文摘

小分子核糖核酸(microrna)是一类小型非编码rna扮演重要的角色在协调和扩大范围广泛的生物活性。mir - 375表达胰腺的选择性。我们曾表明,选择性的表达mir - 375在胰腺β细胞是由通过塔塔盒子的启动子转录机制的操作。mir - 375的表达一直在报道non-beta细胞内分泌胰腺内,事实上mir - 375的失活导致扰动在细胞质量和数量的α和β细胞。整个内分泌胰腺的表达式,我们现在表明,mir - 375基因的启动子显示在胰腺内分泌α细胞选择性活动,与观察β细胞。我们发现小说-监管元素位于下游的mir - 375基因转录启动站点。通过生成荧光素酶报告基因,我们现在表明,序列功能当定位不同的启动子上游,从而证明阻遏效应介导的至少部分在转录水平。进一步描述的转录控制机制调节mir - 375和其他胰腺microrna的表达将有助于更好的理解胰腺发育和功能。

1。介绍

为了实现其专业功能控制代谢激素的分泌,胰腺内分泌细胞必须严格规范的表达特性的基因。这是通过一组复杂的介导转录和转录后调控机制(1,2]。最近microrna已被证明在这一过程中扮演着重要的角色:因此,实验中条件删除小礼帽,microrna的成熟所需的酶,揭示了参与发展的microrna外分泌和内分泌胰腺隔间(3),以及在成熟的β细胞功能(4]。

尽管花费了大量精力来理解机制miRNA-mediated抑制基因表达的5,6),少即是已知的有关机制控制microrna的表达。这部分是由于技术上的限制:许多microrna基因嵌入其他基因的外显子和内含子(7),复杂的转录分析和处理模式。此外,转录起始点的识别,识别转录启动子中的一个常见的第一步是更具挑战性的microrna基因编码,自5′末端序列的主要记录迅速处理。

它已经表明,mir - 375基因表达有选择地在胰腺内分泌细胞(8,9]。事实上mir - 375对胰腺内分泌功能至关重要,因为失活导致葡萄糖稳态涉及增加α细胞质量和减少β细胞群(10]。我们已经检查了这个选择性mir - 375的表达机制。我们有mir - 375基因的启动子特征,表明它显示优惠活动β细胞系转染后,和已经确定了一些重要独联体区域内启动子元素(11]。我们现在报告,启动子特征也有选择性地活跃在α细胞和启动子活性的关键cis元素的作用。我们也有进一步的负面特征的监管元素位于mir - 375基因的转录区域,证明该元素在转录水平。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

以下建立细胞系被用于这项研究:打击M2.2.2(仓鼠β(细胞)12),βTC1(鼠标β(细胞)13),αTC1(鼠标α(细胞)14),NIH-3T3(小鼠成纤维细胞),MIN6(鼠标β(细胞)15),Ltk−(小鼠成纤维细胞)和AR4-2J(老鼠的外分泌胰腺细胞)16]。αTC1、βTC1、打击和NIH-3T3细胞生长在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)补充10%胎牛血清(FCS)、青霉素(200国际单位/毫升),和链霉素(100μg / mL)。Ltk−生长在DMEM和AR4-2J补充10% FCS, 2毫米谷酰胺,青霉素(200国际单位/毫升),和链霉素(100μg / mL)。MIN6细胞种植在DMEM猎鹰组织培养板包含10毫米葡萄糖,补充15% FCS,青霉素(200国际单位/毫升),和链霉素(100μg / mL)、谷酰胺2毫米和72毫米beta-mercaptoethanol。

2.2。RNA制备和定量PCR反应

RNA提取的αTC1、βTC1、MIN6 AR4-2J, Ltk−使用miRNeasy工具包(试剂盒)和细胞治疗与Turbo-DNase (Ambion)。RNA治疗(1μg)使用miScript reverse-transcribed工具包(试剂盒)。定量PCR反应是使用2 ng cDNA,对应mir - 375和200 nM寡核苷酸,mir - 106 - b或U6, 7.5μL电力SYBR-Green PCR反应混合液(应用生物系统公司)。

mir - 375引物5′TTTGTTCGTTCGGCTCGC 3′, 5′GATTGAATCGAGCACCAGTTACG 3′;mir - 106 b引物是:5′TAAAGTGCTGACAGTGCAGAT 3′, 5′GATTGAATCGAGCACCAGTTACG 3′;U6引物5′GATGACACGCAAATTCGTGAA 3′, 5′GATTGAATCGAGCACCAGTTACG 3′。

定量PCR反应进行的AB 7300序列检测系统。mir - 375的表达和mir - 106 b是U6 RNA的规范化。

2.3。质粒构建和瞬时转染

质粒操作和定点诱变进行如前所述[11]。转染进行使用转染试剂jetPEI (Polyplus转染)根据制造商的指示。转染48小时后,细胞收获使用被动裂解缓冲(Promega)和提取受到化验以确定记者酶的活性。

