果聚糖合成功能性成分的结构特征芽孢杆菌siamensis在泰国孤立从传统发酵食品

文摘

不断增长的全球人口继续威胁世界粮食安全。发现新技术生产食品的营养和功能性质是迫切需要的。一个有益的食品对人类已知的营养价值是生命起源以前的果聚糖。为了解决这一问题,目前的工作是针对孤立levansucrase酶微生物在泰国从传统的发酵食品。观察菌落形态为mucoidal一致性文化板块。孤立的殖民地被革兰氏染色形态学特征的方法。二硝基水杨酸(DNS)和薄层色谱法(TLC)报道微生物酶活性最高的8.51国际单位/毫升在12小时通过水解和frutotransferase活动。结构表征通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)和果聚糖¹H和¹³C核磁共振(NMR)谱β- (2,6)-fructofuranose联系。最高的酶活性被细菌b - 6确认为展出芽孢杆菌siamensis11274.1基于16 s rDNA NR基因序列分析。因此,传统食物被证实的孤立的细菌产生levansucrase酶高工业重要的果聚糖的合成作为功能性食品。

1。介绍

胞(系统)已经广泛应用于食品工业和乳制品功能性成分由于其多功能属性如稠化(1],稳定[2),乳化3),胶凝4),和水合代理(5]。系统也被发现展览各种健康的好处,例如,在降低胆固醇水平(6),抑制致病菌的生物膜的形成7],作为促进益生元的发展在人类胃肠道微生物群(8]。

食用益生元是一种选择性发酵成分,刺激特定成分的变化和肠道微生物群的活动和许多有利影响主机(而闻名9]。益生元的消费报道来改善健康的肠道菌群代谢产品等双歧杆菌和乳酸杆菌物种(10,11]。这些微生物群消费系统合成几个产品,如短链脂肪酸(12)、乳酸和肽(13]。代谢产品被发现拥有各种有益的肠道环境,如在维持正常的细胞腔的pH值在结肠,乳酸的增长刺激人体胃肠道微生物区系,和生产对病原体的抗菌素14,15][16]。确实清楚的是,益生元的消费是有利于人类的健康,特别是在实现胃肠内稳态。然而,已知的不良反应由于过度消费有记录的益生元,导致肠胃气胀,腹部疾病、腹泻等,因为这些产品上调土著肠道微生物群的生长和新陈代谢17]。因此,研究了几个低聚糖和多糖营养对他们生命起源以前的潜力(18]。益生元的推荐摄入量带来健康方面的好处应遵循如菊粉(8-40克/天,15 - 64天)或fructooligosaccharides (FOSs)(4 - 12.5克/天,8 - 12天)(15,19];两者都是多糖存在于水果和蔬菜。

Fructooligosaccharides (FOSs)、果聚糖、β-(2 - 1)菊粉类型和β-(2 - 6)果聚糖类型是益生元,已报告的类型是有价值的在维护肠道健康20.]。例如,菊粉和果聚糖与果聚糖的生命起源以前的性质,在一些研究中表明,果聚糖显著增加动物的肠道微生物群的总数(21][22,23]。此外,大量研究报道其他果聚糖的性质包括抗癌活性(24,25],anti-irritant [26)、抗氧化和抗炎作用[27];和促进凝血28]。此外,果聚糖作为增强纳米粒子获得了突出的肽和其他蛋白质药物(29日,30.]。

果聚糖结构包括D-fructofuranosyl残留了β-(2 - 6)主链有联系β-(2 - 1)与支链(31日]。聚合度(DP)估计超过100000 DP (21]。这种多糖合成通常是通过levansucrase酶(EC 2.4.1.10), sucrose-6-fructosyltransferase或fructosyltransferase属于糖苷水解酶家族68年(GH68)所产生的一些的菌株(32,33]。levansucrases机制作用于催化蔗糖fructosyltransferase反应和水解形成果聚糖(34,35]。levansucrases由2子的活性部位是1消退为果糖残渣高亲和力的绑定和+ 1消退,这是能够容纳葡萄糖和果糖残留。首先,蔗糖占1消退共价fructosyl酶,葡萄糖和蔗糖水解,释放。下一步是为另一个蔗糖果糖残渣,吸引在+ 1子站绑定fructosyl fructosyltransferase反应酶的合成β-(2,6)联系oligofructans,导致的形成和伸长果聚糖(20.]。Levansucrase已知合成了几种微生物,包括肠道微生物群,例如,乳酸菌johnsonii,加氏乳杆菌,枯草芽孢杆菌(36),气杆菌levanicum,唾液链球菌(28,33]。然而,试图确定有限的生产levansucrase酶细菌的传统食物,如在发酵的大豆37]。

