性能的ELISA和间接免疫荧光试验在伊朗的人畜共患皮肤利什曼病的血清学诊断

文摘

血清学检测被广泛评估诊断内脏利什曼病(六世)和作为诊断的常规方法六世虽然这些方法不正确评估诊断皮肤利什曼病(CL)。本研究旨在评估间接immunofluorescent-antibody的性能测试(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)在伊朗的血清诊断皮肤利什曼病。十九世纪的六十一份血清样本证实CL病人和50名健康对照组的血清50 non-CL患者的血清收集。从promastigotes抗原制备,无鞭毛体利什曼虫主要。IFA是用来检测反利什曼虫免疫球蛋白在ELISA用于检测反利什曼虫IgM、总免疫球蛋白或免疫球蛋白子类(IgG1和4),ELISA检测总免疫球蛋白和IgM,显示灵敏度的83.6%和84.7%,特异性为62.7%和54.6%,分别。敏感性和特异性的ELISA检测IgG1 IgG4分别为64%,75%,85%,49%。IFA的敏感性和特异性分别为91.6%和81%。结论。本研究的结果表明,血清学试验,特别是IFA,可以用于适当的诊断CL。

1。介绍

Leishmaniases全世界是一个严重的健康问题。据估计,全世界约有1200万感染者[1]。

皮肤和内脏利什曼病都是出现在伊朗和皮肤利什曼病(CL)有大量分布,被发现在几乎所有的省份,特别是法尔斯省,伊斯法罕,科曼地毯(2- - - - - -6]。

CL的实验室的诊断主要基于寄生虫学的方法搜索寄生虫的病变或损伤材料的文化。尽管这些方法具体,他们遭受的低敏感性,文化污染的可能性,以及寄生虫的困难的增长。与寄生虫学的方法,分子技术已用于诊断CL。然而,技术要求,相对较高的成本,以及持久性的寄生虫治疗后病变阻碍其常规适用性(7- - - - - -10]。

血清学检测被广泛评估诊断内脏利什曼病(重要),视为常规诊断的重要方法,这些方法很少用于诊断CL。近年来,CL的血清学诊断方法评估了一些研究[11- - - - - -17]。

血清学测试中,间接免疫荧光法(IFA),直接凝集试验(DAT)和酶免疫测定(EIA)是最经常评估测试的诊断主要是美国皮肤利什曼病(12,14,16]。

然而,这些方法没有正确评估诊断人畜共患皮肤利什曼病(ZCL)。缺乏这样的信息,特别是在伊朗,合理的电流的电导研究旨在确定两个血清学检测的有效性,ELISA和IFA在伊朗皮肤利什曼病的诊断。

2。材料和方法

2.1。血清样本

血清样本收集从六十一年寄生虫学的CL病人设拉子医院确认。寄生虫学的诊断,样本取自每个疑似病例的皮肤损害。每种情况下,皮肤病变的边界缝隙外科柳叶刀和组织从狭缝刮涂在干净的载玻片,固定与甲醇,然后沾染色污渍。每一个这样的诽谤被光学显微镜下仔细检查油浸和CL的诊断证实了积极的涂片对全新的身体。此外,样品准备的病变患者进行了PCR发现这种寄生虫的种类。控制样品()获得健康个体没有CL的历史。此外,50 non-CL病人收集的血清样本。收集的样本被IFA和ELISA检测。伦理道德委员会批准的这项研究是医学科学大学设拉子,并从参与者同意了。

2.2。抗原的制备

无鞭毛体的l .主要(MRHO / IR / 75 / ER)是像之前描述的那样培养(18]。寄生虫洗了三次(1500 g×20分钟)和PBS。添加蛋白酶抑制剂和寄生虫resuspended PBS和提交冻融声波降解法。细胞溶解的材料是离心机(1500 g×20分钟在4°C)和上层的删除;蛋白质含量估计和提取的抗原是储存在−20°C到用于ELISA。此外,promastigotesl .主要(上图)应变一样RPMI媒体传播。抗原幻灯片IFA是准备用PBS彻底洗promastigote细胞和装载20μ5 L细胞悬液的密度10⁵cell /毫升到每个点的多个点聚四氟乙烯幻灯片。幻灯片被允许在室温下晾干,储存在−20°C到使用。

2.3。酶联免疫吸附测定(ELISA)

探测反利什曼虫抗体的血清CL患者,收集血清ELISA系统进行评估。在乘96 - ELISA进行微型板块(Nunc,耐尔根,Nunc国际、鲁开德、丹麦)。板块与5敏化μ克/毫升的无鞭毛体抗原(100μ信用证)在涂料缓冲区(0.05 M carbonate-bicarbonate缓冲区,pH值9.6)和孵化一夜之间在4°C。

抗原过剩被洗板5次磷酸盐缓冲saline-Tween 20 (PBST, pH值7.4包含0.05%渐变20)。阻塞是由3%的脱脂牛奶PBST 2小时。洗前和100井μL (PBST 1/100稀释)血清样本的CL病人与健康受试者的样本,作为消极的控制,并从non-CL患者血清应用到盘子和孵化为1.5小时在室温下。盘子都洗前和100μL的辣根过氧化物酶(HRPO)共轭对人类免疫球蛋白或IgM抗体(Abcam)或HRPO-conjugated鼠标反IgG1 IgG4 (PBST GIBCO)添加到盘子中,在室温下培养1小时。洗后,盘子是孵化与发色体/衬底(100μ信用证的门诊部当,0.025% H₂O₂pH值在0.1 M柠檬酸缓冲,5)。490海里的吸光度与ELISA酶标阅读器检查。对于每一个抗原,截止值,区分积极从消极的结果,是通过定义截止正常血清组的平均值+ 3个标准差。

