病理学(H5N8)(进化枝2.3.4.4)病毒在实验感染鸡和老鼠

文摘

小说的出现高致病性禽流感病毒(HPAIVs)候鸟引起严重关切的问题,因为这些秋天迁移期间有可能传播病毒。我们报告的识别小说HPAIV (H5N8)进化枝2.3.4.4病毒隔离病国内鸭在商业农场10月份开始的第二波的传播,影响家禽(鸭子;chiсkens)在俄罗斯和一些欧洲地区2016年西伯利亚西部。实验感染的应变高度致命的鸡和小鼠IVPI = 2.34= 1.3EI ,相应的行动。接种的鸡HPAIV / H5N8 neuroinvasiveness, multiorgan失败和死亡的鸡一天后接种。病毒复制到所有器官收集样品高病毒滴度与效价最高的大脑(6.75±0.1 lTCI/毫升)。有效的病毒复制中发现了以下细胞:大脑的神经元和神经胶质细胞;肺的肺泡细胞和巨噬细胞;小肠上皮细胞;肝脏的肝细胞和枯否细胞;脾脏巨噬细胞和内皮细胞;和肾脏的肾小管上皮细胞。这些发现促进我们理解组织病理学的影响(H5N8) HPAIV感染。

1。介绍

不同的流感病毒在人类和动物病理学方面发挥重要作用。高致病性禽流感病毒(H5N1)全球家禽业造成相当大的经济损失和对公众健康构成严重威胁。大约20年前,一位/鹅/广东/ 1/1996 (H5N1)(简要Gs / Gd / 96),目前流行的H5N1病毒的进化枝2.3.4前体HPAIVs,第一次被孤立在养殖鹅三水,佛山,中国南方的农村地区1]。H5N1 HPAIVs并未消失,后来变异进一步蔓延到中东,欧洲,非洲。流感病毒和病毒传播的多样性之间的家禽和野生鸟类可能导致的外观(H5N8)进化枝2.3.4.4 Gs / GD-lineage HPAIV,它第一次出现在家禽疫情于2010年在中国(2),2014年在韩国国内鸭子和候鸟(3]。的广泛分布在两个暴发期间c HPAIVs形成2截然不同的族群(H5N8)病毒:A组(Buan-like)和B组(Gochang-like)。A组病毒成为主流在韩国3),随后被隔离在西伯利亚东北部2014年9月(4]。2016年,两波的病毒传播在俄罗斯报道:6月第一波开始在西伯利亚西部和水生鸟类的影响,而第二个波始于10月和影响家禽(鸭子;鸡)在俄罗斯和一些欧洲地区西伯利亚西部[5,6]。到目前为止,许多隔离(H5N8)已确定在北美,非洲,欧洲和继续造成野生鸟类和家禽中暴发(7- - - - - -9]。病理病变HPAIV-infected鸟类是非常变量取决于很多因素,包括病毒株,主机物种,年龄和免疫状态和自然环境。然而,详细的病理学(H5N8) Gs / GD-lineage HPAIV如宿主适应、组织趋向性,病理病变,传染性、遗传性尚不清楚。这里我们研究的传染性和致病性(H5N8)进化枝(2.3.4.4)HPAIVs从西伯利亚,俄罗斯,在鸡。

2。材料和方法

2.1。病毒

国内鸭/ /西伯利亚/ 49羽毛/ 2016 (H5N8)(/ 49羽毛/ 2016),进化枝2.3.4.4,2016年10月被隔离病人家鸭的羽毛在西伯利亚的商业农场。10天的老鸡胚蛋的病毒传播和存储在-70°C。50%的鸡蛋感染剂量( )和50%的组织文化感染剂量( )对MDCK细胞测定如前所述[10]。

2.2。动物实验

动物实验伦理委员会批准的联邦根本和转化医学研究中心(2017 - 15)。

2.2.1。实验感染鸡的

静脉注射致病性指数(IVPI)测试执行/ 49羽毛/ 2016世界动物卫生组织手册中描述(11]。十6 specific-pathogen-free (SPF)鸡静脉注射(iv)接种0.1毫升的1:10稀释感染性尿囊液(包含的病毒)。鸡每天检查疾病的临床症状为10天。致病性指数计算的平均评分每只鸟的观察。

