不同菌株致病性的实验评价曼氏裂体吸虫

摘要

发病机制三种不同曼氏裂体吸虫来自巴西米纳斯吉拉斯州(BH株)和São Paulo (SJ和SD株)的菌株在实验感染小鼠中进行了评估。对坎皮纳斯市(São Paulo，巴西)当地接受治疗的患者(SD株)中最严重的临床病例的观察形成了这项研究的基础。以小鼠为最终宿主，感染鼠尾蚴Biomphalaria tenagophila(SJ和SD株)和Biomphalaria glabrata(BH菌株)。分析的参数如下美国曼小鼠粪便中有虫卵;肝、脾、肺、胰腺和升结肠每组织面积的肉芽肿数量;肝脏和肠道肉芽肿的测量;成虫数;以及吸虫卵的测量。三株菌株的比较表明，在Campinas中分离的SD菌株，相对于穿透尾蚴的数量，具有较高的蠕虫恢复率。与SJ和BH菌株相比，SD菌株表现出与BH菌株相似的致病性，内脏肉芽肿数量更多，肉芽肿和虫卵也更大。此外，吸虫卵也在粪便中大量排出。

1.介绍

血吸虫病是继疟疾之后全球最重要的寄生虫病，是一个严重的公共卫生问题，主要集中在热带和亚热带地区。在巴西，血吸虫病的传播是由该国出现的单一物种引起的，曼氏裂体吸虫．它已经被证明美国曼通过人类从高流行地区的迁移事件和三种蜗牛的存在，直接与该国的经济史有关，这三种蜗牛是这种寄生虫的天然中间宿主。血吸虫病最初被描述为一种典型的农村疾病，现在具有城市特征，主要流行于巴西人口最多的州São Paulo(巴西)的大城市郊区。São Paulo州该病的另一个特点是没有严重病例[1，这在某种意义上是有利的;然而，由于没有临床表现使患者前往公共卫生诊所，血吸虫病往往仍未得到诊断，受感染者可能继续污染中间宿主繁殖的淡水水源。

1963年(2，菌株BH和SJ曼氏裂体吸虫最初是根据观察得出的结论Biomphalaria glabrata来自贝洛奥里藏特(巴西米纳斯吉拉斯州)的人可能感染了当地的一种菌株(BH)美国曼但对感染有抵抗力美国曼分离自São Paulo，巴西的Paraiba do Sul谷(南Paraiba河谷)(SJ株)。此外,Biomphalaria tenagophila来自淡水河谷的里约热内卢Paraíba do Sul很容易受到当地的影响美国曼(SJ株)，但不易被美国曼取自Belo Horizonte (BH菌株)。

小鼠研究[3.，4]揭示了这两种线虫的形态差异以及它们的致病性的差异[5- - - - - -7］．作者(7]的结论是，数量少得多的bh -系寄生虫造成的损害程度与数量多的sj -系蠕虫造成的损害程度相当。

在bh菌株流行地区，通常观察到肝脾肿大失代偿的个体。在患者感染SJ株的地区，常见的临床表现包括肠道形式，脾脏略大[8］．

坎皮纳斯是位于São Paulo(巴西)州的一个城市，人口约为100万美国曼根据São保罗卫生秘书处的记录，它是在1959年观察到的，起源于Piçarrão信息流的一个焦点[9］．自那时以来，在坎皮纳斯及其周围地区记录了新的病例和新的感染焦点。然而，大多数病例均无症状。

外来血吸虫病病例美国曼自1998年以来，在坎皮纳斯的Jardim São Domingos (São Domingos Garden)社区都有报道。最近，一株吸虫在实验室中被分离出来b . tenagophila在Lagoa Boa União (Boa União Lake)捕获，它位于Jardim São Domingos社区。Freitas和Oliveira [10和Freitas等[11]发现在Jardim São Domingos医疗中心治疗的本地血吸虫病患者有门脉高压的迹象，在某些情况下有脊髓病。这些事实促使我们对不同的致病性进行了比较研究美国曼菌株分离自Jardim São Domingos (Campinas, São Paulo，巴西)，BH菌株来自Belo Horizonte (Minas Gerais，巴西)，SJ菌株来自Vale do里约热内卢Paraíba do Sul (São Paulo，巴西)。

2.材料和方法

实验由本机构动物实验伦理委员会批准，并根据642-1号协议进行认证。

SPF级雌性小鼠暴露感染美国曼尾蚴分别来自BH株(原产于巴西米纳斯吉拉斯的贝洛奥里藏特)、SJ株(原产于巴西的Vale do里约热内卢Paraíba, São Paulo)和SD株(原产于巴西坎皮纳斯的Jardim São Domingos, São Paulo)小鼠被分成三组:第一组，感染美国曼BH菌株尾蚴;第二组，小鼠感染美国曼SJ株尾蚴;第三组小鼠感染美国曼SD菌株的尾蚴。

