文摘
相比广泛探索从丁香花蕾提取物抗氧化活性,减少数据有关的潜在药物使用丁香叶。我们的研究旨在探索丁香叶提取物的抗氧化活性在细胞水平。因此,我们使用了酵母粟酒裂殖酵母作为生物模型。我们的数据表明,随着提取治疗(100 ppm),固定相的细胞的可行性美国非洲酒高于没有提取和卡路里限制的治疗。100 ppm提取物治疗也可导致细胞生存能力对H2O2全身的氧化应激。这些数据表明,提取能促进酵母细胞的耐氧化应激反应,发生在固定相或由于外生风险。提取高剂量(500 ppm)显示相反的作用,是细胞生存能力低于没有治疗。向线粒体活性分析表明,提取不诱导线粒体活动与热量限制治疗。根据我们的数据,丁香叶提取物促进酵母耐氧化应激反应美国非洲酒,独立线粒体自适应ROS信号常发生在卡路里restriction-induced宽容氧化应激反应。
1。介绍
活性氧被承认为氧化应激的主要原因(1]。虽然细胞能够对抗活性氧的积累通过氧化应激反应,通常不足,从而导致严重的氧化应激(2]。这样严重的氧化压力状况归因于的流行各种细胞紊乱和疾病的发病机理。例如,氧化应激是由于基因突变(3),积累的有毒淀粉样身体(4],细胞器功能障碍[5),和细胞老化6]。这类事件可能会达到高潮的发展疾病包括退化性疾病和代谢疾病如糖尿病、帕金森癌症和阿尔茨海默病(4,7,8]。
抗氧化剂在对抗氧化应激中起着重要的作用。植物的黄酮类化合物的抗氧化性能被广泛研究的策略来引导和加强细胞氧化应激反应系统。在印尼本地植物,丁香(气味清香植物)是获得严重的关注由于其潜在的医药用途。这种植物是最富有的来源之一丁香酚等酚类化合物,丹宁酸和没食子酸,制药和化妆品使用潜力(9]。生物活性化合物从丁香花蕾已经广泛研究关于其抗氧化活性。例如,乙醇和水的丁香花蕾提取物可以抑制超氧化物自由基和2 95%活动,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) [10]。进一步的体内研究表明丁香酚在保护中起着重要作用雄性老鼠暴露在aflatoxins-induced hepato,肾毒性,氧化应激(11]。此外,从丁香花蕾中提取适用食品抗氧化剂,如申请大豆油(12和香肠13]。
研究丁香提取物的生物活性不如在味蕾可用。丁香叶被用作丁香精油的来源。Jirovetz et al。14)报道,丁香叶精油包括超过20个化合物与丁香酚(76.8%),紧随其后β石竹烯(17.4%)、α蛇麻烯(2.1%)、乙酸和eugenyl(1.2%)为主要组件。另一方面,丁香花蕾精油主要包括丁香酚(72%),但更高浓度的醋酸eugenyl较小(8%)β石竹烯(2.8%)比bud-derived精油(15]。丁香叶中提取已报道有一个基于DPPH自由基清除活性测定(14]。到目前为止,关于丁香叶提取物的抗氧化活性细胞水平尚未报道。最近的一项研究Munisa et al。16]表明,甲醇提取丁香叶可以稳定的酶,氧化应激反应的必要条件,即Cu-SOD Zn-SOD,以及减少丙二醛在高胆固醇血症兔肝脏。进一步了解丁香叶提取物在体内的作用方式,我们使用了裂殖酵母粟酒裂殖酵母作为生物模型。在这项研究中,我们旨在分析丁香叶乙醇提取物的影响在手机系统上,尤其是对细胞反应与氧化应激。
2。方法
2.1。丁香、压力和介质
丁香叶(气味清香植物var桑给巴尔)从印尼获得香料和药用作物研究所(ISMCRI)。的裂殖酵母美国非洲酒039(弧h−leu1-32 ura4 - 294)是用作生物模型。美国非洲酒总是保持着与补充酵母提取物(YES)媒介。是的(1升)组成如下:5克酵母提取物,20克葡萄糖,0.128 g组氨酸,0.128亮氨酸,0.128腺嘌呤,0.010 g尿嘧啶,和0.128精氨酸。
2.2。提取丁香
提取是基于先前所描述的方法进行Cortes-Rojas et al。9]。丁香叶使用70%的乙醇浸渍的比率1:5(示例:溶剂)。样品浸泡24小时,搅拌每12小时。浸渍物质的收获后,这个过程重复两次用同样体积的溶剂。物质被收集和集中使用旋转蒸发器(45°C)在一个小时之内。粘贴的乙醇提取获得了深棕色的颜色。
2.3。定量的类黄酮
