结合微阵列技术和分子流行病学鉴定侵袭性B组相关基因链球菌

摘要

许多细菌既是共生菌又是病原体;我们利用这种双重性质开发了一种高通量的分子流行病学方法来鉴定细菌毒力基因。我们将我们的方法应用到B组链球菌（GBS）。选择三个代表性的共生和一种侵入性GBS分离物作为基于人口的收集的测试菌株。我们使用基于微阵列的比较基因组杂交，以鉴定在两个测序的侵入性菌株中存在的开放阅读框（ORF），但在测试菌株中没有或发散。我们在幻灯片（LOS）微阵列平台上使用GBS库筛选了针对949 GBS隔离的23个变量ORF。侵入性比共生隔离液更频繁地发生四个ORF，并且在共生隔离中似乎更频繁地出现。使用寡核苷酸微阵列的比较杂交，使用LOS微阵列平台结合流行病学筛选，使能潜在与致病性相关的细菌基因的快速鉴定。

1.介绍

B组链球菌(GBS),或链球菌agalactiae，一种常见的肠道居住者，也经常无症状地寄生在阴道、尿道和咽。然而，GBS可导致多种侵袭性疾病，主要发生在新生儿、幼儿、老年人和孕妇[1- - - - - -3.］．宿主因素显然很重要，因为GBS疾病主要发生在脆弱人群中。尽管如此，细菌的毒性因素也必须发挥作用:引起疾病的倾向因血清型而异[4[已识别出具有高潜力造成侵入性疾病的血清型的遗传序列类型[5］．

在九个已知的GBS荚膜血清型中，血清型Ia，III和V导致美国大多数GBS病[1，6- - - - - -8］．对GBS分离株的种群结构和分子流行病学的研究表明，GBS种群是无性的，但一些菌株可能比其他菌株更具毒性[9- - - - - -13］．通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)，致病菌株在一个血清型中具有有限的异质性(Schuchat, 1998年综述[2]）在殖民化分离物是非常异质的同时14，这表明侵入性菌株具有增强发病机制的独特特征。毒性差异可能与毒性基因的存在或缺失有关[15］．尽管在对GBS的经典性状如荚膜多糖的理解上取得了一些进展，-溶血素、C5a肽酶和免疫原性表面蛋白[16- - - - - -19[我们对GBS感染的发病机制有限的理解有限：众所周知，细菌遗传因素有助于毒力或致病菌菌株的传播。

几种GBS菌株的完整和草案基因组序列的可用性提供了进入GBS毒力的分子基础的洞察力的机会。对这些基因组序列的分析证实了GBS菌株中的高水平遗传异质性，即使是相同的血清型[20.］．GBS基因组含有大量遗传岛，通常在菌株中变化，并且可能是毒力基因所在的区域[21- - - - - -23］．在GBS基因组中发现了数千个基因，目前的挑战是确定哪些基因在GBS发病和传播中重要。在之前的研究中大肠杆菌，我们提出了一种细菌基因鉴定和评估的方法，该方法依赖流行病学信息来选择分离菌进行基因组减除，并筛选流行病学定义的收集物来评估通过基因组减除确定的基因的重要性[24］．在本报告中，我们在GBS研究的三步战略中应用了相同的原则。此外，我们使用了新的微阵列平台，使我们能够系统地识别候选基因并评估大规模的重要性。

一个物种内致病菌株和非致病菌株之间的基因组比较是识别对毒力重要的候选基因的一种强有力的策略[25，26］．由于目前序列的GBS基因组都没有来自非共生分离株，因此我们首先从群体的样品中选择一些代表性的GBS菌株，以进行测序的致病性血清型III菌株（NEM316）和血清型V株（2306VR），代表两种血清型最常遇到的疾病导致的分离株。然后，使用与细榫寡核苷酸微阵列的比较基因组杂交，我们在选定的定植和测序的侵入性GBS菌株之间鉴定了序列差异及其相关的可变基因。最后，使用载玻片微阵列上的文库筛选一个选定的一组可变基因，使用图书馆在载玻片微阵列上进行侵入和侵入菌株来评估它们与疾病的关联。本报告的主要目标是使用GBS作为示例来证明和评估这项研究方法。