从感染第三周开始，每周收集小鼠粪便，以验证消除美国曼鸡蛋。在感染第8周，将所有存活小鼠处死，以使蠕虫恢复。

评价指标包括:穿透尾蚴的数量;在粪便中产卵的数量;处死小鼠当天肠系膜-门脉系统的蠕虫数量;肝、脾、肠(升结肠)、胰腺、肺的肉芽肿数量;肝、肠肉芽肿组织区域;和美国曼蛋的大小。

2．1．感染的老鼠

小鼠感染了美国曼来自同域蜗牛的尾蚴在实验室中繁殖b . tenagophila捕获在Lagoa Boa União, Jardim São Domingos(23°02 ' 21.31 " S 47°06 ' 17.01 " W)在坎皮纳斯。这些蜗牛暴露于SD菌株的毛蚴。的b . glabrata从贝洛奥里藏特(Belo Horizonte)的大肠杆菌中分离得到b . tenagophila从巴西淡水河谷(Vale do里约热内卢Paraiba do Sul)采集了SJ菌株的毛蚴。

分别将小鼠暴露于感染不同毒株蜗牛尾蚴2小时。根据Magalhães[描述的方法，通过将尾部暴露于70条尾蚴经皮进行感染。12］．

2．2.核对数量美国曼蛋在粪便中产卵

从感染的第三周开始，用Kato-Katz所描述的方法测定被感染小鼠粪便中消除的卵的数量[13］．为每组5只动物准备玻片，最终报告结果代表所有玻片读数的算术平均值。

2．3.收集和计数蠕虫

感染第8周颈椎脱位处死动物。根据Yolles等人所描述的方法，通过肝门静脉系统灌注收集蠕虫[14］．记录了雄性和雌性蠕虫的数量，无论它们是分离的还是成对的。

2．4．内脏血吸虫肉芽肿的收集、计数和测量

灌注后，取动物肝脏、脾脏、结肠、肺、胰腺的碎片进行肉芽肿计数和测量。将碎片固定在Bouin水溶液中μm厚组织切片采用Masson三色染色。用光学显微镜分析切片，计算每个组织面积(1.2469 mm)的肉芽肿数量²)，基于Magalhães等人所描述的方法[6］．肉芽肿反应的大小根据其面积而定。只有肉芽肿中含有美国曼鸡蛋在他们的中心被测量，因为鸡蛋验证了接近更大的肉芽肿反应切片。使用Windows 95/NT/98版本4.0的Image Pro Lite软件进行测量。

2．5．收集和测量美国曼鸡蛋

卵的BH、SJ和SD菌株美国曼从感染小鼠的粪便中收集。使用Windows 95/NT/98版本4.0的Image Pro Lite测量鸡蛋针状体的长度、宽度和长度。数据的统计分析包括检查长度、宽度、针状体大小、长宽比、长与针状体比和宽与针状体比。使用SAS软件包(2006)中的PROC GLM (General Linear Procedure)函数进行分析[15］．

3.结果

所有的动物都感染了所有三种菌株美国曼在八周的实验中存活了下来。

表1和2列出了BH、SJ和SD菌株感染小鼠的平均穿入尾蚴数、雄虫、雌虫、交配虫对、总虫数和恢复虫数相对于穿入尾蚴数的百分比美国曼．

统计分析表明，尾蚴在小鼠体内的穿透能力在不同品系间存在显著差异()．SJ尾蚴的穿透力大于BH尾蚴1)．

不同品系间交配虫对数和总虫数差异显著(和、职责)。感染SD株的小鼠比感染BH株的小鼠有明显更高的蠕虫数量(交配对和总数)2)．

不同品系的恢复虫的百分率与穿透尾蚴的百分率有显著差异()．如表所示2， SD菌株感染小鼠的蠕虫恢复率较高。统计分析(表1)亦显示从老鼠身上回收的雄虫和雌虫数目在所有三种品系之间并无显著差异(和、职责)。

表格3.列出了周围肉芽肿反应的数量美国曼卵每组织面积(1.2469毫米)²)在感染BH、SJ和SD株的小鼠内脏中发现美国曼．

在肝脏中发现的肉芽肿反应的平均数量有显著差异(由应变)。与SJ株相比，感染BH株和SD株的小鼠出现更多的肉芽肿反应(见表)3.)．

不同品系感染小鼠脾脏肉芽肿的平均数量差异有统计学意义(p < 0.05)。)， SD菌株比BH和SJ菌株产生更多的肉芽肿。BH株和SJ株的差异不显著(表1)3.)．

胰腺切片的组织学分析显示，SD菌株的血吸虫肉芽肿平均数量更多(见表)3.)比较其他菌株()．

肠(升结肠)和肺肉芽肿数量的统计分析显示，三种菌株之间无显著差异(和、职责)。然而，SD菌株在肠道中产生的肉芽肿平均数量更大。此外，SD菌株并没有比BH菌株产生更多的肺肉芽肿(表)3.)．