2.4。间接免疫荧光试验(IFA)

间接免疫荧光试验是由使用promastigotesl .主要。血清样本稀释1:16 PBS-skimmed牛奶2%初步筛选和积极的样本连续稀释1:1024。10毫升每个稀释血清是放置在潮湿的幻灯片和孵化室在37°C 30分钟。幻灯片在PBS洗(三次,每次10分钟),干燥,和孵化30分钟37°C和fluorescent-conjugated兔子反人类免疫球蛋白(σ),稀释1:1000年,和伊文思蓝溶液,稀释1:10000。幻灯片是清洗和风干。最后,immunofluorescent显微镜下观察到的样本的滴度1:16以上被认为是积极的。确定最歧视的截止CL病人的血清,从CL病人血清,non-CL病人和健康人进行了分析和选择的分界点是1:16效价。

3所示。结果

CL病人由41岁男性和20名女性。患者的平均年龄是37岁(9至83岁)。大多数患者20-30-year-age组(28.3%)。大部分患者(37%)手中CL病变而其余病变在脚(21.3%)、面(13.1%),或树干(6.4%)。病变的患者数量是3。病原体的CLl .主要由PCR。

用ELISA检测total-IgG反对l .主要CL的51例患者(83.6%)有一个在ELISA阳性反应,而健康对照组10例(16.4%)和19例non-CL病人也积极通过ELISA。因此,ELISA诊断的敏感性和特异性CL 83.6% (95% CI = 71.4% - -91.4%)和62.7% (95% CI = 52.9% - -71.6%),分别为。当系统被用于检测反利什曼虫IgM,敏感性为84.7% (95% CI = 72.5% - -92.3%)和特异性为54.3% (95% CI = 44.2% -64.6%)得到分析。ELISA系统也用于检测反利什曼虫免疫球蛋白子类(IgG1和IgG4)和被发现的敏感性64%和85% IgG1 IgG4,分别。

使用IFA,敏感性为91.6% (95% CI = 80.8% - -96.8%),特异性为81% (95% CI = 71.6% -87.8%)被发现在IFA截止时设定在1:16。然而,分界点时设置为1:128年,14例(27.5%)的CL病人仍积极而健康的控制或non-CL患者都没有积极的反应。因此,分析显示100%的低敏感性但特异性截止时设定在1:128效价。表1显示的细节表现的ELISA和IFA CL的诊断研究。

统计分析的数据显示一个公平的协议(k = 0.4) ELISA(检测总免疫球蛋白)和IFA之间。

4所示。讨论和结论

寄生虫学的诊断,这依赖于检测利什曼虫寄生虫在病变或培养的组织样本CL患者,仍作为诊断的金标准CL (8,9,19]。虽然直接的微观识别寄生虫很简单,不到60%的低灵敏度是有问题的,特别是在慢性寄生虫血症较低的情况。培养组织样本是一个有用的疟原虫的寄生虫学的方法,因为它允许隔离标识的物种,但这是耗时和文化可能会被真菌或细菌感染。

不同的血清学的检测如ELISA、IFAT直接凝集试验(DAT)和免疫印迹的用于常规诊断和评估,内脏利什曼病(20.- - - - - -22]。这些血清学诊断的工具的使用CL的一些研究中也被评价(23- - - - - -25]。然而,目前还没有血清学检查常规诊断CL。

当前研究的主要目标是评估两种常见的血清学方法的性能,ELISA和IFA ZCL在伊朗的诊断。研究结果证明适当的性能(敏感性为91.6%)的IFA CL的诊断。之前的研究成果,进行血清学诊断方法的有效性的CL生成变量的结果。CL的敏感报道从23%到95%不等(11- - - - - -16]。

Zeyrek等人报道的敏感性为78.4%,特异性为69.3% CL在土耳其的ELISA诊断系统(15]。这些研究结果与我们的研究结果是一致的。罗梅罗等人报道89%的敏感性与抗原的ELISA系统利什曼虫墨西哥与抗原的敏感性为71%利什曼虫braziliensis(25]。詹森等人报道一个33 ELISA试验的敏感性为67%l .主要CL感染患者,通过一系列特定的肽抗原(24]。

在我们的研究中发现了一个令人满意的性能对IFA CL的诊断。报道了低灵敏度Mosleh(81%)和Monroy-Ostria (IFA (85.4%)23,26]。在这些研究中,分界点一直在设置1:16效价和我们使用相同的IFA截止。截止时在我们的研究中,提高到1:124年,没有一个控制样本保持积极的IFA,超过20%的CL患者强烈积极的和高滴度(1:1028)。考虑这个截止测试的特异性为100%而敏感性降至23%。

在最近的研究中,试图探测反利什曼虫免疫球蛋白子类通过ELISA CL病人。然而,结果没有任何比这更好的免疫球蛋白总量的检测。

在CL患者中,抗体水平在很大程度上被认为是非常低的。这不是在六世,抗体可以达到极高的水平导致hypergammaglobulinemia疾病的一个特征。此外,血清阳性可能也取决于疾病的持续时间和皮肤损伤的数量(23]。因此在CL,低灵敏度的血清学测试可能会由于低抗体滴度。CL患者在我们的研究中,相关性疾病的血清学试验阳性和持续时间是重要的(),而没有发现协会之间的病变和血清阳性的数量。

综上所述,本研究的结果表明,血清学测试,特别是IFA,有一个适当的性能诊断CL和这些测试,以及寄生虫学的方法,可以用于适当的诊断CL。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本文中描述的结果是马尔基·Ashrafmansouri硕士论文的一部分。这项研究是在经济上支持校长的办公室设拉子大学医学科学研究(批准号3602)。

引用

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