积极刺激c -肽水平3个月后发病。回归分析表明,糖化血红蛋白浓度下降了0.22% (0.08 - -0.37)(P= 0.0035)和22.4% (8.3 - -34.3)(P= 0.0037)增加25 - 75四分位范围之间的刺激c -肽ΔmiR-25(数字2(一个)和2 (b))。miR-25以发病后12个月内与刺激无关c -肽或糖化血红蛋白Hvidoere队列(数据没有显示)。此外,我们分析了12个合格的microrna之间的联系和胰腺自身抗体(迦得、IA IA-2A和ZnT8Ab)(数据没有显示)。我们没有发现这些参数的人群之间的联系。

4所示。讨论

这是第一个研究比较血清样本中miRNA级别的孩子或没有内转。血清样本从大约400新发病近年来儿童和150名健康年龄组进行分析。12例和控制之间的差异表达microrna。其中的几个microrna参与调节细胞凋亡(mir - 181 a、miR-24 miR-25, mir - 210,和miR-26a) (15- - - - - -19)和β细胞监管网络(miR-24, mir - 148 a, mir - 200 a,和miR-29a) (20.]。更重要的是,我们发现不少microrna与未知的相关函数内转mir - 152和miR-30a-5p。

microrna是已知的转录后的基因调控中发挥核心作用,参与许多细胞过程、分化、增殖、凋亡等(20.]。microrna在游离循环检测,也就是说,血浆和血清,因此研究了作为非侵入性生物标志物在一些疾病和病理过程。在2型糖尿病(T2D)的特点是慢性海拔的血糖水平和胰岛素抵抗,一项研究发现了一个独特的等离子体对T2D microrna的签名,包括miR-15a水平降低,miR-20b, miR-21, miR-24, mir - 126, mir - 191, mir - 197, mir - 223, mir - 320, mir - 486和miR-28-3p水平升高。有趣的是,减少一些microrna的水平(mir - 126、miR-15a和mir - 223)几年前已经检测糖尿病的表现(21]。其中,只有miR-24重叠与我们的观察。miR-24是细胞凋亡的监管机构(16)和TGFβ信号(22]暗示作用,炎症两内转T2D发展(这是很重要的23]。香港的研究等。24]分析了七个糖尿病引起的血清microrna的候选人从newlydiagnosed T2D病人,前驱糖尿病的健康受试者和发现miR-34a T2D的最强的预测。没有重叠的标记被Zampetaki et al。21观察。

当前循环生物标志物近年来和残余β细胞功能是基于特定的免疫球蛋白(抗体)和c -肽测量是昂贵和费时的常规临床设置。开发新的蛋白质生物标记物通常是相当麻烦的,因为血液中蛋白质成分的复杂性,多样性的转译后的修改,许多蛋白质的丰度低,在发展高灵敏度分析和挑战。

microrna的精确细胞释放的机制在很大程度上是未知的,因此,循环microrna的作用是不能完全理解。然而,microrna吸引力的生物标志物提供了许多功能:稳定与进化的保护,因为他们可以通过实时PCR检测,化验可以和特定的高度敏感。

有趣的是我们发现miR-25与更好的血糖控制和残余β细胞功能。有几项研究连接miR-25不同病理条件尤其是癌症。几个报告将高血清miR-25与乳腺癌、非小细胞肺癌和肝癌8,25- - - - - -27]。此外,miR-25被发现被表达在一些恶性细胞系(卵巢癌细胞系和胆管癌),它参与细胞凋亡和细胞增殖的调控目标proapoptotic蛋白质Bim和小道(TNF-related凋亡诱导配体)17,28]。一项研究在一个实验性糖尿病肾病模型研究microrna在NADPH的规定表达在高血糖症和发现miR-25显著降低肾脏从这些动物18]。我们目前发现患者的残余β细胞功能改善的高水平的miR-25符合这些结果,表明一个角色的miR-25胰腺的内分泌细胞的细胞增殖。这也是支持的缺乏miR-25和自身免疫的程度之间的联系(如评估自身抗体的存在)在我们的研究中。改进的c -肽刺激和更好的糖化血红蛋白水平之间的一致性支持这microrna在疾病进展的潜在作用在这些孩子,这就是尽管数量有限的个人纳入本研究。

这项研究提供了启发性的证据microrna的作用近年来临床适用的生物标志物。协会miR-25改善血糖控制和更好的残余β细胞功能可能表明这microrna的可能是一种重要的生物标志物,可在早期和集约化经营的新诊断糖尿病改善血糖控制,减少微血管并发症。这些发现应该确认在一个独立研究人口;然而,我们目前正在调查miR-25水平在所有患者在不同的时间点在我们的研究人群疾病进展。即可形成本研究可以作为模型使用microrna临床相关的生物标记物,他们可能将被用作有益的预测评估临床有意义的变化,干预疗法旨在保存在新发病近年来/β细胞再生功能。

5。结论

这项研究表明,12个microrna表达水平增加新发病近年来儿童与健康对照组相比。此外,残留胰腺β-细胞功能和血糖控制后3个月的临床疾病与miR-25表达水平诊断后不久。这些发现表明microrna的潜在作用的理解疾病机制在早期的时间点;这些知识可能在未来转化为优化和个性化的糖尿病管理(基础研究到临床应用)的患者受益。

缩写

近年来:	1型糖尿病
microrna的:	微
高密度脂蛋白:	高密度脂蛋白
存在:	定量实时聚合酶连锁反应。

作者的贡献

作者的贡献同样出版。

确认

作者感谢参与者从Hvidoere儿童糖尿病研究小组,丹麦缓解阶段研究中,哥本哈根青春期研究贡献血清样本研究。c .小王是诺和诺德公司支持的明星项目。c . Bang-Bertelsen和f . Pocit支持丹麦战略研究委员会的资助。