文摘
Genome-encoded小分子核糖核酸(microrna)提供一个转录后的监管层,这对胰腺的发展是很重要的。内分泌细胞的分化是由胰腺转录因子网络包括Ngn3和NeuroD / Beta2。然而,特定的microrna是如何交织在一起的转录网络不是很好理解。在这里,我们描述的规定microRNA-7 endocrine-specific转录因子(miR-7)。我们的数据显示,三个独立miR-7基因coexpressed胰腺。我们已经确定了守恒块上游pre-miR-7a-2 pre-miR-7b和证明了他们具有启动子活性功能化验,这是增加了的表达NeuroD / Beta2。这些数据表明,内分泌miR-7表达的特异性是由转录机制和涉及胰腺内分泌的转录因子网络的成员。
1。介绍
内分泌胰腺的发展是由一个转录因子网络,指定不同的内分泌细胞类型,包括产生胰岛素的β细胞,glucagon-producingα细胞,somatostatin-producing三角洲细胞,胰polypeptide-producing PP细胞,ghrelin-producingε细胞(1- - - - - -3]。内分泌分化程序是由neurogenin3 (Ngn3) [4,5]。接下来,一个复杂的网络不同的转录因子被激活指定内分泌血统(综述(3,6])。
Genome-encoded microrna基因表达与转录因子一致行动,完善并给予其鲁棒性发育的转换(7- - - - - -10]。许多microrna基因是嵌套在蛋白编码基因的内含子和受到转录控制宿主基因(11]。然而,其他microrna基因位于基因间区域和自主表达。例如,在先前的研究中,我们pancreas-enriched mir - 375和特征表明,通过定义良好的基因工程细胞特异性转录控制元素(12]。
mir - 375、miR-7高度和有选择地表达斑马鱼的内分泌胰腺,老鼠和人类(13- - - - - -16]。miR-7是守恒的microrna的进化,由单个基因编码的苍蝇和三个不同基因位点在哺乳动物。在老鼠两miR-7基因位于基因间区域所对应的。7 (mmu-mir-7a-2)和空空的。17 (mmu-mir-7b),而第三个miR-7基因,mmu-mir-7a-1,嵌入在一个基因编码的rna结合蛋白的基因内区,Hnrnpk (MGI: 99894,空空的。13)。
这两种miR-7a基因产生相同的22元成熟的序列,而miR-7b由单个核苷酸不同。然而,功能三个基因是相同的,如它们港相同的“种子”序列。因此,所有miR-7基因coregulate同一目标。而定义的一组目标建议miR-7 [17其中一些已经通过实验验证(18),对miR-7发起人结构或控制miR-7表达的机制。
在这项研究中我们mmu-mir-7a-2中的特征元素,mmu-mir-7b上游调控序列。我们表明,miR-7直接响应Ngn3。然而,我们的数据表明,NeuroD / Beta2 Ngn3的主要效应,控制miR-7和可能是负责维护miR-7表达分化内分泌细胞。
2。材料和方法
2.1。定量PCR和成熟的microrna的前兆
提取的总RNA进行了miRNeasy迷你包(试剂盒)。前体量化,合成cDNA使用miScript执行系统(试剂盒)。MicroRNA的互补脱氧核糖核酸合成使用Taqman MicroRNA qPCR化验(应用生物系统公司)。qPCR mRNA分析进行LightCycler 480系统(罗氏)使用Kapa SYBR绿色qPCR工具包(Finnzymes)。miRNA级别被规范化的小分子rna的表达(sno234和U6)和mRNA规范化GAPDH和产生HPRT。(引物序列在网上补充表1描述doi: 10.1155 / 2012/695214)。
2.2。细胞培养和荧光素酶记者分析
hek - 293 t细胞(美式文化集合),betaTC-3(导演的礼物西蒙·Efrat)和MIN6细胞(礼物Jun-ichi宫崎骏)是生长在杜尔贝科修改鹰介质(DMEM)和10%的边后卫,2毫米谷酰胺,100 U /毫升青霉素和链霉素37°C公司5%2在湿润孵化器。实验MIN6细胞进行段落18到28岁之间。