2。材料和方法

２.１.菌株和培养条件

致病和共生GBS分离物是从以前的流行病学研究中获得的各种收集物中选择的。收集的标本包括来自密歇根大学健康男性和非怀孕女性大学生的分离物[27- - - - - -30.，分离自密歇根大学医学中心诊所的有症状和无症状孕妇[31，以及1998年至2002年威斯康辛侵入性细菌实验室监测系统从病人身上收集的分离菌[32］．德克萨斯州新生儿的另外的分离株，早期和晚期发作疾病[8]以及从患有和不患有GBS疾病的孕妇中分离的病毒均从Carol J. Baker博士(Baylor College of Medicine, Houston, Texas, USA)处获得。这些菌株大致分为两类:来自侵袭性疾病患者的侵袭性菌株(）从受试者中殖民和没有任何症状性疾病的分离物（)．GBS菌株NEM316 [21), 2603 vr (23]及A909 [33]作为参考菌株。GBS分离株在Todd-Hewitt broth (Oxoid)中培养过夜进行DNA分离。

2.2。PFGE和张囊打字

如前所述进行PFGE [30.］．简单地说，GBS DNA被消化了SMA.I和电泳18小时(初始开关时间4秒;最后切换时间16秒)与CHEF III仪器(Bio-Rad，大力神，CA)。凝胶用Vistra Green (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)在4℃下进行4 h的过滤，并用Storm磷酸化成像仪(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)进行可视化。PFGE模式使用BioNumeric软件(Applied mathematics, Kortrijk, Belgium)进行分析。采用算术平均数、Dice系数、优化设置为1.0%、位置公差为1.0%的非加权对组法构建树状图。使用DNA点杂交技术将GBS分离株分为荚膜型Ia、Ib和II-VIII，如前所述[34］．

2.3。GBS寡核苷酸微阵列结构

使用已发表的血清型III菌株（NEM 316，GenBank登录No.Al732656）和血清型V株（2603VR，GenBank登录No.SE009948）设计了两种微晶寡核苷酸微阵列。NEM 316阵列组成，总共368,576个32-MEL探针（184,288对）每12个碱基均为其2.21 MB基因组。2603VR阵列由总共360,040个32-MEL探针（180,020对）连续其每12个碱基的2.16 MB基因组。通过来自Nimblegen（麦迪逊，WISS，USA）的自定义阵列CGH服务设计和构建了阵列，使用其无掩模阵列合成（MAS）技术。具有较短寡核苷酸的密度平铺阵列通常用于Nimblegen的两步比较基因组测序（CGS）[35］．

２.４.比较基因组杂交和数据采集

比较基因组杂交和信号处理由NimbleGen定制服务公司(NimbleGen Systems Inc.， Madison, Wiss, USA)完成。简单地说，从4个测试菌株和2个参考菌株的GBS DNA被分解成不同的低分子量片段池，分别用花青素荧光染料标记，并与一个NEM316和一个2603VR全基因组拼接阵列杂交。与Affymetrix芯片类似，短寡聚GBS阵列是通过幻灯片从头合成的。与Affymetrix芯片杂交一样，每个标记样品使用一个载玻片进行杂交。共进行了12次微阵列杂交。NEM316或2603VR与自己阵列的基因组杂交作为与使用相同阵列的测试菌株杂交的信号参考。基因组杂交的一个测序基因组与另一个测序基因组阵列用于验证目的。比较检测者DNA与每个参考DNA的信号强度比，以确定检测者基因组缺失或不同的探针序列。将信号强度归一化(设置中值比为1，标准差为0.45)，将每条链的参考数据除以测试器，然后将两股链平均。利用NimbleGen的SignalMap软件，将信号比率作为它们基因组位置的函数绘制出来并进行可视化。 A custom algorithm was used to mark the potential variable probe sequence (absent or different in tester genome) based on comparison to a local threshold (a 1800 bp window). This analysis was also performed by NimbleGen (see Supplementary Material available at doi:10.1155/2007/14762 for the analytical algorithm).