脑、肺、肝、肾、肠、心脏、脾脏样本收集的三只鸟死后立即发生第三天接种(dpi)。收集一套完整的器官从鸟儿和中性缓冲福尔马林固定在10%,石蜡包埋,切片,染色与hematoxylin-and-eosin病理评估。重复的部分被免疫组织化学染色(包含IHC)方法来确定流感病毒抗原分布。简单,部分沾小鼠单克隆抗体抗甲型流感病毒核蛋白质的(mca - 400, AbD Serotec,杜塞尔多夫,德国),紧随其后的是一个生物素化的山羊anti-mouse免疫球蛋白二级抗体。结合抗体检测与avidin-biotin检测系统(亚利桑那州图森市Ventana医疗系统)。RedMap工具包(Ventana医疗系统)作为底物发色体。另一个重复的部分大脑、肺、心脏、肾脏、肝脏和脾脏被免疫荧光染色(如果有)。幻灯片是deparaffinized和水化。燥热引起抗原决定基检索进行了使用微波和10毫米柠檬酸钠缓冲渐变20 (pH值6.0)为0.05%。幻灯片洗2 * 5分钟在PBS Triton x - 100, 0.025%用PBS洗净,放置了40分钟到阻断缓冲区包含1% BSA在PBS。 Preparations were incubated for 1 hour at RT with primary mouse antibodies against influenza A NP (AA5H, Netherlands), then washed 3 times for 5 minutes in PBS, and incubated for 1h at RT with secondary antibodies to mouse immunoglobulins conjugated with fluorochrome AlexaFluor488 (Abcam, ab150105). Slides were washed 3 times for 5 minutes in PBS. Cell nuclei were contrasted with 5μ4,6-diamino-2phenyl吲哚(DAPI),简要与去离子水清洗,并安装在FluoroShield安装介质。在激光扫描共焦显微镜图像捕获LSM710 / NLO(德国卡尔蔡司)。

部分肺、脑、肠、肝、脾、肾脏也收集和均质1毫升PBS和离心机;上层清液的收集和病毒滴定MDCK细胞从最初1:10稀释。病毒滴度的计算是通过科伯技术Ashmarin-Vorobyov修改(12根据以下公式:50 /毫升= lgDn -δ(ΣLi - 0.5)Dn是最大效应的剂量;李井的数量的比例是与细胞病理效应的总数井感染剂量;我是剂量的数量;δ是病毒的对数稀释。

2.2.2。实验感染的老鼠

鼠标致死剂量(50% )/ 49羽毛/ 2016确定的6雌性BALB / c小鼠(联邦预算研究机构国家病毒和生物科技研究中心向量,新西伯利亚,俄罗斯)。10组小鼠轻与乙醚麻醉在吸入混合物(2 - 4 %)和鼻内接种50μl的磷酸缓冲盐(PBS)包含- - - - - -的病毒。老鼠每天观察接种后14天内死亡。当时科伯计算方法如前所述Ashmarin-Vorobyov修改。

2.3。测序和系统发育分析

全基因组扩增等执行/ 49羽毛/ 2016病毒根据周et al。13]。Nextera XT样品制备用于获取图书馆下量代测序;全基因组序列得到使用Illumina公司MiSeq长度。完成基因组序列被提交给Epiflu GISAID数据库(www.gisaid.org/)。GISAID爆炸是用于分析应变的身份/ 49羽毛/ 2016。对齐和身份进行百分比计算乘以兆7 (14]。

2.4。对神经氨酸酶抑制剂的敏感性测定

菌株的敏感性/ 49羽毛/ 2016对奥司他韦(瑞士罗氏公司,巴塞尔)是评价神经氨酸酶(NA)抑制化验之前报道(14]。短暂,病毒是标准化NA活动水平高10倍的背景下,以生产荧光产品从methylumbelliferyl-N-acetylneuraminic酸(MUNANA)衬底(Sigma-Aldrich,达姆施塔特,德国)。药敏资料测定钠抑制的程度与三倍孵化后连续稀释仙女虫属。50%抑制浓度( )确定的剂量反应曲线。

