B细胞IgD删除感染小鼠口服后可防止牙槽骨丢失

文摘

牙周疾病是人类最常见的传染病之一。对感染的免疫反应引起的损失从下颌牙槽骨和牙齿脱落。我们研究了B细胞IgD牙槽骨丧失的贡献通过比较B细胞的反应正常BALB / cJ老鼠和IgD BALB / c-Igh -不足小鼠口腔感染Porphyromonas gingivalis的革兰氏阴性细菌periodontopathic人类。p . gingivalis来华的正常小鼠骨丢失。特定的抗体p . gingivalis是低,口服殖民更高IgD缺陷小鼠;然而骨质流失完全缺席。感染增加的比例CD激活B细胞和CDT细胞免疫正常小鼠相比IgD不足的老鼠。这些数据表明,IgD牙槽骨吸收是一个重要的中介,可能通过抗原coactivation B细胞和CDT细胞。

1。介绍

牙周疾病是人类和其他哺乳动物的传染病导致软组织损伤和牙周韧带的齿龈,下颌牙槽骨的吸收,,最终,掉牙。越来越明显的是,有广泛的免疫系统之间的交互和相声和骨重建。这个新概念对我们如何看待有广泛影响的原因和调节骨吸收,并产生一个名为近年来的新领域(1,2]。骨不断重构,成骨细胞骨和破骨细胞分解。在一种健康的状态,这两个过程是平衡和骨的密度保持稳定。这种平衡是中断在各种疾病,包括监测再吸收的疾病,慢性牙周炎。在这个牙周病牙槽骨的进步的损失在很大程度上是由免疫反应的一个小子集激活超过600种细菌在口腔(1]。在小鼠模型中,我们已经开发出之前,我们已经表明,牙槽骨丧失的下巴可以通过口腔感染引发的600年口腔细菌物种,Porphyromonas gingivalis从人类,periodontopathic革兰氏阴性厌氧菌3,4]。我们和其他人已经表明,口腔感染B淋巴细胞和CDT淋巴细胞的免疫系统引发骨吸收(1,3- - - - - -5]。

尽管牙周疾病的患病率,骨质流失的途径并不完全理解。在最良好的途径,感染移植受体激活剂NF -配体的表达B (RANK-L)在特定antigen-activated B和CDT淋巴细胞。然后这些免疫细胞可以绑定到preosteoclasts排名,引发骨吸收(4- - - - - -7]。我们希望探索是否有其他免疫细胞表面分子可以诱导骨质疏松。在本研究中我们使用老鼠缺乏IgD的B淋巴细胞表达,B细胞表面免疫球蛋白已知参与激活B细胞和T细胞同源,但不知道参与骨重塑。

免疫正常小鼠和人类表达的膜结合IgD连同IgM表明一个B细胞经历了亲和力成熟,可以开始与特定的抗原反应,分泌可溶性抗原的抗体。本-老鼠有一个有针对性的突变,删除的表情沉重chain-5 (Igh-5)的delta-like IgD免疫球蛋白重链(8]。老鼠缺乏IgD显示延迟B细胞亲和力成熟(8]。此外,B细胞膜IgD表示的是IgD受体的配体激活的CDT细胞(9]。绑定的IgD IgD受体促进B细胞抗原表达CDT细胞通过稳定T细胞受体结合MHC抗原/复杂。这种同源互动增加抗体反应的B细胞和T细胞抗原的克隆扩张(9]。因此,我们使用本——设计实验老鼠来测试假设IgD可以在应对导致牙槽骨丢失p . gingivalis感染。

2。材料和方法

2.1。动物

特定的无菌BALB / c-Igh -老鼠IgD不足是由于特定的删除本基因(8)和基因与免疫法向应变BALB / cJ收到杰克逊实验室(美国我巴尔港)。老鼠在动物养殖区贝茨学院前面描述的条件下(10]。实验协议是审查和批准的机构动物保健和使用委员会,贝茨大学。

2.2。细菌

p . gingivalis写明ATCC 53977 (A7A1-28)保持冷冻去纤维蛋白的羊的血液c为实验、细菌都被厌氧增长低于5%股份有限公司₂,10% H₂和85% N₂在C 4 - 7天补充血琼脂包含trypticase大豆琼脂基酵母提取物,0.1%氯高铁血红素(5.0甲萘醌(0.5 g / mL)g / mL), 5%去纤维蛋白的羊的血液。细菌被移除的盘子,温柔地悬浮在磷酸盐(PBS)和稀释10¹⁰集落形成单位(CFU)每毫升光密度的基础上。飞行员系列稀释的实验p . gingivalis镀了菌落计数表明,1:10 0稀释10¹⁰CFU /毫升p . gingivalis在650纳米光学密度0.3。