2．5．其他生物信息和数据分析方法

利用GenomeComp对NEM316和2603VR的基因组进行基因组规模序列比较[36］．使用设定为0.01的运行参数鉴定大于10bp的所有应变特异性遗传群岛，，期望值(e)为1，不匹配的惩罚为1，匹配的奖励为1。为了在另一个测序的基因组中确定一个细平铺寡基因阵列的探针序列，使用了一个定制的Bioperl程序进行本地批量blast分析。独立的BLAST程序[37]，并确定查询基因组中每个探针的最佳命中百分比。所有其他数据分析使用SAS v9.0 (SAS Institute, Inc Cary, NC, USA)和S plus v6.1 (insights Corporation, Seattle, Wash, USA)进行。

2.6。GBS文库的构建和杂交

我们最近开发了一种微阵列技术的新应用，称为Library on a Slide (LOS)，用于细菌比较基因组学研究[38］．LOS技术将斑点杂交技术与微阵列技术相结合，从而产生成千上万的细菌基因组排列的玻片。因此，载玻片上打印的是整个基因组的文库，而不是单个基因组或一组基因的序列。载玻片用于筛选大量菌株中是否存在感兴趣的特定遗传元素。利用从各种GBS标本和各种对照菌株中采集的949株GBS分离株的基因组DNA构建了GBS LOS微阵列。基因组DNA分离使用高通量超声方法，如前所述[39］．来自GBS菌株的DNA以及对照的DNA在VIVIVE基因阵列（PALL Life Sciences，MICH，USA）上一式两份排列，使用Versarray Chipwrits Compact Slarer（Bio-rad，Calif，USA）。选择的GBS ORF和四个房屋保持基因，（酒精脱氢酶（adhP)、苯丙基tRNA合成酶(ph），谷氨酰胺合成酶（glnA)和葡萄糖激酶(glcK）），从菌株NEM316或2603VR中被PCR扩增。纯化的PCR产物是使用Biopry DNA标记试剂盒（Invitrogen，Calif，USA）标记的荧光素标记。每种探针用不同的载玻片杂交过夜C在PerfectHyb Plus杂交缓冲液（Sigma，Mo，USA）。洗涤后，使用抗真菌素碱性磷酸酶（Roche，瑞士）和碱性磷酸酶试剂盒（Telechem，Calif，USA）检测荧光素标记的探针。每个斑点的强度被标准化为定量探针的强度（四个内脏基因的混合物），以考虑不同斑点的DNA浓度的差异，并与阳性对照的强度进行比较（已知含有基因的序列菌株探针）使用先前建立的方法测定不同细菌菌株中基因片段的存在/不存在[38，40］．