这项工作涉及到设备的使用多路存取的中心“现代光学系统”的联邦根本和转化医学研究中心(俄罗斯新西伯利亚)。

所有的方法都是按照指导方针和有关规定执行。

3所示。结果与讨论

2016年,一个在俄罗斯(H5N8)病毒广泛传播在两波。夏天第一波影响野生鸟类(大冠水鸟)在图瓦(西伯利亚),和秋天的第二波影响家禽(gadwall、鸭、鸡)在欧洲的几个地区俄罗斯(坟头,卡尔梅克共和国)和西伯利亚西部5,6]。GISAID和基因库核苷酸序列分析2016 - 2017年建议(H5N8)流感病毒是广泛和野鸟和家禽感染,因此造成哺乳动物和人类传播的风险。没有(H5N8)病毒的人类病例报道。然而,其患病率和多种野鸟和家禽中爆发全球范围使它成为一个严重的公共卫生问题。

在西伯利亚西部早期监测我们孤立低致病性禽流感病毒从野鸭羽毛,这表明病毒传播很容易在鸟类在梳理(15]。因此,重要的是评估分离的病毒的致病潜力和分布在俄罗斯在第二波的传播。

在这里,我们报告的数据/国内鸭/西伯利亚/ 49羽毛/ 2016 (H5N8)(/ 49羽毛/ 2016)这是孤立于2016年10月从国内鸭羽毛生病的。/ 49羽毛/ 2016病毒系统类似于(H5Nx)病毒(主要是(H5N8))孤立在俄罗斯2016 - 2017年期间如(H5N8)株/大冠水鸟/ Uvs-Nuur湖/ 341/2016 /常见燕鸥Uvs-Nuur湖/ 26/2016 /灰色鹭Uvs-Nuur湖/ 20/2016 / wild_duck /鞑靼斯坦/ 3059/2016,(H5N2)应变隔离在Kostroma(/鸡/ Kostroma / 1717/2017_PA)。在2016 - 2017年(H5N8)菌株基因密切相关的一个/ 49羽毛/ 2016也被隔离在欧亚大陆和非洲的许多国家(见表1)。程度之间的身份编码序列(编码区)的基因组片段(heterotrimeric聚合酶复杂PB1和PA的子单元,核蛋白(NP),神经氨酸酶(NA)、基质蛋白(MP)和非结构蛋白(NS))高于俄罗斯的压力,这可能表明病毒的几个独立的介绍到俄罗斯。

3.1。病毒复制的实验接种鸡和老鼠

静脉注射(iv)接种三10 6周大的鸡^6.050%鸡蛋感染剂量(宰牲节₅₀)/ 49羽毛/ 2016病毒导致了100%的死亡率(IVPI = 2.34) 3天内。在所有器官样本收集第三天接种(dpi),病毒复制的病毒滴度高效价最高的大脑(6.75±0.1 log10TCID₅₀/毫升)(见图1)。

鼠标致死量(MLD的50%₅₀)是由鼻内接种系列稀释的病毒。/ 49羽毛/ 2016是高致病性的老鼠,MLD₅₀1.3的日志₁₀开斋节₅₀。所有被感染的老鼠出现症状包括体重损失,折边皮毛、弯腰驼背的姿势,和颤抖。

3.2。表型分析

奥司他韦的敏感性数据分析标准方法(16]。集成电路的解释₅₀值是基于世界卫生组织流感的抗病毒工作组(WHO-AVWG)标准建立了甲型流感病毒(17]:正常抑制流感(NI)(< 10倍高于正常抑制),降低抑制(RI)(甲型流感10 - 100倍高于正常抑制),和高度减少抑制(HRI)(甲型流感> 100倍高于正常抑制)。我们相比与疫苗株А/ 49羽毛/ 2016 /加州/ 07/2009 (H1N1) pdm09孤立在流感大流行期间,并演示了正常抑制奥司他韦。的比较证实NI / 49羽毛/ 2016。