2.3。口腔感染

每组实验包含十的同龄雌性老鼠,14到16周大开始实验。老鼠给磺胺甲恶唑(0.87毫克/毫升)和甲氧苄氨嘧啶(0.17毫克/毫升)(Sulfatrim、Goldline实验室、劳德代尔堡FL,美国),随意在饮用水10天,紧随其后的是为期3天的不需抗生素的时间。老鼠被感染填喂法针和直接口服暴露在为期两天的间隔10的三倍⁹CFU的生活p . gingivalis100年L 2%羧甲基纤维素的PBS。控制收到了抗生素与羧甲基纤维素预处理和三个sham-infections没有p . gingivalis。最后填喂法42天后,老鼠被公司实施安乐死₂(3]。重复实验得出相同的结果;一个实验的结果。

2.4。牙槽骨丧失的测量

水平骨质流失的上颌磨牙defleshed头骨是评估在解剖显微镜下(40)装有视频图像标记测量系统(模型通过170年,Boeckeler仪器,Inc .,图森市阿兹,美国)标准化给测量的分数毫米。cementoenamel结的距离(CEJ),牙冠的搪瓷满足牙根的牙骨质,牙槽骨嵴的下巴(ABC)以共有14颊网站/鼠标(测量位置的网站看到照片(11])。测量是在盲目的协议进行的调查。

牙槽骨消融掉,另外根牙骨质暴露和距离CEJ ABC变大的新位置。CEJ ABC是更大的比sham-infected小鼠感染小鼠,发生骨质疏松。CEJ ABC距离不为零;因此,CEJ ABC距离个人网站在被感染的老鼠被从距离的均值减去了该网站在sham-infected老鼠,骨骼的变化给mm在那个网站。

2.5。Reisolation的p . gingivalis从口腔

安乐死的时候,细菌从口腔收集的样本使用每个鼠标放置在一个无菌纸尖CEJ 5秒的左边三个上颌磨牙的颊面,沿着右边的臼齿5秒。每个样本分别镀和孵化如前面所描述的10]。

2.6。p . gingivalis特殊的抗体

从每个老鼠血液收集的安乐死。血清是储存在C特定IgM的后评估,免疫球蛋白,和IgA抗体酶联免疫吸附试验(ELISA),如前所述[10),在聚苯乙烯板(合演,康宁公司,康宁,纽约,美国)涂上formalin-killed整体p . gingivalis写明ATCC 53977。ELISA效价是定义为最高的血清稀释的倒数(表现在日志中₂)生产的吸光度读数超过两个标准差以上背景水平。的p . gingivalis特殊效价每个受感染的动物被减法计算的平均值sham-infected鼠标应变的动物。

2.7。流式细胞术

脾脏时收集安乐死。五十l的小鼠脾细胞的密度细胞/毫升洗4毫升的洗缓冲区(0.2 g氯化钾,8.0克氯化钠,1.15 g Na₂HPO₄,0.2 g KH₂阿宝₄和0.2克南₃每升7.2 pH值)和颗粒状,享年110岁g 10分钟c丸resuspended在1毫升的清洗缓冲和10被封锁l正常大鼠的免疫球蛋白(σ化学公司,圣路易斯,密苏里州,美国)和孵化15分钟c细胞应用30分钟C与10 ul prediluted仓鼠antimouse CD69共轭FITC显示激活状态,或phycoerythrin-conjugated仓鼠antimouse CD19马克B细胞或仓鼠anti-mouse CD4 CDT细胞和FITC -或phycoerythrin-labeled仓鼠免疫球蛋白为同形像控制(杰克逊实验室,巴尔港,我,美国)。Unadsorbed抗体被通过添加清洗缓冲和离心法在60岁g 10分钟c细胞resuspended在0.5毫升流式细胞术缓冲区(洗缓冲区添加了5毫升/ l胎牛血清)。五l propidium碘的20倍g / ml被添加到决定细胞生存能力。数据获得FACSORT (becton dickinson,圣何塞、钙、美国)并使用CellQuest进行了分析。淋巴细胞是封闭的基础上向前散射和入射光的散射12]。