因此,本研究报告的筛选分离从传统发酵食品微生物在泰国levansucrase酶生产和破坏了他们潜在的果聚糖的合成作为功能性食品。

2。材料和方法

2.1。Levansucrase酶细菌的分离和鉴定

本地的样本豆酱(Thua-nao)是来自泰国东北部地区(Wiang Haeng区,在清迈省,50350年,泰国)和处理levansucrase酶细菌的隔离。细菌的培养和隔离进行系列稀释后和板的方法。悬浮液是镀上包含200.0 g / l的选择性培养基蔗糖,5.0 g / l酵母提取物,10.0 g / l胰蛋白胨,2.5 g / l K₂HPO₄和15.0 g / l琼脂,孵化24小时37°C。混合文化板块观察殖民地表现出mucoidal一致性和亚文化在新鲜营养琼脂(NA)板块。革兰氏染色法(38)进行的分离形态和获得数据支持细菌属的物种的识别水平。

最高levansucrase酶分离被确认进一步的分子技术,通过分析部分16 s rDNA基因序列。基因组DNA提取新鲜细胞生长在NA板(24小时39]。16 s rDNA基因序列被放大用通用引物PCR 27 f (5 - - - - - -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 )和1492 r (5TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ),随后DNeasy组织纯化的工具包(试剂盒、德国),排序,进一步分析(40]。PCR条件如下:94°C 3分钟,30个周期94°C的60年代,60年代55°C, 72°C 2分钟和最后一个扩展在72°C 3分钟。流程包括直接测序序列16 s rDNA进行生物多样性研究中心(BRC),泰国科技研究所(TISTR)(补充图所示1)。部分16 s rDNA序列在爆炸中进入网页的国家生物技术信息中心(NCBI)。多重序列比对进行CLUSTAL X(1.83版)(41]。对齐间隙和身份不明的基地被编辑和消除。neighbor-joining树是由引导分析设置为10000复制和使用木村两个参数计算方法(42与大型版本10软件。

2.2。Levansucrase活动分析

2.2.1。从隔离Levansucrase酶的生产

一个铂环量的殖民地24小时刚从每个隔离种植文化被接种到3毫升的浓汤中含有蔗糖的50.0 g / l,胰蛋白胨10 g / l,氯化钠5.0 g / l,和酵母提取物5.0 g / l, pH值7.4,在试管和培育37°C 24小时在200 rpm(旋转瓶组43]。孵化后,浊度的文化观察肉汤,每个被添加一个标准化的无菌新鲜肉汤培养基与吸光度的0.5麦克法兰相当于0.08到0.1在600 nm spectrophotometrically [43]。管是在同一条件下孵化先前描述。样本收集孵化后,离心机在9100×g(15分钟,25°C),得到上层清液。上层清液保存,留作评估transfructosylating活动。还原糖的测定DNS方法(44]。

2.2.2。酶机制

细菌分离培养是在一个包含100毫升250毫升玻璃瓶进行发酵培养基(含蔗糖200.0 g / l, Na₂HPO₄3.5 g / l,不₂阿宝₄0.8 g / l, MgSO₄0.2 g / l, NaNO₃3.5 g / l,酵母提取物5.0 g / l),添加10%的标准化培养液,孵化24小时37°C在200 rpm(旋转瓶43]。实验进行了一式三份。蔗糖水解活动是通过添加0.5毫升酶化验从细菌获得上层清液0.5毫升的20%蔗糖( )在20毫米磷酸钠缓冲区,pH值6.0,反应混合物在37°C孵化了30分钟。反应是停止和还原糖测定DNS方法。被定义为一个单位的酶的酶产生1μ葡萄糖的摩尔每分钟(45]。