类黄酮含量测定通过氯化铝比色测定。槲皮素作为参考。在测量之前,乙酸乙酯部分粗提物制备通过使用一系列的溶剂。总之,粗提物(∼200毫克simplisia)悬浮在hexamethylenetetramine 1毫升的0.5%,20毫升丙酮、盐酸和2毫升。解决方案被水解为30分钟,然后过滤。添加20毫升的残留物被蒸馏丙酮30分钟。滤液悬浮在100毫升丙酮。大约20毫升被停职的消息然后用15毫升乙酸乙酯萃取三次解决方案得到乙酸乙酯分数。间变性大细胞淋巴瘤引起1毫升的10%3添加到乙酸乙酯分数。冰醋酸随后被添加到解决方案调整最后一卷25毫升。混合物被允许站30分钟,在510 nm和吸光度测定。总类黄酮含量是表示为毫克E槲皮素/ g提取。
2.4。固定相细胞的细胞生存能力分析
细胞生存能力测试是通过进行现场试验。酵母的文化是由接种酵母殖民地是的液体介质循环之一。文化是培养24小时在室温和瓶作为亚文化。浊度的亚文化然后在600海里通过使用分光光度计测量。亚文化又转移到另一个是的液体介质在最后OD600年= 0.1准备主要文化。丁香叶提取物添加到主要包括文化在不同浓度100 ppm, 200 ppm, 500 ppm。负控制治疗是由添加萃取剂(DMSO)但没有提取,代替。积极的控制是由培养酵母细胞是的中葡萄糖浓度较低(0.5%葡萄糖)开发热量控制(CR)条件。CR作为积极的控制治疗这种情况以来报道增加酵母寿命时间诱导氧化应激反应(17),自噬18,19),和线粒体生物起源20.]。同样也认为,哺乳动物细胞调节机制在CR条件延长细胞的寿命,防止退化性疾病(21,22]。
主要的文化是在室温下为九天孵化瓶。每三天,现场测定的文化是收获。OD600年每个文化的被使用分光光度计测量。具体体积每个主要的文化,然后调整转移到最终的OD600年在无菌水= 1 200年第四卷μl。细胞悬液连续稀释到104稀释。大约3μl每个稀释当时发现最重要的是的琼脂和进一步孵化30°C三天。
2.5。细胞生存能力分析对氧化应激
分析,主要的文化准备如上所述固定相细胞的细胞生存能力分析。是的,包含H琼脂2O2(1、2和3毫米)是用于现场试验,来代替。
2.6。线粒体分析
程序完成后(17]。主要的文化是准备在前面所述的化验。主要文化的隔夜孵化后,颗粒细胞收获通过使用0.05磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)。然后细胞颗粒悬浮在1毫升的同一个缓冲区和添加10μl (100 nM罗丹明b细胞混合物被允许站30分钟25°C。曝光是避免在整个实验过程。荧光显微镜下观察线粒体活动(奥林巴斯BX51)。
3所示。结果与讨论
3.1。类黄酮含量
乙醇的产量丁香提取物的丁香叶500克64.6克(12.9%)。基于槲皮素标准曲线,丁香叶中的黄酮含量为99.6 mg·QE / 100 g提取。与其他香料相比,乙醇丁香叶中提取含有类黄酮浓度高。例如,通过使用80%的乙醇,火炬姜和柠檬草的类黄酮含量39.7毫克·QE / 100 g提取和14.8 mg·QE / 100 g提取,分别比丁香叶中提取低得多。然而,丁香叶中提取的黄酮含量低于咖喱叶(144.5 mg·QE / 100 g)通过使用相同的溶剂(23]。我们的数据表明,丁香叶和芽的类黄酮含量没有明显不同(未发表的数据)。
3.2。固定相细胞的细胞生存能力分析
在这个试验中,我们试图评估丁香叶中提取的效果在酵母细胞的细胞生存能力固定相的细胞。治疗100毫米丁香叶提取物促进酵母细胞的生存能力,这是清楚地看到在老化的文化(9天的孵化),相比,没有提取和其他丁香叶提取物治疗(图1)。有趣的是,特定的治疗导致更高的细胞生存能力相比,热量限制治疗(图1)。
固定相的细胞经常用来测定酵母的寿命时间他们模仿最花条件postmitotic高等生物组织(24]。在固定相,酵母线粒体呼吸获得能量(主要使用25),因此会导致细胞内活性氧的积累。因此,固定相的酵母细胞更宽容对氧化应激与对数期细胞相比,由于前阶段可以开发自适应线粒体ROS信号(26]。这类自适应线粒体ROS信号也参与了氧化应激耐受性机制CR-cells [27]。丁香叶中提取的令人惊讶的是年龄在酵母细胞的细胞生存能力增加,CR-cells更高。这些数据表明,丁香叶提取物可能是调节氧化应激反应的能力,比CR更有效的条件。一项研究报道说,除了自噬和线粒体活动,动态肌动蛋白细胞骨架参与固定相的生存,从而延长寿命的酵母酿酒酵母(28]。据我们所知,这是第一次报告的使用丁香叶中提取酵母细胞促进细胞的生存能力,这表明其潜力作为抗老化剂。
3.3。细胞生存能力分析对H2O2全身的氧化应激