2.8。统计数据

差异之间的感染和虚假的团体和被感染的老鼠不同的菌株被双尾评估,未配对测试(Excel;美国微软,微软,佤邦)。

3所示。结果

口腔感染的影响p . gingivalis在牙槽骨图所示1。在BALB / cJ小鼠与正常IgD水平CEJ ABC距离比sham-infected小鼠在感染大鼠的每个14测量网站,表明感染BALB / cJ老鼠失去了骨头在每个站点(图1(一))。相比之下,在IgD缺陷小鼠CEJ ABC的距离是相同的在被感染的老鼠sham-infected老鼠,显示没有B细胞IgD老鼠在任何网站(图没有失去的骨头1 (b))。

求和的骨骼改变14网站另外表明骨质疏松发生在免疫正常老鼠但不是IgD不足的老鼠。总结变化在正常B细胞感染BALB / cJ老鼠的意思毫米的骨头。相比之下,总结骨感染了IgD缺陷小鼠的变化毫米()。

确保缺乏骨质流失不能解释为缺乏感染,我们分离p . gingivalis由纸尖从口腔龋齿。p . gingivalis在场的两株感染小鼠,并没有出现在任何未受感染的老鼠(数据未显示)。的p . gingivalis负载是高得多(的意思每板殖民地,)IgD缺陷小鼠比正常小鼠免疫的意思每板殖民地(数据未显示)。

细菌负荷的差异可能反映了鼠标的生产菌株之间的区别p . gingivalis特殊血清抗体。感染后,鼠标菌株产生特定抗体反应显著提高()比背景水平sham-infected动物(数据未显示);然而,每个三个抗体的滴度同形像在受感染的老鼠低IgD缺乏小鼠比正常小鼠免疫()(图2)。

尽管血清抗体滴度的差异,本-老鼠是已知正常比例的B细胞(8]。这是我们的实验证实了通过流式细胞仪测量在安乐死,42天postinfection通过对比sham-infected两个菌株的老鼠。B细胞的平均百分比较高IgD基因敲除小鼠比正常小鼠,但两个鼠标菌株之间的差异没有统计学意义(图3(一个))。在没有鼠标应变p . gingivalis感染改变总B细胞的百分比与sham-infected老鼠(图3(一个))。尽管总B细胞比例不变,更高比例的B细胞被激活在感染BALB / cJ小鼠感染IgD基因敲除小鼠(;图3 (b))。

我们也检查了CD在这两个品系小鼠T细胞数量。在BALB / cJ老鼠p . gingivalis感染导致的平均百分比显著增加总可行的CDT细胞与sham-infected BALB / cJ老鼠()。然而,IgD缺陷小鼠感染不会增加CDT细胞数量(图4(一))。同样,感染激活CD小鼠T细胞在BALB / cJ,见CD6比例的增加CDT细胞,但它没有激活T细胞IgD缺陷小鼠(图4 (b))。

4所示。讨论

在这项研究中,我们表明,小鼠B细胞表面缺乏IgD不经历口腔感染后牙槽骨丢失p . gingivalis(图1)。缺乏骨质丢失的一个可能的解释可能是,老鼠被减少负载的殖民地p . gingivalis。Reisolation的细菌消除这种可能性;IgD缺陷小鼠实际上存在的这种细菌数量高于免疫正常小鼠。更高的殖民可能是由于较低的抗体滴度IgD不足(图中发现的2)。这些减少浓度与早期的研究一致表明,减少抗体反应是由于延迟亲和力成熟这种IgD突变的特征(8]。以前的研究表明,免疫正常小鼠抗体可能会降低细菌负荷但抗体不是预防骨质疏松:较低的抗体滴度不会导致更多的骨质流失13]。

我们不能完全排除另一种可能性;即,抗骨质疏松的IgD老鼠不足是由于残余污染的等位基因129或C57BL / 6祖菌株。的本淘汰赛上生成最初C57BL / 6基因定位和遗传背景的胚胎干细胞系来源于小鼠应变1298]。BALB / c-Igh -老鼠所产生的回交在BALB / cJ应变七代。应变BALB / cJ基因容易骨质疏松后口腔感染p . gingivalis,菌株129和C57BL / 6显示中度抗骨质疏松在一些实验11];然而,老鼠在每个队列后失去骨感染。在七个回交一代祖基因型预计将被稀释1在2⁷,不到0.8%的祖等位基因带入BALB / cJ基因组,然后只有在与目标密切相关本基因。在本文中给出的实验,没有感染BALB / c-Igh -鼠标显示增加CEJ ABC距离(我们的骨质流失的措施),超出一个平均数标准误差值夏姆斯;即距离CEJ ABC在每个受感染的老鼠是偏差范围内的虚假的老鼠。因此我们认为这不大可能,没有骨质疏松中观察到受感染的老鼠是乘客的结果129或C57BL / 6基因位点而是一种内在的特征本缺乏。