3。结果与讨论

3.1。对比较基因组减法的测试菌株的选择。

比较一个物种内的致病菌株和非致病菌株可以为细菌致病机制提供重要的见解。然而，所有测序的GBS菌株都来自侵袭性疾病。我们采用分子流行病学比较的方法，选择具有代表性的共生定殖GBS菌株，进行比较基因组杂交，以鉴定入侵基因组(菌株NEM316和2603VR)中潜在致病相关基因。我们对来自健康男性和非怀孕女性大学生的基于人群的纵向研究中的882个定殖分离株进行了特征分析[28使用PFGE和血清分型。将这些分离菌株与35株入侵菌株进行树状图聚类分析，并对致病菌株NEM316和2603VR进行测序。基于这一分析，我们选择了三个与两个测序基因组在遗传上距离较远的共交分离株，但它们代表了来自主要来自共交来源的相对较大的菌株群的分离株。分离株657-461是一株V型血清毒株，在我们的共同收集中是最大的克隆群。分离株G617-061(血清型III)和G293-061(血清型II)来自另外两个以定殖菌株为主的群集。除了这三个共交分离株外，我们还选择了一个侵袭性分离株H-19进行比较基因组减除，因为在我们的分析中，它代表了血清群Ia菌株最常见的克隆型。因为血清型分类不一定反映菌株之间的遗传距离[20.，我们并没有仅仅根据血清型的差异来选择试验菌株。这里选择的少量定殖菌株不能也不打算捕捉共生菌株的多样性。这是我们第一次尝试在定植菌株和测序基因组之间进行全基因组比较，因此我们可以从数千个基因列表中选择候选基因，使用LOS微阵列进行关联研究，以筛选大量基于群体的GBS分离物。

3.2。寡核苷酸阵列验证

我们使用两个基因组阵列共享的探针序列来评估比较基因组杂交的重现性，并使用一个测序基因组与另一个测序基因组的杂交来评估该基因组阵列在评估序列变异时的准确性。

在NEM316阵列上的184,288探针对和2603VR阵列上的180,020探针对中，鉴定了总共16,364个相同的探针对（32/32匹配）。从每个测试仪基因组的两个阵列的该探针子集的杂交结果被视为用于访问CGH的再现性的复制品。与参考基因组相比，每个探针的杂交被分类为测试仪基因组中的相同或变量。测试仪Genomes G293-061，H1-19，G617-061和G654-461和G654-461的百分比分别为98.75％，99.50％，99.88％和98.62％。即使在检查原始信号比率时，再现性也非常高。复制的相关系数大于90％。

为了评估评估序列变异的阵列的准确性，我们将来自硅杀核分析的结果与NEM316和2603VR基因组之间的实际阵列杂交交换的分类进行了比较。几乎所有完全匹配的探针序列都被杂交正确鉴定为相同。在133,520中只有4分中的43,570个探针序列中的4个分别与NEM316和2603VR阵列分别被错误地识别。然而，在46,450（56％）和25,435分中，28,673分中的28,673（55％）分别与NEM316和2603VR阵列相同。在探针水平下，杂交具有高灵敏度但对检测保守探针序列的特异性具有很低的特异性。尽管如此，平铺阵列的高密度性质仍然在基因组和ORF水平下提供总体序列变异信息。我们通过绘制探针的杂交信号比沿其基因组位置绘制并与NEM316和2603VR的硅比较进行比较，通过绘制探针的杂交信号比来显示CGH结果。大多数可变探针（即，具有高参考与测试仪信号比的探针）主要聚集在由Silico分析中鉴定的应变特异性遗传岛周围聚集。为了将探测级别变化转换为ORF序列变化，我们计算了每个ORF的可变探针的百分比（在ORF中识别的可变探针的数量除以折叠ORF的总数）。在分类变量ORF中使用不同的百分比截止值（发散或不存在），将基于CGH的数据与Silico分析进行比较（表1)．对于NEM 316阵列，15%的截止值给出2.9%的假阴性率(即已知存在但被杂交分类为不存在或非常分散的orf)和最佳的整体敏感性和特异性(分别为97%和94%)。对于2603VR阵列，20%的截止点提供了最佳的总体灵敏度和特异性(分别为97%和91%)。因此，选择这两个截止点对变量orf进行分类，用于其余的CGH分析。

用细平铺32聚寡核苷酸微阵列进行基因组杂交比较，并没有识别出两个参考基因组中所有探针序列的变化，但使用每个ORF中所有探针的混合杂交结果可靠地识别出可变的ORF。

