分离，鉴定和抗菌生产放线菌的土壤样品中筛选

抽象

放线菌是革兰氏阳性，兼性厌氧类真菌，其保持在天然抗生素生产商前丝状菌。由于尼泊尔的气候和地理多样性，广泛的抗微生物剂与的有效源的微生物是可用的。本研究的目的是分离，鉴定，并从土壤覆盖尼泊尔的不同高度范围筛选潜在抗微生物生产放线菌。放线菌的四十一个分离物从随海拔高度范围从1500至4380米尼泊尔不同位置收集的11个土样中分离。将分离物识别形态的研究，不同的糖利用，蛋白质利用率和水解试验的基础上。他们还进行了表征温度和pH值的基础上。抗菌活性初步筛选进行了对几种试验生物：金黄色葡萄球菌（ATCC 25923），大肠杆菌（ATCC 25922），肺炎克雷伯氏菌(写明ATCC 700603)铜绿假单胞菌(ATCC 27853)采用垂直划线法，采用乙酸乙酯溶剂萃取琼脂孔扩散法进行二次筛选。70.7%的分离株被鉴定为链属，19.5％作为诺卡氏菌和9.5% as小单孢菌属属。放线菌菌株的43.34％被认为是从一次筛选其中46.34％是对革兰氏阳性和12.19％对革兰氏阴性测试生物有效的抗菌生产者。隔离C7（小单孢菌属在二次筛选中显示出最佳的广谱抗菌活性。不同的分离物共产生11种不同类型的色素，其中黄色色素最为突出。海拔、pH值和色素与抗菌素生产之间的关系被发现是不显著的。这一发现对进一步研究获得用于治疗的广谱抗生素具有重要意义。

1.简介

放线菌是一种异质性微生物，在土壤中具有线状的丝[1]。它们被广泛地分布于自然栖息地和在不同的生物和代谢进程所带来，例如，其可用于产生胞外酶[2]。此外，近90%的放线菌属已从土壤中分离出来，对工业和制药等不同领域无害[3]。此外，放线菌在培养基上本能地产生红色、绿色、黄色、棕色和黑色的色素。4]。它已经被假定链包围着抗生素生产的推定生物体是否紧随其后诺卡氏菌和小单孢菌属与之相比，它们在本质上是低等的链在以生产抗生素的能力[五]。

研究人员已经做了隔离许多研究和抗菌生产放线菌的筛选。它propounded，大多数的新型抗生素已发现从土壤中分离的筛选[6]。然而，由于多重耐药性病原菌，耐药性正在增加，这是恶性人口众多社区的健康出现。此外，它已经在感染性疾病的治疗中一个严重的问题，因此，关于这一主题的阐述了需要控制的问题[发现新小说的抗生素帮助7，8]。

正如我们所知，尼泊尔是一个地理上不同的国家，分为三个区域：山地，丘陵地区和Terai地区。基于它们在高度和土壤类型和它们的内容的变化，有观察类似微生物，以改变抗微生物剂的生产放线菌的分布[其中猜想的可能性9]。因此，本研究从尼泊尔1500 masl到4380 masl的不同海拔、不同地点采集的土壤样本中分离并筛选产生抗菌素的放线菌。因此，该项目有助于分析和报告从样本点收集的微生物的抗菌活性分布。

2。材料和方法

2.1。土壤样品采集

来自尼泊尔的不同高度范围（有机耕地，根际区，河岸）十一土壤样品的研究中进行了处理。样品被命名为字母A，B，等他们高度的递增顺序。类似地，从每个相应的样品分离物分别标记为A1，A2，等等。The soil was collected within the depth of 10–12.5 cm. The samples were collected in sterile polythene bags, closely tightened, and were taken to the laboratory.

2.2。放线菌的分离

土壤1克样品中取出并连续稀释到10^-2使用蒸馏水作为稀释剂。将混合物剧烈振摇使用涡旋;0。1 ml of each dilution was placed on starch casein agar (composition: soluble starch: 10 g, K₂HPO₄: 2g, KNO₃: 2克，酪蛋白:0.3克，MgSO₄·7H2O₂O: 0.05克，可可₃: 0.02 g, FeSO₄·7H2O₂O: 0.01 g, agar: 15 g, and filtered sea water: 1000 ml and pH: 7.0 ± 0.1), and the inoculum was spread properly using a sterile glass spreader. The inoculated plates were allowed to stand at room temperature for 5–10 minutes to allow the liquid to be absorbed and were incubated at 28°C for 7 days.