2.4。荧光素酶检测

萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶检测进行了如下:完整的细胞包含5-50提取μg (1 - 5μL)的蛋白质被添加到100μL的萤火虫荧光素酶检测缓冲区(EDTA Tricine 20毫米,0.1毫米,1.07毫米(MgCO3)4毫克(哦)2 5 h2啊,2.67毫米MgSO4,270年3.3毫米德勤μ辅酶A, 470μ荧光素(Promega)和530μM ATP, pH值7.8。)或Renilla荧光素酶检测缓冲区(0.1 K2HPO4和0.1 KH2阿宝4,pH值7.4和0.5μM coelenterazine (Calbiochem))。样本放在一个光度计(LUMAC Biocounter M2500或模量微型板块,特纳生物系统),光输出决心超过10秒的时间间隔。萤火虫荧光素酶活动规范化的活动Renilla荧光素酶。

3所示。结果

先前的研究显示,mir - 375表达有选择地在胰岛细胞9,10]。为了比较表达式在几个胰腺癌细胞系,我们进行了定量逆转录酶聚合酶链反应(存在)的RNA样品分析隔绝细胞系来源于胰腺内分泌细胞α(αTC1),胰腺内分泌β细胞(βTC1和MIN6),胰腺外分泌细胞(AR4-2J),和从non-pancreatic细胞(Ltk−)。我们观察到类似mir - 375所有的胰腺细胞水平测试,包括外分泌细胞:另一方面,mir - 375水平至少在non-pancreatic细胞(Ltk低100倍−)(图1)。相比之下,我们确定的mir - 106 b的表达,表达了在广泛的细胞类型(http://www.microrna.org/)。虽然mir - 106 b的表达是在胰腺行测试类似,但仍然显著水平较低的表达在Ltk观察−细胞。这些结果证实mir - 375的表达在胰α细胞表达和代表第一个示范mir - 375的外分泌胰腺细胞。表达式可能没有被观察到以前,因为高水平的核糖核酸酶在外分泌胰腺组织可以检测RNA技术挑战性。


图1
mir - 375的表达水平和mir - 106 b在β细胞行(βTC1和MIN6),α细胞线(αTC1)、外分泌细胞系(AR4-2J)和成纤维细胞(Ltk−)。microrna的表达是通过测量中存在和使用的绝对量化计算方法。结果相对于U6 RNA表达(意味着±扫描电镜; ),nd:没有检测到。

我们先前的研究使用用荧光素酶报告基因转染实验显示,mir - 375基因启动子显示胰腺β细胞行(优惠活动11]。为了确定mir - 375启动子也活跃在胰α细胞,我们使用了细胞系αTC1是产生转基因小鼠的方式类似于用于βTC1细胞系(14]。事实上,我们发现启动子显示强烈的活动αTC1细胞,观察β细胞相似,但较低的活动non-beta细胞系NIH-3T3(图2(b))。相比之下,TK子显示了一个类似的低水平的活动在所有3细胞系测试(2.5α在NIH-3T3 MIN6 TC1、0.6和1.3,图2(b)),而在β细胞胰岛素启动子显示强烈的优惠活动,比α细胞和non-pancreatic细胞(图2(b))。因此,mir - 375的选择性表达α细胞中观察到的至少部分归因于转录控制通过mir - 375启动子介导的。相对的启动子活性的要稍高一些αTC1 MIN6细胞相比,而mir - 375水平相似或略低αTC1细胞比MIN6细胞,表明,转录后控制机制也可能发挥重要作用。


图2
mir - 375的细胞特异性启动子。的(a)表示位置的保守序列块mir - 375基因和报告基因构造派生而来。(b)启动子区域mir - 375(构造375 b)结扎上游萤火虫荧光素酶报告基因在pGL3-basic promoter-less向量。的质粒与荧光素酶报告基因质粒含有特异性胰岛素基因启动子和本构TK启动子。子活动的构造确定转染后进入α细胞系αTC1、β细胞行MIN6 non-pancreatic细胞系NIH-3T3。萤火虫荧光素酶活性测定和规范化的转染效率根据cotransfected的活动Renilla荧光素酶质粒。值的活动表示相对于pGL3-basic promoter-less向量。每个数据点代表的意思是±SEM ( )。

这里给出的数据显示mir - 375基因的表达和mir - 375的优惠活动发起人在阿尔法细胞系与以前的结果一致基于α细胞从正常的小岛:例如,α细胞表型的老鼠缺乏mir - 375基因(10)和mir - 375的活动发起人在α细胞的转基因小鼠11]。