总的来说，对三种菌株感染的小鼠切片的组织学分析表明，肝脏周围的肉芽肿反应最多美国曼鸡蛋，然后是肠子。SD菌株在胰腺发现的肉芽肿数量第三多，其次是脾脏和肺。对于BH菌株，胰腺也有第三多的内脏肉芽肿;然而，与SD菌株不同的是，胰腺之后是肺，然后是脾脏。对于SJ菌株，在胰腺和脾脏发现了相似数量的肉芽肿。SJ株感染动物肺部未见肉芽肿。

各菌株肉芽肿反应的平均大小和每克粪便的虫卵数列于表中4和5．

表中数据4表明SD菌株肝脏肉芽肿面积最大。感染BH株和SJ株的小鼠肝肉芽肿较小，且无显著差异。

SD和BH菌株感染的动物肠道肉芽肿较大，其次是SJ菌株(表)4)．

到感染第7周和第8周时，SD株感染小鼠的卵数明显与BH株相同(见表)5),尽管b . tenagophila作为中间宿主。然而，值得注意的是，感染SD菌株的小鼠肠系膜门静脉系统的蠕虫总数和交配蠕虫对的恢复平均大于感染BH菌株的小鼠(见表)2)．

表格6列出蛋量数据。sd菌株卵的长度和宽度6)明显长于其他品系的其他卵(和而BH株和SJ株的卵长无明显差异。来自BH菌株的卵的宽度最短。

骨刺的大小(表6)的差异无显著性(）;然而，SD菌株的一些卵具有尖端非常弯曲的针状体，如图所示1．表中计量比数据7表明应变仅在宽度与针尖长度比()， SD菌株最高。

4.讨论

地理分离的菌株美国曼目前在致病性方面存在显著差异，这是由于大范围、大范围分布造成的器官损害更大美国曼鸡蛋(16]，即寄生虫产卵的数目[7，17]，以及螺媒易感程度[1，16，18，19］．根据Chieffi和Waldman [1]，在São Paulo州(巴西)的原发病例中肝脾型罕见可能是由于钉螺感染率低美国曼，反映感染易感性较低b . tenagophila相比b . glabrata和b . straminea．

在之前的研究中，Yoshioka等人[20.结果表明，桑塔罗萨(SR)菌株美国曼在Campinas, São Paulo State(巴西)分离的，比BH和SJ菌株的致病性低。感染SR株的小鼠表现出最少的蠕虫、粪便中脱落的虫卵和肉芽肿。寄生虫卵周围肉芽肿反应直径最小。

比娜及普拉塔[17研究表明肝脾疾病的发展与肝脾疾病的数量有关美国曼病人大便中排出卵子。由美国曼很少局限于一个器官，无论是肝还是肠。美国曼卵子通常存在于几乎所有的器官和组织中，在那里它们会产生一些类似的反应。受影响组织的特定特征会引起某些差异。

除SJ株感染小鼠的肺外，所有被研究的器官均发现有血吸虫肉芽肿(见表)3.)．

这里展示的结果表明São Domingos菌株(SD)具有高致病性，该菌株最初是从坎皮纳斯(São Paulo州)的São Domingos社区分离出来的。考虑到内脏肉芽肿反应的数量和大小，该菌株与BH菌株具有相似的致病性。更大的组织和器官的参与可以归因于更多的虫卵脱落的数量和更大的卵大小的SD菌株。SD菌株除数量多外，卵也较大(见表)6)，形态特征明显，针状尖端弯曲(图1)．

从流行病学的角度来看，这些结果是相关的，因为相对于穿透尾蚴的数量，感染SD菌株的动物更大的蠕虫恢复和更多的虫卵在粪便中脱落。

获得的SD应变数据美国曼也表明该菌株是目前所描述的所有菌株中最具致病性的b . tenagophila作为中间宿主。在实验室动物实验中观察到的SD菌株具有更大的致病性，证实了在受污染地区洗澡时感染的患者的临床检查结果b . tenagophila［10，11］．Freitas和Oliveira [10]已经观察到其中一些患者有脊髓病。脊髓病被认为是由曼氏裂体吸虫感染，所有证据表明寄生虫卵是其临床表现的原因[21］．

目前的研究结果似乎表明，更严重的临床形式美国曼免疫能力强的个体的相关血吸虫病可能是由较高的寄生虫载量、较高的蠕虫繁殖力和更多的虫卵引起的。所有这些都导致更严重的组织损害，由于更多的血吸虫肉芽肿。这种疾病的严重程度也可能归因于吸虫卵的体积更大，在宿主体内产生更多的抗原，从而提高宿主的敏感性，促进炎症，进而造成更大程度的组织损伤。

根据本研究提供的数据，准确评价美国曼致病性必须基于寄生虫的几个生物学特性:肉芽肿反应中涉及的免疫调节作用、诱导肉芽肿的吸虫卵抗原、宿主的遗传特性[22]，以及血吸虫病在小鼠和人的临床表现中的寄生虫载量。

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