2.3。鉴定

放线菌的鉴定宏观和微观检验和生理测试的基础上完成由伯杰氏系统细菌学手册，建议的那样^ND版，第5卷，放线菌，A部分。

2.4。宏观表征

观察到对于气生菌丝，菌丝淹没，颜色和扩散颜料的分离放线菌。

2.5。显微观察

显微镜检查是由盖玻片和革兰氏染色法进行。无菌盖玻片在45的倾斜插入的固化淀粉酪蛋白琼脂培养基平板°与琼脂表面。放线菌的分离物被沿满足掩埋盖玻片的表面上的介质的表面接种。将其在28℃下温育4天。使用无菌镊子除去盖玻片，并放置在一个单独的干净的载玻片上，然后将其在油浸物镜观察到10]。

2.6。生化试验

对于所有菌株，一个铂环量的约7天孵育的纯培养物的菌落置于淀粉酪蛋白肉汤，并温育于28℃下4天。混浊的外观后，用于不同的糖利用的测试中，蛋白质利用率测试，和​​过氧化氢酶和氧化酶试验的培养物悬浮液。不同水解试验，即，淀粉水解，酪蛋白水解，水解的脂质，和明胶水解试验，进行了。

3.初步筛选

被采用所述垂直条纹方法的Mueller-Hinton琼脂培养基上放线菌的初步筛选。在无菌琼脂培养基，放线菌的纯分离物沿着该板的直径划线。将板在28℃温育7天。测试细菌菌落纯金黄色葡萄球菌（ATCC 25923），大肠杆菌（ATCC 25922），铜绿假单胞菌（ATCC 27853），和肺炎克雷伯氏菌(ATCC 700603)转入新鲜营养液中，37℃孵育24小时，至可见浊度。调整浑浊度为0.5 McFarland，细胞数为1.5×10⁸中，测试生物体垂直于分离条纹。将板在37℃下进一步培养24小时，并且所述抗微生物活性是从抑制试验生物体的区域估计[11]。

4.二次筛选

4.1。粗提物的生产

乙ased on the results of primary screening, each isolate was subjected to submerged fermentation in the ISP2 medium (composition: yeast extract: 4 g, malt extract: 10 g, dextrose: 4 g, agar: 15 g, and filtered sea water: 1000 ml and pH: 7.3) and Kuster’s agar (composition: glycerol: 10 g, casein: 0.3 g, KNO₃: 2g, K₂HPO₄: 2克，可溶性淀粉0.5克，天冬酰胺0.1克，牛磺酸钠0.1克₄·7H2O₂O: 0.01 g, CaCO₃: 0.02 g, MgSO₄·7H2O₂O: 0.05 g, agar: 15 g, and filtered sea water: 1000 ml and pH: 7.0 ± 0.1) in a shaker incubator at 120 rpm for 7 days at 28°C. The extract was separated by centrifugation at 13000 rpm for 10 minutes at 4°C. The supernatant was mixed with equal volume of ethyl acetate and left overnight. Subsequently, the upper layer of ethyl acetate was again separated and evaporated at 40°C. The concentrated solvent was used for assay [12]。

4.2。琼脂扩散法

在无菌软木蛀虫的帮助下，在琼脂板上钻5个直径为6mm的孔。用拭子将试验菌拭到琼脂表面μ把粗抽提物倒进井里。阴性对照和阳性对照分别用乙酸乙酯和抗生素片(奥拉西林、呋喃妥因、环丙沙星)。放置几分钟，37℃恒温24小时。

5.结果

本研究从尼泊尔海拔1500 - 4380米的不同地点采集了11个土壤样品。表中给出了带分离物数的土壤样品的描述1。

然后共有41株被鉴定为链属。（29株），诺卡氏菌属。（8株），和小单孢菌属属。（4株）的显微镜观察和生化试验的基础上，如图1和表2。

大多数菌株不同了色素沉着，如图2。蜂群的颜色从48%的黄色、10%的棕色、13%的灰色和6%的绿棕色，3%的蜂群有蓝色、浅紫色、绿黄色、黑灰色、灰白色、浅粉色和灰黑色到白色。数字3示出了由A5，A6，A7生产颜料，和A8隔离。

然后将鉴定的分离物进行初级筛选如在表3。出的41株纯，19株显示出抗微生物活性通过垂直条纹方法初级筛选期间的测试有机体。总分离物12.19％被认为是对革兰氏阳性和革兰氏阴性测试生物体活性。

19株活性分离株中，有13株在二次筛选中出现了对被试菌的抑制区，见表4。13株菌株均表现出抗真菌活性金黄色葡萄球菌5对肺炎克雷伯氏菌和7对大肠杆菌。7株产生的针对一个以上的测试生物体的抗微生物活性。

6.讨论

本研究的目的是发现尼泊尔不同地理区域的放线菌。从海拔1500 ~ 4380 masl的地方共研究了11个土壤样品。分离鉴定了41株放线菌属链（70.7％），诺卡氏菌（19.5％），和小单孢菌属（9.5％）。

从Jomsom采集的土壤样品中分离到的放线菌数量最多。微生物即使在以前恶劣和具有挑战性的居住环境中也能存活，可能是由于它们对环境的适应能力，以及产生芽孢等抵抗结构的能力[9]。