在先前的研究中,我们观察到一些守恒的启动子区域中的cis元素被转染β细胞所必需的全部活动。其中包括E箱、塔塔地区,和短的地区横跨共识的转录因子结合位点HNF1 / INSM1 [11]。评估这些序列的意义表达α细胞,我们转染荧光素酶质粒含有突变启动子序列αTC1细胞。我们观察到一个模式非常相似,看到的β细胞行(11),即突变E箱2,TATA盒,Mut2地区引起了在启动子活性显著降低(图3(b))。Mut2地区内的突变INSM1站点而不是HNF1站点导致减少启动子活动(图3(b), (11])。这样的类似的组合转录因子可能参与mir - 375启动子的转录控制。此外,我们观察到守恒的块3和4的存在导致减少α细胞(子活动构造375 a和375 b相比,数字2(一),3(b))。这类似于以前β细胞中观察到的结果,并一致认为这个区域功能抑制启动子的转录。自序列块3和4都位于下游的转录起始站点,他们可以影响基因表达在转录和转录后水平。为了区分这些可能性,我们建立了构造块3和4的位于上游的强大CMV-TK启动子在两个方向。在这种情况下,任何影响3 - 4块地区的记者只能介导转录基因的活动。事实上,我们发现在α细胞,β细胞和non-pancreatic细胞,3 - 4块区域在两个方向能够显著减少记者基因表达(图4)。


图3
突变分析,mir - 375在α细胞启动子。(一)表示,mir - 375基因的启动子序列显示块进行突变分析(11]。(b)包含启动子突变被转染到荧光素酶的结构αTC1细胞。荧光素酶活性表达相对于野生型启动子活性(构造375 b)。每个数据点代表的意思是±SEM ( ;* 相比,荧光素酶的活动构造375 b)。Mut1 (M1)序列TCCATGAG TCCTCGAG突变,在Mut2 (M2)序列TATTTGCCCC TATGTGCACC突变,在我箱子1序列AGCCAGGTGGGT AGCACTAGTGGT突变,在我2盒序列TGACATCTGGTG TGAACGCGTGTG突变,在我箱子3序列GGACAGGTGTG GGGACCCGTTG突变,在mTATA序列GCAGTATAAGAG GCAGGCGCCGAG突变。

图4
抑制作用的特征块3和4。(一)表示包含块3和4的质粒插入两个方向CMV-TK启动子上游,控制萤火虫荧光素酶报告基因。(b)荧光素酶活性测定转染后进入β细胞系MIN6和冲击,α细胞线αNIH-3T3 TC1和non-pancreatic细胞系。活动是表示相对于荧光素酶活性pGL3-basic promoter-less向量。每个数据点代表的意思是±SEM ( ;* 相比,CMV-TK启动子的活性)。

4所示。讨论

自microrna发挥核心作用在广泛的生物学过程,包括开发中,细胞凋亡,和致癌作用,其细胞内的浓度必须严格监管。事实上,microrna的表达谱之间有着本质的不同细胞类型(中17]。原则上,这一规定可能会控制在转录和转录后水平,然而这些未知的具体贡献。此外,信息相对较少关于microrna基因和启动子的转录控制流程的元素。根据其在基因组中的位置,microrna基因可以分为基因内和基因间。尽管有些intronic microrna已报告有自己的启动子(18),基因内microrna通常被认为是由宿主基因启动子(19]。microrna的被认为是介导的转录RNA聚合酶II (20.),尽管参与波尔III已报告的例子(21]。

我们专注于mir - 375,因为它显示了一个明确的优惠在胰腺细胞表达模式。mir - 375最初报告为选择性表达胰腺内分泌α和β细胞(8,9),胃肠道和表达随后报道(22和垂体10]。mir - 375是至关重要的发展和成人胰腺:老鼠缺乏mir - 375显示受损的α/β细胞,平衡以及反应中有缺陷的β细胞增殖增加胰岛素的需求(10]。我们之前的结果表明,在控制β细胞选择性表达进化保存启动子的转录水平。我们已经检查了启动子的活性α细胞,发现启动子表现出相似的转录选择性;此外突变在几个关键cis元素之前证明为β细胞的活动是至关重要的,在α细胞也很重要。这表明相似的转录因子对频谱选择性表达。基于cis识别元素,这些因素可能包括bHLH蛋白质如BETA2 / NeuroD和转录因子INSM1。mir - 375在α细胞的精确作用尚不清楚:虽然可以分享一些目标基因与β细胞,失去mir - 375基因影响α和β细胞不同(10]表明重要目标基因差异。增加α细胞质量和hyperglucagonemia观察小鼠缺乏mir - 375符合mir - 375的作用在调节α细胞基因控制细胞生长和增殖,和正常葡萄糖传感。

一个有趣的功能,我们确定了先前mir - 375基因启动子是一个负面元素的存在立即位于下游的转录起始点在主记录。我们发现块3和4抑制胰腺和non-pancreatic细胞启动子活动的背景下mir - 375基因启动子,并在位于不同的启动子的上游。这清楚地表明,块3和4的镇压活动通过转录机制运行在几个细胞类型和函数。使用生物信息学工具,我们已经确定了几个抑制转录因子结合位点在3和4块,包括Krueppel-like转录因子、ETS1因素和neuron-restrictive消音器因素(NRSF)。需要进一步分析验证转录因子参与这个有趣的镇压活动,并确定块3和4的地区也可能参与转录后调节。

确认

作者感谢伊兰Hornstein博士和Sharon Kredo-Russo有用的讨论和莎拉维斯专家援助。这项研究是由大卫·s·莫洛斯及深深地支持的慈善基金会。m·d·沃克是Marvin Meyer和珍妮弧形背景幕的现任主席糖尿病研究魏兹曼科学研究所。