miR-7启动子分析,256个基点的碎片,206年英国石油(bp)和156年英国石油公司(代表miR-7a-2块1,miR-7a-2“块2”,和“块3”miR-7b, resp)是subcloned pGL3-basic,使用限制性内切酶BglII和KpnI。引物序列表中描述S1。hek - 293 t细胞转染100 ng的记者,20 ng A20 Renilla记者,除了50 ng pcDNA3空和/或NeuroD / Beta2和Ngn3表达向量。记者活动测定转染48 h后Dual-Luciferase记者分析系统(Promega)。
超表达分析,表达对转录因子向量,pcDNA3空向量,和CMV-GFP载体转染MIN6细胞使用Lipofectamine 2000试剂(表达载体),根据生产的指令。分析了miR-7内源性表达qPCR 48 h后。
2.3。统计分析
分析学生的使用- - - - - -JMP软件测试或双向方差分析。结果意味着±SEM。零假设被拒绝在0.05级(* *)。
3所示。结果与讨论
3.1。三个miR-7位点表达内分泌细胞
自从miR-7基因有三个在老鼠和人类基因组拷贝,我们首先确定哪些内分泌细胞中表达。正如前面所示(19],miR-7a和miR-7b高度专门表达胰岛,相对于其他器官,如心脏和大脑(数字1(一)和1 (b))。前体细胞可以区分三种不同位点的转录实时定量PCR (qPCR)。因此,我们设计了特定的引物为每个miR-7前体(益生元序列见表S1)和执行一个qPCR BetaTC3细胞系的研究。这一分析显示,所有三个miR-7β细胞培养(图中基因表达1 (c))。与这些结果一致,qPCR成熟miR-7a miR-7b透露表现对形式的miR-7在β细胞(图1 (d))。综上所述,miR-7表达式的分析表明,三个miR-7位点在β细胞被激活并负责整个miR-7高表达的成熟。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。序列分析的潜在miR-7监管区域
比较基因组学常用的识别功能重要性的保守序列(12,20.]。因此,我们比较了地区上游的pre-miR-7序列在几个不同的脊椎动物直接同源,确定三个高度保守的序列,这可能是潜在的功能的启动子区域。Trimethylation赖氨酸4组蛋白3 (H3K4)是参与激活转录,标志着许多基因的转录起始点的位置,包括胰岛素(21]。因此,我们确定了典型H3K4甲基化模式(22,23),表示可能的转录开始网站,miR-7基因附近的地区。
miR-7a-2我们确定了两个保守序列:长256 bp“块1”和206年英国石油公司“块2,”位于1420个基点和450个基点的上游miR-7a-2发夹,分别(图2(一个))。miR-7b,一个长156 bp“块3”保守序列被确定,定位1235个基点的上游miR-7b发夹(图2 (b))。miR-7a-1是省略了这一分析,因为它是嵌入在Hnrnpk基因的内含子和可能受宿主基因的启动子。
(一)
(b)
3.3。在培养细胞miR-7活动的推动者
功能描述miR-7推动者,碎片组成的块1 - 3分别被融合到一个萤火虫荧光素酶报告基因,promoterless质粒(pGL3-basic),转染到胰腺β细胞线MIN6和胚胎肾脏线HEK 293。
在hek - 293 t细胞“块2”产生了双重的荧光素酶活性增加,相对于pGL3-basic记者(Ctrl),表明弱启动子活动(图3 (b)中间面板)。“块3”,另一方面,拿出一个大(200倍)荧光素酶活性增加,表明该地区拥有一个强大的启动子(图3 (b)右面板)。惊人的“块1”导致了镇压的荧光素酶激活,表明这种保守序列可能参与基因转录的镇压(图3 (b)左面板)。然后我们检查是否假定的启动子序列可能带动MIN6荧光素酶激活β细胞。我们只发现了DNA序列被称为“块3”显示显著的推广活动(图3 (c))。总的来说,这些结果表明“块2”和“块3”具有弱和强启动子活动,分别。这些碎片的活动并不局限于胰腺细胞,并假定这些启动子片段需要额外的元素赋予选择性体内。
(一)
(b)
(c)