3.3。微观病变、病毒抗原分布和病毒载量在鸡器官

研究微观损伤和病毒复制的网站,我们做了一个比较分析的器官从感染鸡3 dpi和2未感染鸡(控制)。Hematoxylin-and-eosin(他),包含IHC,如果染色AI病毒核蛋白抗原进行(见图2和3,5。垫)。

3.3.1。肺

中庭肺肺泡和气囊含有浆液性渗出物和巨噬细胞都降低了。大量的有核红细胞parabronchial流明(出血),中庭,和空气毛细血管。纤毛和呼吸(pseudostratified)上皮杯状细胞部分增殖,部分经历了变质的变化(营养不良;hyperproduction粘液)。血管内皮细胞肿胀,部分被烧毁。我们还发现了血管周围水肿、出血和水肿具有高蛋白质含量(3/3)(见图2(一)和2(b))。病毒抗原染色观察肺泡细胞,肺泡巨噬细胞(3/3)和病毒滴度分别为6.06±0.06日志₁₀TCID₅₀/毫升(见图2(c)和放大)。这些变化表明严重病变导致急性呼吸衰竭。

3.3.2。大脑

轻微的局部软化被确认在所有鸡。主要提出了血管周围淋巴细胞组成的袖口在大脑皮层。静脉和毛细血管充血。蛋白质含量高的水肿出现(3/3)(见图2(d)和2(e))。病毒抗原染色观察神经元和神经胶质细胞(见图所示2(f)和放大),病毒滴度分别为6.75±0.1日志₁₀TCID₅₀/毫升。因此,血管炎和viral-induced病变神经元和神经胶质细胞的观察,这是有关neuroinvasiveness (H5N8)的高致病性禽流感病毒。

(H5N8)的neuroinvasiveness HPAIV早些时候所示研究[14,18,19),引起的病变引起的类似H5N2, H5N6和H5N8病毒在国内北京鸭子(20.),通过HPAIV (H5N8)在增肥鸭14),和(H5N1)的老鼠21]。病毒滴度的大脑中H5N6——H5N8-infected H5N2-infected鸭子鸭子明显高于[20.]。

轻微的局部软化、坏死的神经元和疾病的血液流变学检查情况下表示神经亲和力高(H5N8) HPAIV,由包含IHC证实了积极的病毒学的结果,如果分析。病毒传播到大脑中导致严重的神经功能障碍被认为是高甲型流感的原因之一(H5N8)毒性鸡。

3.3.3。肝

我们观察到静脉和肝鼻窦充血。轻度拥堵和血栓形成也见过(1/3)。地方大血管附近的白细胞浸润主要被确定(3/3)(见图2(g))。当地肝实质的炎症与肝细胞退化与优势的巨噬细胞和肥大细胞,嗜碱性粒细胞,嗜酸性粒细胞是检测(1/3)(见图2(h)和放大)。病毒抗原染色观察肝细胞和枯否细胞,在和病毒滴度分别为4.69±0.28日志₁₀TCID₅₀/毫升(见图2(我)和放大)。因此,肝脏血液供应和焦肝炎的干扰。

3.3.4。心

多病灶的lymphohistiocytic心肌炎和心脏细胞退化观察(见图3(一个))。心肌间质水肿液被确认的积累(3/3)。病毒抗原染色观察细胞(见图3 (b))。

3.3.5。肠

脱皮的绒毛上皮细胞层观察。肠上皮杯状细胞增生显示。轻微的单核细胞浸润黏膜下层是确定了。坏死的病灶部位被发现在粘膜固有层(3/3)(见图3 (c))。病毒抗原染色存在于上皮细胞的绒毛(见图3 (d)),病毒滴度分别为5.75±0,13个日志₁₀TCID₅₀/毫升。因此,catarrhal-desquamative肠炎与高水平的病毒抗原在炎症细胞观察小肠。