3.3。可变探针序列的分布和映射

使用NEM316和2603VR基因组阵列的CGH显示，在四个测试仪菌株中不存在或发散3.4-15.4％（表2)．这种多样性的范围类似于最近在所有8个可用的完整或草拟GBS基因组序列的两两比较中观察到的序列差异(5%至15%)的范围[20.］．平铺阵列允许比较菌株之间的基因组变异的高分辨率视图。数字1显示检测菌株与2603VR的杂交结果，通过沿着其基因组位置绘制检测菌株信号比的参考曲线。虽然这四种检测菌株代表四种不同的血清型(Ia、II、III和V)，但这些菌株中大多数缺失或不同的探针序列都被定位到NEM316基因组上的同一组区域，即III血清型菌株。在较小程度上，2603VR基因组上的同一组区域覆盖了四个测试基因组中三个没有或存在分歧的大多数探针。G617-061为III型血清株，与V型参考株2603VR基因组非常相似，仅鉴定出3.4%的探针与V型参考株不同其他13％的其他测试仪基因组。所有八种可用或草稿GBS基因组序列的比较还证明了血清型分类并未反映GBS的遗传多样性[20.］．表现出不同胶囊的密切相关菌株的一个可能的解释是通过水平基因转移测定荚膜囊型的基因的遗传交换。

3.4。NEM316和2603VR ORF在测试仪基因组中缺席/发散

通过通过分析对照实验（上文描述的）建立的标准来使用来自每个ORF内的所有探针的杂交结果来确定测试仪基因组中的存在或不存在/发散。在NEM316基因组内的2134个ORF中，将484（22.7％）鉴定为可变ORF，因为它们在至少一个测试仪基因组中被分类为不存在/发散。它们中的269（56％）在四个测试仪基因组中不存在/发散，分别分别在1,2和3个基因组中归类为不存在/发散的96,84和35。在2603VR基因组内的2124个ORF中，将530（25％）鉴定为可变ORF。其中，81,121,162和166分别分别在4,3,2和1个测试仪基因组中被分类为不存在/发散。两参考基因组的成对基因组对准分别鉴定了菌株特异性区域，分别在NEM316和2603VR中占总长度为288kb和239kb的菌株特异性区域。在这些应变特异性区域内的大于95％的ORF在我们的CGH中被鉴定为具有四个测试仪基因组的可变ORF，其中2603VR的NEM316可变ORF的64％（309/484）和52％（275/530）可变orfs。CGH鉴定的约80％的可变ORF位于先前在NEM316中识别的14个推定的致病群岛内[22］．

为了研究这些可变orf属于哪些功能组，我们将orf分为同源基因簇(COGs) [41］．数字2显示每个COG类别中的变量ORF的数量。大约一半的变量ORF没有被分类为COG并且具有未知的功能。最常见的可分类变量ORF属于DNA复制，重组和修复的COG类别。这可能归因于参考基因组中的集成噬菌体或质粒存在。预计将涉及运输，调节，中间代谢和细胞壁代谢的大量变量ORF。这些基因对于维持侵袭性GBS菌株的致病性寿命和传播可能是重要的。这些类别中的基因也通过体内研究鉴定，其中签名标记的诱变和新生大鼠模型用于鉴定涉及毒力的新型GBS基因[42］．参与辅酶运输代谢和脂质运输代谢的可变orf相对较少。

3．5．ORFs在至少两个共生起源的测试者基因组中缺失/发散

与侵入性菌株相比，ORF在共生测试仪中持续/发散可能是毒力基因候选者。在所有三个共生测试仪中缺乏/分歧，并在两种侵入性参考基因组和侵入性测试仪中保存六个ORF。我们鉴定了来自三个非共生菌株中的至少两个中不存在/发散的参考基因组的另外的29个ORF（表3.)．这35个orf中有15个被推测为功能未知的蛋白质。一些orf被预测为参与运输、代谢和其他代谢功能的蛋白质。还包括两个假定的脂蛋白和两个表面蛋白。基因gbs0850被预测编码一种纤维蛋白原结合蛋白，并且与先前鉴定的相同FBSB.基因[43，44］．2603VR中gbs0850的最佳匹配是ORF sag0832，它编码纤维蛋白原结合蛋白的另一种变体。ORFs gbs2015和gbs2016是两个相邻的基因，DNA序列高度相似，预测编码糖基转移酶。在2603VR的基因组中也发现了这两个基因，分别为sag2060和sag2061。