3.4。bHLH转录因子直接诱导miR-7启动子活动
之前它已经表明bHLH转录因子,Ngn3 NeuroD1,发挥核心作用在胰腺内分泌发展和成熟的β细胞功能,分别。这些蛋白质的功能通过E-boxes(共识序列CAxxTG)位于目标基因启动子(24]。因为两个守恒E-box元素中确定miR-7启动子序列(图3(一个)),我们测试是否Ngn3和调节miR-7 NeuroD1表达启动子活动。
为此,我们进行了transactivation实验,以荧光素酶记者构造cotransfected进hek - 293 t细胞的表达向量编码内分泌转录因子。这些分析显示激活的“块2”发起人NeuroD / Beta2a和Ngn3的反应。在这两个因素的存在,一个添加剂效果观察(图4 (b))。“块3”,NeuroD / Beta2产生显著的激活,而Ngn3很少或没有效果。第一块启动子的表达没有明显影响的任何co-transfected交易因素。
(一)
(b)
(c)
因此,我们的研究表明,序列上游miR-7b能够激活转录的β细胞培养,可以由内分泌激活转录因子NeuroD / Beta2。2块的上游地区miR-7a-2可以激活Ngn3 NeuroD /β2和。然而,这个序列显示非常低的启动子活性的β细胞线MIN6因此可能在与其他元素以抄写miR-7a-2轨迹在β细胞。
一个祖先miR-7基因无脊椎动物经历了基因组重复在脊椎动物进化枝。而重复的基因往往会导致每个位点的功能差异,我们的数据表明,miR-7表达式从三个独立的基因位点的贡献主要是较高水平的表达。此外,coregulation miR-7a-2和miR-7b NeuroD / Beta2表明这些基因对类似交易因素内分泌胰腺。
3.5。内源性miR-7表达式是由NeuroD激活/ Beta2在β细胞培养
最后,我们决定是否表达的内源性miR-7可以修改通过引入内分泌转录因子β细胞系。为此,我们与表达载体转染MIN6细胞Pdx1, Ngn3, NeuroD / Beta2 Hnf1b Insm1, ea2。其中,miR-7表达式在培养诱导β细胞只有NeuroD / Beta2(图5(一个))。这是符合记者实验,结果表明,选择性的miR-7由lineage-specific控制转录因子的表达,主要NeuroD / Beta2。这支持了假设miR-7本身可能是一个组件的级联功能角色控制内分泌细胞的发育在转录后的水平(见图模型5 (b))。
(一)
(b)
4所示。结论
在开发期间,Ngn3诱发内分泌细胞分化等移植转录因子NeuroD / Beta2 Pax4, Arx, Pax6。事实上,失去Ngn3导致内分泌分化[封锁5]。同时,Ngn3也上调miR-7表达式通过其效应,可能的转录因子NeuroD / Beta2,参与维护miR-7表达式也在成熟的细胞。
总之,我们的分析识别miR-7作为小说组件下游Ngn3 NeuroD,嵌入到转录因子网络调节胰腺的发展。进一步解剖的转录机制控制miR-7和其他内分泌microrna的表达将大大有助于我们全面理解microrna在胰腺发育和功能的作用。
作者的贡献
s . k . Russo m·d·沃克和大肠Hornstein设计实验。s . k . Russo a .洛克和公元曼德尔鲍姆进行实验和分析工作。s . k . Russo m·d·沃克和e . Hornstein写道。
确认
作者感谢Avnit-Sagi塔里协议、试剂和富有成效的讨论。他们感谢Jun-ichi宫崎骏MIN6细胞。本文是大肠Hornstein从赠款支持青少年糖尿病研究基金会(没有。99-2007-71),GIF年轻调查员奖,EFSD / D-Cure年轻调查员奖和EFSD莉莉计划,以色列科学基金会,沃尔夫森家族慈善信托基金。大肠Hornstein是海伦和弥尔顿的现任总统a Kimmelman Sydney Brenner博士职业发展椅子,椅子。m·d·沃克是Marvin Meyer和珍妮弧形背景幕的现任主席糖尿病研究魏兹曼科学研究所。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文的准备。
补充材料
补充材料:引物用于这项研究。