2.2.3。薄层色谱法(TLC)分析

反应混合物中的糖类分析薄层色谱法(TLC)硅胶G-60使用氯仿/醋酸/水(6:7:1按体积)作为流动相系统。层开发和流动相后,蒸发在空气连续15分钟,然后,混合物被放在烤箱设定在115°C,持续15分钟。在色谱斑点被喷洒可视化硫酸和乙醇的混合1:9 ( )在薄层色谱板46]。

2.3。果聚糖的分离、纯化和鉴定

2.3.1。果聚糖的分离和纯化

包含200毫升的种植在烧瓶中进行发酵培养基,接种10%标准培养液培养3天,37°C一套旋转瓶在200 rpm。细胞通过离心去除4500 rpm(45分钟,4°C),和上层的初步分析,确定了薄层色谱法(TLC)的化合物。

上层清液与绝对冷乙醇混合在一个比1:3 ( )。反应混合物在-20°C孵化24小时。反应混合物随后离心机在4°C 4500 rpm 45分钟收集沉淀。重复此过程,直到没有观察到剩下的从原始混合物。颗粒的溶解在热水Sevag其次是除蛋白的方法通过添加Sevag试剂( , )反应混合物和去除变性蛋白出现在水和氯仿层之间的接口。这个过程重复了五次增产。上层清液是接受透析袋MWCO 12000 Da在4°C对去离子水5天(47]。因此,去离子水代替淡水和原油果聚糖是通过冻干48]。

2.3.2。傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析

进行傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析测定官能团沉积的果聚糖的结构。在透射红外光谱被记录从4000年到400年的波数厘米¹在红外光谱分光光度计(珀金埃尔默,边界)的化学、理学院、Burapha大学,泰国。

2.3.3。¹H和¹³C核磁共振(NMR)谱

使用核磁共振光谱学果聚糖的结构进行了分析。在这里,0.5毫克的果聚糖溶解在D₂O为每个¹H NMR和¹³C NMR分析。然后,提交的样本异核单个量子关联(HSQC)分析使用D₂O溶剂。光谱被记录在力量UltraShield 400 MHz / 54毫米孔。¹H NMR光谱和¹³运行C NMR光谱在400 MHz。(力量、皇冠UltraShield 400 MHz光谱仪)的化学、理学院、Burapha大学,泰国。

3所示。结果与讨论

3.1。Levansucrase酶细菌的分离和鉴定

分离出的细菌发酵大豆levansucrase酶的筛选展出mucoidal殖民地种植在固体培养基。这个殖民特征可能是由于其生产的细胞外levansucrase蔗糖转换酶活动的形式存在于胞外的介质β葡萄糖-果糖甙(果聚糖)和释放。图1显示了殖民地的菌株mucoidal一致性。因此,细菌表现出这种一致性的基础隔离细菌的进一步分析。细菌被亚文化到新鲜的固体培养基标准技术。43(43)殖民地种植在混合文化板块,九(9)表现出谨慎和mucoidal一致性。隔离是进一步的特点是革兰氏阳性染色方法和发现,杆状细菌和革兰氏阴性球菌(表1)。levansucrase酶生物合成的选择性培养基上的隔离包含高蔗糖可能由细菌分泌的机制来解释通常观察到两种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。Levansucrase酶生物合成的革兰氏阳性细菌包括酶积累在细胞周质间隙和排泄的酶的细胞向周围环境的乳沟信号肽,而在革兰氏阴性细菌,信号肽的分泌途径启动Levansucrase到外环境(49]。