进一步了解丁香叶中提取的影响氧化应激反应,我们检测细胞生存能力对H2O2全身的氧化应激条件。符合之前的结果,100 ppm的丁香叶提取物治疗增强细胞衰老的生存文化对中度(图(9天)2(一个))和严重氧化应激曝光(数据2 (b)和2 (c))。值得注意的是,治疗更高浓度的丁香叶中提取(200和500 ppm)显示相反的表现型(图100 ppm和控制治疗2 (b)和2 (c))。这些数据表明,丁香叶中提取的作用在促进酵母氧化应激反应不太可能以剂量依赖的方式发生。
(一)
(b)
(c)
温和的氧化应激后暴露(1毫米H2O2),早期固定相细胞(3天的年龄)被氧化应激影响曝光(图2(一个))。然而,在严重的氧化应激治疗(2和3毫米H2O2),三天的年龄细胞已经显示生长缺陷,尤其是负控制和高提取治疗(数字2 (b)和2 (c))。岁的细胞(9天的年龄),氧化应激导致细胞生存能力(数据缺陷2(一个)- - - - - -2 (c)),但只有100 ppm提取物治疗导致氧化应激耐受性表型(数字2(一个)- - - - - -2 (c))。
我们的数据表明,丁香叶提取物能促进酵母细胞的氧化应激耐受性。其他提取物能够诱导氧化应激的耐受性响应在酵母绿茶提取物(29日)、红菊苣叶(30.),金果榄等(31日],洛神葵花瓣[32]。
酵母氧化反应机制是复杂的。已报告各种转录因子调节氧化反应。例如,在酵母美国非洲酒转录因子Pap1和Sty1负责上调基因涉及氧化应激反应对低和高H2O2水平,分别为(33]。在基因Pap1和Sty1的监管下trx1 ctt1、sod1 srx1酶等(34,35]。绿茶提取物的分子机制调节氧化应激反应酿酒酵母通过转录Yap1 [upregulation的发生29日),Pap1同族体美国非洲酒。另一方面,直接ROS清除活动phyotextract所示金果榄等(31日]。在热量restriction-induced氧化反应,激活线粒体促进适应性ROS信号,从而增加压力宽容。我们进一步分析丁香叶中提取的影响线粒体的活动。
3.4。线粒体分析
线粒体活动化验用罗丹明b强或鲜红的颜色强度代表活跃的线粒体。丁香叶中提取的治疗不会增加线粒体活动(图3)。热量限制治疗显著诱导线粒体活动,其他地方报道(20.,36]。有趣的是,线粒体活动丁香叶中提取的影响。我们的数据表明,丁香叶extract-induced氧化应激耐受性不太可能通过线粒体自适应ROS信号发生,发生在卡路里限制条件。
丁香叶提取物的抗氧化活性可能通过直接ROS清除活动发生。更好地理解丁香叶中提取的作用方式,我们试图测量在酵母细胞内ROS水平酿酒酵母氧化应激后曝光。
3.5。细胞内ROS水平
治疗丁香叶中提取降低细胞内ROS水平酵母氧化应激条件下,相比那些CR条件。负控制治疗,细胞内ROS水平没有明显不同于那些extract-treated细胞(图4)。这些数据支持这一事实100 ppm的丁香叶中提取并不是助氧化剂的行为模式。此外,很可能加入丁香叶中提取有效诱导活性氧清除活动,通过直接或间接的机制。
植物的天然抗氧化剂分子,如类黄酮,已报告作为自由基食腐动物,减少代理商,助氧化剂金属复合物,饮料对单线态氧,因此常被用作补充膳食摄入量处理氧化应激疾病(37]。例如,类黄酮物质在印度methanolic提取物的药用植物,石莲子冠林恩。(syn。c . bonducella[l]。Roxb。)(家庭豆科)通过ROS清除和iron-chelating活动施加直接影响体外和体内38]。另一方面,研究乙醇提取的有翅亚纲alata显示了其潜在的间接通过诱导抗氧化活性的胞内酶抗氧化压力,超氧化物歧化酶,liver-damaged老鼠(39]。进一步研究揭示行为的模式从丁香叶中提取黄酮类物质需要澄清的效果特别提取在细胞和分子水平。
4所示。结论
丁香叶提取物治疗可以促进氧化应激耐受性表型的酵母美国非洲酒产生剂量依赖性的方式。最佳丁香叶中提取(100 ppm)显示在固定相细胞生存的影响在氧化应激条件下比热量控制条件。丁香叶中提取线粒体活动不受影响,这表明酵母公差对氧化应激是线粒体自适应ROS信号独立的,但通过直接ROS清除活动。
数据可用性
使用的数据来支持本研究中提供这篇文章。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
感谢作者的研究、技术和印度尼西亚共和国高等教育的资金通过方案Penelitian Dasar Unggulan Perguruan丁宜受困,RIA (1778 / IT3 11 / PN / 2018)。