虽然我们确定了大量的可变ORF，但在所有三个甚至两个共生测试员菌株中都缺少很少。因为多种遗传因素参与GBS毒力和涉及不同毒力基因的多种发病机理途径可能存在，因此当比较不同对侵入性和定植分离株时，我们可能期望鉴定不同的毒力基因。

3.6。载玻片杂交和差异分布变量orf上的GBS库

所有可变ORF都是潜在的毒力基因候选者。使用具有大量GBS隔离的新型GBS LOS微阵列平台，可以有效地评估这些变量ORF的重要性。我们展示了使用GBS LOS确定的35个ORF中的23个初步评估。由于其小尺寸或差的PCR扩增，我们无法在我们的初始尝试中综合具有强大和特异性信号的良好探头。因此，我们将它们从此初始LOS筛选中留出。GBS LOS微阵列含有来自949个GBS分离株的基因组DNA，该分离物一式两份印刷。其中，386例是侵入性疾病患者的分离物，563例是共同的殖民分离株。此外，LOS阵列含有各种对照菌株的DNA。桌子3.与殖民菌株相比，列出总GBS集合中的总GBS收集中的23 orf的患病率及其在侵袭性菌株中的流行率。SAG2060，SAG2061，SAG0832和GBS0474在侵入性分离物中更频繁出现，而不是在殖民化的共同菌株中。相比之下，在殖民分离株中比侵入性分离株更常见地发现SAG0814。

ORFS SAG2060和SAG2061是两个推定的糖基转移酶基因。糖基化在真核生物中许多生物过程中起重要作用，并且增加了糖基化在细菌中的作用的证据。许多表面表达的细菌结构如LPS，LOS，胶囊，鞭毛和致病细菌中的菌株是糖基化的[45- - - - - -47］．糖基化也可被细菌用来灭活抗生素[48，49］．有趣的是，糖基转移酶基因LIC2B.在流感嗜血杆菌在病例中含有比儿童的喉咙菌株的分离物更频繁地发现[50]。消耗机械研究应阐明这些GBS糖基转移酶在发病机制中的作用。

预测sag0832编码纤维蛋白原结合蛋白。该基因被认为是侵袭性GBS病的重要毒力基因。在脓毒症的小鼠模型中，野生型毒株比该基因灭活的同基因毒株毒性更强[44］．sag0832也被证明在体外促进GBS入侵上皮细胞[43］．除了3个编码已知蛋白的orf外，2个编码假设蛋白的orf (sag0814和gbs0474)在入侵菌株和定殖菌株之间也有差异分布。考虑到在已测序的基因组中存在大量没有已知功能的orf，这并不奇怪。其中一些orf可能涉及复杂的性状，在实验室条件下很难观察到，使用关联研究更容易识别。有趣的是，sag0814在共生菌株中比在入侵菌株中更常见。这种基因的缺失可能会增强毒性。在共食向病原体进化的过程中，细菌不仅获得毒力基因，还通过缺失而脱落基因[51］．促进共生生活方式的基因的缺失可以为毒力提供额外的进化途径。例如，雷氨酸脱羧酶基因的缺失大大提高了肠毒素活性志贺丽在其演变过程中[51］．

虽然在侵入性和共生分离物之间的23个变量ORF中的五个变量ORF中，但是这些ORF与侵入性分离物的关联既不是异常也不强劲。由于几个原因，这种结果并不意外。首先，我们预期某种程度的随机错误分类，以减少观察到的关联，因为侵入性菌株也可以是共生的，并且非侵袭性菌株可以成为机会主义病原体。其次，类似于许多细菌病原体内有几种不同的病例的存在，GBS中可能存在许多不同的病例。一种毒力基因可以与一种特异性GBS致病型的菌株强烈相关，但是当所有侵入性分离物包含在分析中时，关联不太明显。第三，GBS发病机制由不是一种但许多毒力基因和任何一个基因的致病程度也可能仅贡献。我们在额外的2000个分离液上筛选这些和更多变量ORF，以便执行更明确的分析。此外，纳入GB的人口结构可能会提高我们的分析和解释帮助。