3.2。Levansucrase活动分析

3.2.1之上。从隔离Levansucrase酶的生产

孤立的细菌菌株菌落形态、革兰氏染色剂后选择技术进一步评估levansucrase酶生产和活动。结果表明,9个菌株,五株(B-5, b - 1 b - 6、B-4和b - 2)显示每股收益的生产潜力,选择细胞外酶的生产(补充图8)。产生的胞外酶levansucrase隔离蔗糖水解效率估计的百分比,计算出还原糖的浓度(补充表发布1),用机制levansucrase多糖合成和释放还原糖反应;因此,我们假设提高还原糖的浓度与高酶活性有关。图2显示性能的九个菌株的酶活性。的活动表现出5株能够水解蔗糖高达50%。另一方面,其他四个菌株(酮,害怕鲨鱼,B-8 B-9)表现出不到59%蔗糖水解。蔗糖水解的前5的比例进行酶菌株是明显不同于四个菌株的酶活性。b - 6,因此,隔离b - 1, B-5 B-4, b - 2酶被选作进一步分析。目前发现在细胞外酶的生产微生物同意研究Maugeri和Hernalsteens [45]筛选的微生物从水果和鲜花,获得被发现高fructosyltransferase分泌胞外酶的活动。以前描述的相同的标准介质组成的酶活性酵母提取物2%、5%蔗糖、1%纳米₃,0.01% MgSO₄h·7₂O, 0.1% K₂HPO₄(pH值5.5)是利用495酵母菌株和130菌株分离的菌株(约25%)显示高sucrose-containing下水解活动中与本给出的结果(45]。

3.2.2。酶机制

5酶细菌的胞外酶的发酵生产recultured媒介。酶化验测定反应中含有20% ( )蔗糖在20毫米磷酸钠缓冲区,pH值6.0,与原油混合酶。如图3(一个)B-5, b - 1, b - 6主要表现出酶活性最高的10.30国际单位/毫升,8.88国际单位/毫升,和8.51 IU /毫升12 h的发酵,分别。隔离b - 2酶活性最高15 h(5.68国际单位/毫升),和隔离B-4活动最高21 h(7.41国际单位/毫升)。最初,高浓度的蔗糖在中激活,诱导levansucrase生产和固定相的持续增长。在这个阶段,酶活性逐渐降低蔗糖的浓度也降低了。李的研究(20.)解释说,levansucrase酶活性依赖于初始底物浓度微生物生长的地方。衬底激活酶生产的高度集中,从而导致微生物的酶释放细胞外地。这个活动被观察到在最大浓度增长的固定相,下降后活动的死亡阶段。研究蔗糖水解活动是类似的活动b . amyloliquefaciens隔绝枫糖浆(30°Bx)在48小时导致最高levansucrase活动(427.53μ摩尔/毫克蛋白/分钟)(20.]。此外,Dajanta et al。37)报道,在成长阶段,微生物合成蛋白水解酶消化自由氨基酸基质中。这些研究结果强烈支持的前提下酶的生产是在最大的初始增长生物生长在high-substrate-containing媒介。

3.2.3。薄层色谱法(TLC)分析

后评估机制的酶菌株表现出的混合解决方案被发现在TLC板来确定糖组件。图3 (b)显示所有菌株的酶促反应水解蔗糖和隐蔽的单糖残基低聚糖和多糖。结果表明,有一个地方的蔗糖行0(在初始培养),因为细菌适应新环境,因为他们把在滞后阶段。道6、12、24和48(6、12、24、48小时的培养时间)日志阶段和固定相的细胞生长的进步,所有的细菌生长和产生酶生产的EPS。出于这个原因,糖在车道6、12、24、48透露在TLC板两部分组成:前一部分单糖和双糖,两者都是由胞外水解酶,和底部生成系统由单糖残基转移酶的活动。TLC分析可能限制区分多糖的分子量高于10 DP(聚合度);因此,细胞外酶催化蔗糖高分子量(50]。然而,该方法主要针对分析酶活性和酶促反应特征。从所有的菌株产生的支付系统是孤立的,通过分析方法及其结构被确定。