该菌株生长缓慢，需氧，无毛，具有不同颜色的气生根菌丝和底物。它们中的大多数在淀粉酪蛋白琼脂(SCA)上产生色素，即棕色、黄色、蓝色、蓝绿色和紫色。在一项研究中，在使用的7种不同介质中，AR-ITM02 (链spp。）的显示色素生成上SCA能力只有这可能是由于在媒体[足够的可用量的养分13]。在另一项研究中，从放线菌分离株中提取了绿色、橙色、白色、黄色和棕色5种不同的色素，并对其进行了纯化和抑菌活性测试，结果表明，所提取的色素均能抑制放线菌的生长大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌和伤寒沙门氏菌除了黄色颜料，其显示针对仅革兰氏阴性菌的抑制效果[14]。

在目前的研究中，当总的分离物进行初级筛选，46.34％被认为是针对测试生物活性。所有活动的分离显示出抗菌活性抗金黄色葡萄球菌（ATCC 25923），而只有其中的5表现出活性对大肠杆菌（ATCC 25922）和肺炎克雷伯氏菌（ATCC 700603）。没有表现出对活动铜绿假单胞菌（ATCC 27853）。在一项研究中，其中放线菌117株，在只有12.82％菌株[观察抗菌活性15]。在另一项研究，6出20株均显示活性的抗革兰氏阳性测试生物体和只有4株表现出活性对革兰氏阴性生物体[16]。类似地，出106株，只有36显示出活性针对测试生物体其中2反对仅革兰氏阴性生物活性，8对革兰氏阳性生物体，和26对革兰氏阳性和革兰氏阴性生物体[17]。

据Shirling和戈特利布[18]，对于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌之间的不同灵敏度的原因可能相对于这些微生物之间的形态差异来解释。革兰氏阴性菌具有外多糖膜使细胞壁不能渗透亲脂性的溶质;然而，革兰氏阳性仅具有外肽聚糖层，其不是有效的渗透屏障。

期间，使用乙酸乙酯萃取活性菌株的二次筛选中，只有13株显示出抑制区。在一个研究中，培养液的纯化醋酸乙酯提取物S. sannanensisSU118使一种对革兰氏阳性菌有活性的强效抗菌剂得到恢复[19]。在另一项研究中，乙酸乙酯:甲醇提取物被发现比水溶剂提取物更有效的抗菌活性。这可能是由于有机溶剂中活性化合物的溶解度比水溶液中高，也可能是由于溶剂萃取混合物中代谢物的浓度增加[20.]。

活性分离初级和次级筛选期间表现出不同的活性。据布舍尔等。[21]，次级代谢产物的筛选期间，放线菌分离物显示出的琼脂上的抗菌活性而不是在液体培养中经常遇到。这可能是由于在培养基的底物组合物，接种量，或者在初级筛选和深层发酵培养时间的差异。它也可以是可能的放线菌释放的活性化合物变为不活动或化学改性的或结合培养液的成分。此外，许多放线菌是穷人发酵[9，22]。

不同的环境约束和生长条件影响生长和放线菌的多样性，它们的温度为一个。它在生理，形态，产孢，生物化学深远的影响，同时还抗菌代谢产物的生物。在研究中，对放线菌的生长的最佳温度被发现是在嗜温范围内。

在这项研究中，78.04％，73.17％，80.48％，和产生明胶酶，酪，淀粉酶，脂肪酶和分别菌株的41.46％。菌株的78.04％，都不能显示一个以上的酶活性。在由Jeffrey [进行了类似的研究23，大约98.4%的总分离物产生一种或多种酶活性。放线菌分泌广谱酶的潜力可能是为了在竞争环境中生存而进行的自然选择所致[24]。

7.结论

来自尼泊尔的不同土壤样品具有抗菌活性放线菌的菌株不同的菌株已尝试。从11个土壤样品分离并鉴定为四十一分离链属。（70.7％），小单孢菌属属。（19.5％），和诺卡氏菌spp。(9.5%)。分离株C7在二次筛选中表现出最佳的广谱抗菌活性。7个分离株具有广谱抗菌活性。目前，有必要发现新的抗菌素生产菌株，因为现有的药物已经失败，因为微生物之间的耐药性发展。本研究也为这一需求做出了微薄的贡献。对试验微生物表现出广谱活性的分离物可作为寻找潜在抗菌化合物的候选菌株。

数据可用性

如有需要，可提供与本研究有关的进一步数据。

利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

作者的贡献

AS和AT设计了这个项目。AS, AT, AB, MS, PS进行实验，参与数据分析，撰写手稿。SA帮助设计研究，在实验室调查期间管理必要的安排，并监督整个研究。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

致谢

作者想对尼泊尔加德满都迈蒂格尔的圣泽维尔学院微生物系表示感谢，感谢他们提供了实验室设施。

参考

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