通过对949株菌株的23个orf筛选，也发现了GBS的基因组含量差异显著。我们将每个分离物分配到一个基因型，根据是否存在所有23个探针检测。949株分离株共检测到503种基因型。利用这种分类方法，PFGE模式相同的菌株具有不同的基因组成。因此，用有限数量的基因探针分析GBS可以提供一种高度鉴别的分型方法。

4.结论

随着越来越多的细菌基因组被测序，后胚珠研究将重点识别毒力相关基因和这些基因的功能。我们使用了一种三步分子流行病学方法，采用两种新的微阵列平台，细榫寡核苷酸微阵列和载玻片上的文库，以鉴定可能导致GBS病的细菌毒力基因。在由CGH，35鉴定的数百种可变ORF中，在两种外出的三个共生测试菌株中缺乏/发散，但在两个侵入性参考基因组和测试仪侵入性菌株中存在。我们将这些ORF的23个针对949个GBS分离株，发现5个ORF在侵入性和共生分离物之间差异分布。我们证明这种方法可以迅速识别和评估可能与致病性相关的细菌基因。

在我们的方法中，我们采用基于微阵列的CGH而不是传统的基因组减法来识别配对共生菌株和侵袭性GBS菌株之间的遗传差异。传统的基因组减法只能取样一小部分菌株特异性基因。基于高密度瓦片寡核苷酸阵列的CGH使我们能够识别与共生GBS分离物相比侵袭性细菌特有的完整DNA序列。一个密度更大、长度更短的寡核苷酸阵列设计，再加上一个验证寡核苷酸阵列，可用于识别甚至是基因组中的单核苷酸多态性[35］．然而，基于CGH的基因组比较取决于测序基因组的可用性，此外，所鉴定的应变特异性基因被限制在测序的基因组上。我们无法检测和识别可能存在于其他未序列的致病GBS菌株中的潜在毒力基因。鉴于GBS种类的泛基因组性质，可变基因池非常大的[20.]，未来任何两个菌株的基因组比较可能依赖于一种廉价而快速的直接测序方法，如焦磷酸测序[52］．这种新方法将消除使用CGH的局限性。

一旦通过基因组比较确定了一组候选基因，更关键的步骤是评估这些基因在疾病发病机制中发挥的作用。这可以通过大规模的关联研究、生物信息学预测或生物功能分析来实现。生物信息学预测需要具有生物分子结构和功能信息的数据库。功能方法通常局限于可表征的毒性表型的存在。比较来自不同来源的细菌分离株的基因频率，例如致病菌株和共生菌株，使用统计关联，可以提供一个基因序列在发病和传播中的相对重要性。分离株的数量和收集的多样性对于确定所作观察的意义和确保有足够的能力检测关联是很重要的。需要大量的基于人口的样本，以最大限度地减少在小样本比较中经常出现的虚假关联的识别。将共生菌株(即非致病菌株)纳入研究是了解细菌发病机制的重要组成部分。LOS微阵列平台是一个强大的系统，适用于多种细菌病原体，可以有效地检测数千个分离株中候选基因的存在或缺失，从而提供一个真正高通量的系统来评估后基因组时代的基因。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院R01AI51675基金(BF)的资助。我们感谢贝勒医学院的Carol J. Baker博士和威斯康星州卫生实验室的Terrence A. Kurzynski提供了本研究中使用的一些GBS菌株。我们还要感谢Maneesh Dave和Elizabeth Marie Levin在LOS筛检方面的帮助。

补充材料

参考文献

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