文摘
人为活动可能使壁画泻湖微生物污染。本研究的目的是确定的污染水平壁画泻湖与粪便污染有关。二百七十(270)样本包括216水和54人从当地居民收集粪便样本。大肠杆菌是根据古典细菌学分离和确定过程。菌株以生物型在API 20 e画廊和系统发育类型PCR三缸的克莱蒙特。一组392株大肠杆菌被分成18 biotypic概要文件。五个生物型水和人类是很常见的。所有生物型分类显示水与人类之间的密切关系紧张,因为他们的重新分配在同一组。系统组,B1、B2和D被确定在所有菌株。菌株属于系统组的最频繁的水(69.82%)和人类粪便(44.44%),其次是集团在水(24%)和人类粪便B1 (40.7%)。菌株B2组稀少在水中(4.4%)和人(7.41%)。的多样性大肠杆菌生物型在这项研究揭示了动物和人类污染的起源。水和人类之间的关系被发现菌株,共生体的存在和extraintestinal致病性大肠杆菌在所有样品可以代表一个潜在的储层的居民人口extraintestinal感染。
1。介绍
大肠杆菌是下呼吸道肠道的正常居住的温血动物和人类。然而,在过去的二十年里,它也被用来作为指示生物源跟踪的目的(1];这种生物的分布历来用作水质指数(2]。壁画泻湖,像许多非洲沿海泻湖是一致的,有时严重的压力来自不同形式的人类活动来自周围的城市和村庄。乱倾倒未经处理的废弃物到水生环境可能带来的物理,化学和生物恶化的水。这无疑会危及居民水生生物以及损害有益使用的水。然而,缺乏信息存在于生物污染程度的壁画泻湖和公共卫生意义。粪便细菌污染的水和食物,依然存在,一个共同的和持续的问题,影响公众健康和当地和国家经济3]。大肠杆菌遗传型的表型多样性。这个角色,需要生物型细菌分离株的重要性,自1970年代以来在各种出版物(4- - - - - -6]。表型特征碳利用模式、糖用抗生素耐药性资料、鞭毛能动性等表型特征。系统发育研究表明,有四个主要系统组大肠杆菌指定一个,B1、B2和D (7,8]。最近的研究显示,2013年有8个公认phylogroups大肠杆菌(A、B1、B2、C, D, E, F,和埃希氏杆菌属进化枝我)92008 - 2009年),但本研究发现,专注于四个主要phylogroups。Extraintestinal致病性菌株属于B2组和D (10),而共生的菌株组A和B1 (11]。致病菌株与几个相关疾病,包括腹泻,尿路感染,脑膜炎(12]。在最近的一项研究中,大肠杆菌属于系统发生学组,B1, B2隔绝鱼类在壁画泻湖13]。的存在大肠杆菌代表了一种疾病的风险是否发现致病菌株。本工作的目的是研究之间的关系大肠杆菌菌株,分离水的壁画泻湖和居民凳子,到生物型和系统组织和评估可能的污染源和潜在的致病菌株的存在壁画泻湖。
2。材料和方法
2.1。水和人类的粪便取样
总共216地表水样品被纳入本研究。所有样本收集的壁画泻湖,抽样网站故意选择从壁画城市及其周边地区的直接影响污水和两个河流Niouniourou和大刀。抽样地点如图1。水样(250毫升)是在每个站点上收集的,20厘米以下的表面使用无菌玻璃瓶泻湖,存储在冰,运到实验室。所有样本收集从2008年1月至2009年6月月度。为人类的凳子上,54个样本来自当地居民壁画的综合医院。大肠杆菌在2009年6月被确认使用标准coproculture方法。培养皿中包含大肠杆菌被保存在兜包袋冰和运送到微生物实验室分析前的海洋学研究中心24小时。
2.2。大肠杆菌分离、鉴定和生物型
根据膜过滤技术来量化粪便大肠杆菌(14),100毫升的水过滤和直接放置于伊红美蓝琼脂培养基(默克公司、法国)。为人类的粪便,大肠杆菌菌株接种到伊红美蓝琼脂培养基。盘子在37°C孵化24 h。孵化后,假定大肠杆菌(紫色与金属光泽)。菌株被选择和接种到营养琼脂(Bio-Rad)在孵化前37°C 24 h获得纯文化进行进一步分析。纯文化在革兰氏染色检测细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的生产。
生物型,使用的方法是建立一个基于生化的菌株性状突出一个API 20 e画廊(6,15]。画廊(Biomerieux SA、法国)是用于控制诊断识别的物种一方面和测试结果的分析,考虑到变体或非常数的生化角色,担任一个歧视因素应变之间的生物型的决心。