我们建议的抗骨丢失是由于IgD B细胞不足无法充当costimulators抗原的T细胞。T淋巴细胞和其他细胞是正常的在本-老鼠(8]。T细胞IgD凝集素受体,并绑定到O-glycans B细胞表面IgD免疫球蛋白(14]。这些IgD受体存在于非常低的外周T细胞的数量,但搬到反应活化的表面膜抗原(9]。抗原特异性T细胞的调节IgD受体结合在B细胞IgD轴承相同的抗原,稳定之间的T细胞受体/ MHC II连接两种类型的淋巴细胞,促进活化的。

其他形式的聚集有关已被证明在牙槽骨丢失是很重要的。炎症引起的骨吸收Aggregatibacter(原放线杆菌)actinomycetemcomitans需要激活的Th1 CD激活T细胞,这需要B7 T细胞表面的聚集有关。阻断B7废除聚集有关,抑制骨吸收在老鼠模型中(15]。目前的结果表明,B细胞IgD绑定到CDT细胞IgD受体途径聚集有关的B细胞和CDT细胞在p . gingivalis全身疾病。我们的实验表明,口腔感染的免疫正常小鼠p . gingivalis导致血清抗体反应(图2,表明B细胞活化)和更高的数字和激活的CDT细胞(图4)。相比之下,本-老鼠缺乏IgD显示少B和T细胞的活化。他们产生了抗体滴度较低(图2),有更少的激活B细胞(图3),没有显示增加人口或激活T细胞在感染后42天(图4)。

的机制这同源B和T细胞活化刺激骨质流失是未知的。它不可能是由于IgD删除在抗体分泌的影响,如抗体不是预防骨质流失13]。骨质疏松的研究免疫途径之一是upregulation RANK-L激活淋巴细胞。B细胞和T细胞活化后表达膜结合和可溶性RANK-L [16,17,可以引发骨质流失的绑定preosteoclasts配体排列。然而,光盘和CDT细胞活化后可以表达RANK-L [16]。我们已经表明,CDT细胞及其细胞因子参与了老鼠的牙槽骨丢失,但这CDT细胞是不(3]。其他人也有牵连的CD细胞(2,15,18),这表明有可能的途径除了RANK-L特别的CD但不是CDT细胞。虽然我们有一些初步的数据显示,CD的比例脾细胞表达膜表面RANK-L是相同的在感染免疫正常小鼠,失去了骨头在IgD缺乏的老鼠没有失去骨(数据未显示),我们没有检查RANK-L表情T、B细胞齿龈。

一个可以区分CD通路和CDT细胞是这些实验建议的途径,即通过T细胞IgD受体激活。在小鼠中,只有CDT细胞表达IgD受体和CDT细胞不能参加聚集有关(9]。CDT细胞和B细胞相互作用可能提供足够的放大RANK-L upregulation细胞触发破骨细胞在很大程度上局限于B细胞和CDT细胞。汉等人表明,过继转移antigen-responsive B细胞能诱导骨质疏松大鼠先天无胸腺的不足,因此T细胞(19]。B细胞可能独自一人负责对骨质疏松的影响在这些实验中,但CD的激活T细胞在一段时间(42天postinfection;图4)认为,T细胞活化在至少一个放大的作用,通过RANK-L或通过增加骨吸收细胞因子的分泌3,20.]。

5。结论

基因删除IgD所示降低T细胞和B细胞的激活和抑制小鼠肺泡骨质流失。这项研究表明一个新的口腔感染途径p . gingivalis会导致牙槽骨的损失。针对口腔感染,IgD B细胞表面结合IgD受体CDT细胞,导致coactivation B和T细胞的免疫系统。这样的B和T细胞激活可以,反过来,激活破骨细胞,引发骨质疏松。慢性牙周炎是一个广泛的传染病;因此,说明感染引发的免疫反应的机制是临床重要的伤害而不是保护。

承认

这项研究是由美国公共卫生服务补助R01 DE10728 PJB R01 DK56597 DCR和霍华德休斯医学研究所的资助,贝茨大学。

引用

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