3.3。果聚糖的分离、纯化和鉴定

3.3.1。果聚糖的分离和纯化

胞外酶产生的支付系统从5菌株发酵培养基的特点是使用mono -薄层色谱分析和二糖检测(图4)。结果表明,三种酶活性的菌株,b - 2, B-4,和b - 6,果聚糖合成显示在底部发现fructotransferase活动随着水解活动表现出斑点的葡萄糖和果糖。我们比较这两个点的强度,发现果糖的浓度低于葡萄糖,果糖残留物被fructotransferase催化活动变成一个果聚糖的形式。这个活动是显示在色谱图上的点最低的果聚糖DP高。结果坚持渡边和Oda的报告51)答:rouxii哥伦比亚广播公司(CBS) 438.76水解自由/开源软件,菊粉,和果聚糖成果糖,完全51];然而,果聚糖蔗糖的生产是由连接生成果糖残渣和释放葡萄糖,从而导致更高的葡萄糖浓度比果糖。

三个菌株,b - 2、B-4和b - 6,基于以前的酶活性和TLC分析进一步调查。b - 6菌株的酶活性被发现是在最高性能在8.51国际单位/毫升12 h。b - 6菌株的fructotransferase活动是催化生产果聚糖成承诺果聚糖的形式。果聚糖的生物合成与培养证实b - 6菌株通过EPS净化过程。红外光谱和核磁共振光谱进一步产品特点。

3.3.2。傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析

进行了红外光谱分析测定官能团的沉积结构的果聚糖生产的b - 6菌株和记录透射模式从4000年到400年的波数厘米¹和比较标准的果聚糖(补充数据6 - 7)。图5提出了一种广泛而强烈的峰值在3600 - 3200厘米¹(具体地说,在3275.41厘米¹)地伸缩振动由于分子间氢键52]。碳氢键伸缩振动出现在3000 - 2800厘米¹(具体地说,在2933.89和2881.50厘米¹)。广泛的峰值为2933.89厘米¹振实不对称的美集团,但在2881.50厘米宽峰吗¹振动对称。碳氢键弯曲振动的亚甲基组出现在1416.48厘米¹(53]。1642.41厘米的宽带¹是由于结合水(54]。C-O-H伸缩振动出现在1123.31厘米¹,强烈的广泛峰值为1011.77厘米⁻¹以糖苷键(C-O-C)伸缩振动在吡喃糖或呋喃糖的碳水化合物指纹(55,56]。广泛的峰值为924.03和807.27厘米¹确认的呋喃糖糖单位(57]。光谱显示两大在917年达到顶峰,770厘米¹、特点的几个吡喃糖(58]。频谱代表分子吸收和传播,创造一个多糖的分子指纹。这些值几乎相同的以前的报告产生的果聚糖的值Brenneria goodwinii(48]。

3.3.3。分析¹H,¹³C NMR和2 d Heterocorrelated HSQC光谱

¹H和¹³关于果聚糖C NMR光谱提供了互补的数据结构。的¹H NMR光谱(图6(一))也被观察到的质子化学位移信号与果糖作为果聚糖的单体。这个信号是出席了化学位移为4.098 ppm (H3), 4.014 ppm (H4), 3.867 ppm (H5), 3.828 ppm (H6a), 3.673 ppm (H1a), 3.604 ppm (H1b)和3.48 ppm (H6b)(补充图所示2 - 4)与果聚糖产品共振b . megateriumGJT321 [55),b . methylotrophicusSK 21.002 [47),而地衣芽。BK AG21 [53]。

的¹³C谱(图6 (b)显示六个共振信号,104.02 ppm (C2), 80.28 ppm (C5), 76.29 ppm (C3), 75.19 ppm (C4), 63.38 ppm (C6)和59.91 ppm (C1)(补充图所示5),这证实了己糖的形状EPS的单糖和果聚糖是密切相关的,因为这些都是确定的碳原子化学位移的果聚糖从先前的研究报道(表2)。

此外,六个信号显示¹³C NMR光谱分析对应于果糖残渣。异头碳原子(C2)在104.02 ppm, C1和C6的亚甲基组在59.91和63.38 ppm,分别。信号峰值为80.28 ppm是归因于呋喃糖(C2),而山峰在C3和C4的76.29和75.19,分别与oxymethinic组。