股票文化储存在脑心浸液肉汤(BHI)(美国密歇根州Difco) 20%甘油−80°C到使用。
2.3。DNA提取
大肠杆菌隔离是生长在Luria-Bertani一夜之间(磅)汤在37°C。细菌从1.5毫升的生长介质颗粒状的离心10分钟的1200克。细菌颗粒悬浮在200年μl无菌的超纯水,煮10分钟水浴(100°C)。再次溶解产物是离心机,上层清液直接作为PCR模板使用。
2.4。系统组的决心
每个应变隔离的系统集团是由三层聚合酶链反应(7]。反应混合物的25μ2.5 l,μl 10 x缓冲(Q生物,法国),0.25毫升每20 pmol引物浓度(欧陆坊、德国),4μl 2μ核苷酸(MP,法国),0.25μl聚合酶的浓度为2.5 U(生物学实验室、法国),1.5μl (MgCl 25毫米2(MP、法国),5μl的DNA提取涨跌互现。混合物是由最后一个反应体积25μl与水。放大是实现thermocycler Biometra Uno II, 1998年生物气候室,(德国)根据以下程序:一个初始变性步骤5分钟在94°C,紧随其后的是30个循环组成的变性在94°C 30年代,杂交在55°C 30年代,30年代在72°C和扩展。这些周期后,最终在72°C扩展7分钟是意识到。放大产品由琼脂糖凝胶电泳分离。在100 V 0.5 x此种执行迁移了40分钟。迁移后,DNA乐队被荧光可视化在360 nm紫外线下,使用一个Uvitec相机拍照(联合王国)。然后,系统组决定使用二分树在克莱et al。7]。
2.5。统计分析
使用SPSS 20.0软件进行统计分析。分层分类分析被用来组织生物型基于类似生化角色使用这个软件。结果由系统树图表示。采用欧氏距离分析,病房方法作为聚合的标准。
3所示。结果
3.1。丰富的大肠杆菌在人类粪便水和隔离率
大肠杆菌被发现在所有水样(216),在所有网站,和54人类粪便进行了分析。均值(从2008年1月至2009年6月)大肠杆菌数目变化从6.29到39.62 CFU(集落形成单位)分析(图100毫升的水2)。既定的人类粪便,54株大肠杆菌为每个样本(一)孤立进行进一步分析。
3.2。生物型的大肠杆菌在水和人类的粪便
十八岁的生物型大肠杆菌观察在水中和人类菌株(分别为338和54)(表吗1)。比较不同生物型获得生物型1 (B1),据Biomerieux对应参考应变大肠杆菌写明ATCC 25922。差异是基于生化药剂的存在或缺乏特点,如抗利尿激素(精氨酸dihydrolase) LDC(赖氨酸脱羧酶),ODC(鸟氨酸脱羧酶),伊诺(肌醇)、水(山梨糖醇),RHA(鼠李糖),囊(蔗糖)和梅尔(蜜二糖)。确定了十二个生物型在人类粪便水压力和11。五个生物型常见的水和人类粪便(B1, B2, B3, B6和B8)。生物型1和6经常遇到的频率分别为20.11%和61.24%的水和22.22%和29.62%在人类粪便样本。生物型15、16、17、18日和19日在本研究具体的人类粪便。生物型4、5、7、9、10、11和14只孤立在水中(表在0.6%到2.36%2)。生物型B12并不确定在水和人类粪便样本,但只在鱼菌株(发表在以前的研究)。原因与前面的文章连贯性,没有改变了生物型的编号。
3.3。水人类和生物型之间的关系
聚类分析来确定水人类和生物型之间的关系用生化测试的结果。距离的病房,所有18个生物型分为4组(图3)。组I, II, III和IV,水有人类和生物型。没有特定群体对人类或水。有一个所有生物型鉴定研究之间的关系。
3.4。系统组菌株分离水和人类的粪便
二分决策树用于确定系统组大肠杆菌应变显示组的存在,B1, B2,和D在水中和人类的菌株。338株的大肠杆菌隔离在水从壁画泻湖,菌株A组的最常见(69.82%),其次是菌株B1组(23.67%)。菌株B2组和D的罕见(分别为4.44%和2.07%)。54株从人类粪便中恢复过来,系统组A、B1、B2和D被发现。菌株主要是孤立被从组和B1为44.44%和40.74%,分别。B2组和D总计只有7.41%的菌株(图分析4)。
4所示。讨论