3.3.6。肾脏

焦点由病毒引起的急性坏死和出血的观察到肾脏(1/3)。病毒抗原染色存在于近端小管上皮细胞的肾元,和病毒滴度分别为6.0±0.35日志₁₀TCID₅₀/毫升(见图3 (e)和3 (f))。

3.3.7。脾

观察静脉和毛细血管充血。单核细胞浸润主要大血管附近出现。多灶性坏死(3/3)(见图3 (g))。病毒抗原存在于巨噬细胞、内皮细胞和病毒滴度分别为4.25±1.06日志₁₀TCID₅₀/毫升(见图3 (h))。

一般来说,如果染色更密集的大脑,肺和心脏。NP病毒抗原染色在肾脏和脾脏是微不足道的(没有显示)。病毒抗原的存在与IHC检测到如果在协议分析和组织病理学变化(见附加的。垫)。

在这项研究中,我们调查了甲型流感病毒(H5N8),孤立在第二波传播于2016年在西伯利亚西部。它显示高度毒性特性(IVPI = 2.34);multiorgan传播(大脑、心脏、小肠、肝、脾脏和肾脏)在接种鸡。病毒有效复制收集的所有器官中病毒滴度高,和大脑中的效价最高(6.75±0.07日志₁₀TCID₅₀/毫升)。/ 49羽毛/ 2016显示高致病性小鼠(MLD)₅₀= 1.3的日志₁₀开斋节₅₀),这可能表明病毒感染哺乳动物宿主的能力,并且有可能导致高死亡率的鸡。所确定的氨基酸变化需要进一步的研究来揭示他们的角色在高度致命的感染,这可能表明病毒感染哺乳动物宿主的能力。奥司他韦和有效地抑制了病毒显示抑制内正常的IC₅₀磁化率范围。

组织病理学禽流感造成的不同菌株被描述由几个作者(11,22- - - - - -24),展示了病毒的多重的能力在不同的器官和细胞类型导致坏死病灶。然而,炎症反应在不同实验和鸟类之间存在着显著的差异。因此,一个适当的组织病理学特征为每个小说应变是至关重要的。

的溢出(H5N8) HPAIV家禽动物卫生部门造成了严重的威胁,尤其是在西伯利亚,经历了2005年(H5N1)爆发25]。因此需要严格的生物安全措施保护家禽农场免受病毒条目。

4所示。结论

新型高致病性禽流感病毒(H5N8)(进化枝2.3.4.4)2016年10月被隔离病国内鸭羽毛的商业农场在西伯利亚。这种病原体是高致命性在实验感染鸡和小鼠和IVPI = 2.34= 1.3 ,相应的行动。我们确定了鸡的内脏器官受损的结构元素HPAIV (H5N8):(我)在肺部,肺泡巨噬细胞和肺泡细胞;(2)在大脑中,神经元和胶质细胞;(3)肝细胞和枯否细胞在肝脏,;(iv)在心脏,细胞;(v)在肠上皮细胞;(vi)在肾脏近端小管上皮细胞的肾元;(七)在脾、巨噬细胞和内皮细胞。

此信息可以帮助研究HPAIV (H5N8)引起的感染病毒继续传播。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

赞助商不扮演任何角色的研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

我们感谢GISAID EpiFlu™数据库(http://www.gisaid.org),作者提供的序列数据。显微分析已经得到了总统的支持下的格兰特(协议# 075-15-2019-1083(МК-3318.2019.4))。排序,系统发育分析,确定对神经氨酸酶抑制剂是支持的俄罗斯科学基金会的资助(项目# 17-44-07001)。

补充材料

免疫荧光检测病毒抗原的内部器官的鸡感染了高致病性禽流感病毒(H5N8)。注意:a:大脑,b:肺,和c:心。格林:细胞内流感NP蛋白染色与NP抗流感抗体(AA5H、荷兰);蓝色:核沾染了4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。图像是通过LSM710 / NLO显微镜,利用Plan-Apochromat 63 x客观(德国卡尔蔡司)。(补充材料)

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