此外,HSQC分析研究氢原子与各自的碳原子。获得的光谱显示相应的交叉峰的H1a / C1, H1b / C1, H3 / C3, H4 / C4, H5 / C5, H6a / C6, H6b / C6。然而,没有交叉峰的C2观察(表3)。结果肯定了第四纪异头碳字符(C2)。这证据显示的信号¹H,¹³C NMR, HSQC指的特点β-(2,6)联系的果糖残留果聚糖产品levansucrase的b - 6菌株。

3.4。细菌鉴定

基于整体活动的所有酶细菌隔离在这个工作中,b - 6菌株是最高的主要兴趣levansucrase酶生产果聚糖的合成。孤立的菌落的形态特征是大,圆形,透明的殖民地,表面光滑。显微镜下,孤立出现革兰氏阳性和杆状。根据菌株的分子分析,16 s rDNA基因序列表现出相似性百分比最高的99.68%b . siamensisNR_117274.1(部分序列由1525个基点)基因库。图7显示了neighbor-joining树构建的基因序列与序列感兴趣的应变结果数据库。爆炸结果利用levansucrase酶细菌的分子识别的研究。类似的研究报道革兰氏阳性的隔离,杆状levansucrase酶与身份属于微生物b . methylotrophicus基于16 s rDNA基因序列分析(47]。

4所示。结论

从这个研究结果显示levansucrase酶细菌的存在孤立于泰国的传统发酵食品及其生产应用前景的生命起源以前的果聚糖。筛查和隔离程序细胞外levansucrase活动导致五种细菌(b - 1, b - 2、B-4 B-5,和b - 6)表现出不同的蔗糖水解活动。隔离B-5, b - 1, b - 6显示最高的总活动在12小时在20.60,17.16,和8.51 UI /毫升。总的来说,菌株b - 6 fructosytransferase最高生产果聚糖的活动。基于红外光谱、核磁共振和HSQC分析,果聚糖的结构是一个果聚糖组成的连续β- (2,6)-fructopyranose单位。基于形态学和分子识别、16 s rDNA基因序列分析证实菌株的身份b . siamensisNR 11274.1。等因素不同的温度,煽动,培养时间、碳源,使用其他文化媒体可能探索进一步确定影响levansucrase酶生产的隔离。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果中包括补充信息文件(年代)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由泰国国家研究委员会(批准号19/2561)。

补充材料

补充图1:16 s rDNA测序分析结果揭示的身份levansucrase-producing细菌隔离b - 6芽孢杆菌siamensisNR 11274.1基于百分比(%)相似性得分为100。生成的结果已经被泰国科技研究所,生物多样性研究中心,2018年3月2日。补充图2:2 d NMR测试应变产生的果聚糖产品b - 6的结果。D HSQC频谱₂O的果聚糖产品从levansucrase b - 6菌株显示之间的直接连接¹³C和¹H (J_{H / C}果聚糖的果糖残渣(1^圣时间)。补充图3:D HSQC频谱₂O的果聚糖产品从levansucrase b - 6菌株显示之间的直接连接¹³C和¹H (J_{H / C}果聚糖的果糖残渣(2^nd时间)。补充图4:D HSQC频谱₂O的果聚糖产品从levansucrase b - 6菌株显示之间的直接连接¹³C和¹H (J_{H / C}果聚糖的果糖残渣(3^{理查德·道金斯}时间)。补充图5:识别levansucrase的b - 6菌株产生的果聚糖¹³C NMR谱levansucrase。补充图6:参考标准的红外光谱谱果聚糖。补充图7:果聚糖的红外光谱光谱产生的菌株,b - 6。补充图8:结果相对9菌株分离发酵大豆。相对活动指的是最大的活动。隔离酮,害怕鲨鱼,B-8 B-9与b - 1统计不同。补充图9:sucrose-hydrolyzing活动分析五种细菌产生的胞外酶。补充表1:DNS测定分光光度计读数的相对蔗糖水解的9个菌株分离发酵大豆。补充表2:酶活性浓度测定还原糖的DNS方法。(补充材料)

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