大肠杆菌是世界各国所采用,粪便指标物种评估水质在水生环境中(16,17]。的存在大肠杆菌在所有网站整个泻湖是排泄物污染的证据。事实上,当地居民的不卫生的习惯在泻湖引起污染。网站ST6(原壁画),相约(船区)和ST2(农场后面),标志着人类和动物的存在,是杰出的高负载大肠杆菌。八种不同生物型在水的识别和人类粪便分析揭示了存在和伟大的多样性大肠杆菌在泻湖环境。生物型1根据BioMerieux对应参考大肠杆菌写明ATCC 25922。生物型6频率最高的隔离在水和人类菌株(分别为61.24%和29.62%)也有类似的资料与应变孤立在北卡罗莱纳,这是负责肠炎和土耳其死亡综合症(18]。此外,在这个生物型,生产colicine已被证明,与鸟类的毒性有关大肠杆菌(19]。生物型1,2,6对应于那些在尿孤立大肠杆菌感染的病人(20.]。根据Swansson和柯林斯(21),同样的生物型(1、2和6),在这项研究中,最常兽医菌株之间的隔离。生物型3、5、9隔离在水从兽医和人类粪便也被孤立的菌株(21]。生物型7只孤立在水中也被确认根据Nijsten et al。22在粪便的育种家猪和根据Loukiadis [23在法国]从屠宰场废水预处理。生物型4、7和11个孤立的只在水-山梨糖醇,用于筛选的生化特征大肠杆菌O157: H7(肠出血性大肠杆菌),负责的几个病理,包括出血性结肠炎、溶血性、尿毒症综合征(24]。这些生物型是特定于采样站点。生物型4是特定于站点,河流大刀和Niouniourou加入并流到泻湖。生物型7和11是特定于站点6,这对应于古老的壁画,渔民和他们的家人住的地方。他们有猪、禽和羊。在这个网站,没有卫生系统和高水平的大肠杆菌(39.62 CFU / 100毫升)检测。生物型4、10、11和14隔离在水和生物型8隔离在水和人类粪便也被确认在屠宰场废水预处理和污泥收集在法国23]。生物型8被隔离在网站2水,哪里有渔网和渔民和一些房屋不远有家禽农场和绵羊。这些不同的表型观察结果主要从大量不同的基因组合25)和可能的事实的动物或人类的起源被释放到环境中没有治疗和居民人口使用泻湖作为废物容器(凳子和废水)。此外,猪和鸡农场附近水的存在也可以解释微生物污染水平。事实上,浪费或粪便来自这些农场直接倾倒到泻湖环境中没有治疗或排水由浸在雨季径流水造成的。此外,一些村庄泻湖周围没有卫生系统。分层分类所有生物型的分析表明水和人类菌株之间的紧密联系。不可能区分人类和动物来源的菌株(25]。人类和动物菌株导致同一疾病在不同主机共享一个公共的毒性基因(25]。
因为污染大肠杆菌代表了一种对人类健康的风险,收集更多的信息大肠杆菌隔绝水和人类粪便样本,将它们分配给系统组,B1, B2,和D使用PCR技术被克莱蒙特et al。7)是必要的。正如预期的那样,发现四个系统组在压力水和人类的粪便。菌株属于团体和B1主要是分布在水(75%)和人类粪便(85%)。Duriez et al。26)发现,168年nonepidemiological-related隔离从三个地理上不同的人群,菌株的系统发育组和B1是最常见;菌株B2组还很少。大肠杆菌压力通常称为共生的、肠道或extraintestinal致病性(27]。Extraintestinal致病性菌株属于B2组和D (7,10,25),而共生的菌株组A和B1 (11,25]。我们的研究表明,同桌的菌株是最丰富的壁画湖的水。菌株B2组和D不代表水和人类粪便样本。这些结果一致与行走等。28]。皮卡德et al。29日]发现B2菌株仅占9%的检查了同桌的人类的菌株。大肠杆菌从组B2高致病性菌株,经常负责extraintestinal感染(26,30.,31日和尿路感染的人类32]。Extraintestinal致病性大肠杆菌可以在D组(30.),根据克莱蒙特et al。7),大肠杆菌O157: H7可能属于这一组。B2组和D在水中的存在可能意味着壁画泻湖可以为居民提供extraintestinal致病性大肠杆菌的风险谁使用这个娱乐活动。
5。结论
的多样性大肠杆菌生物型在这项研究揭示了动物和人类污染的起源。水和人类之间的关系被发现菌株。共生体和extraintestinal致病性大肠杆菌在所有样品可以代表一个潜在的储层的居民人口extraintestinal感染。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。