一个新的小鼠模型的慢性肾脏Disease-Mineral和骨骼疾病

文摘

慢性肾脏疾病(CKD)与矿物和骨骼疾病(MBD),广泛的主要原因是慢性肾病人群的心血管死亡率增加。我们旨在建立一个新的小鼠实验性CKD-MBD模型。稀释布朗non-Agouti (DBA / 2)老鼠与高磷饮食4 (HPD4)或7 (HPD7)天,然后与标准食物饮食(SCD),随后跟着直到84年的一天。他们与DBA / 2小鼠相比保持SCD整个研究期间。4和7天HPD-fed老鼠开发磷酸肾病肾小管萎缩、间质纤维化,肾小球滤过率下降,增加血清尿素水平。HPD-treated小鼠显示出媒体的腹主动脉钙化。Histomorphometric分析HPD-treated老鼠骨体积/组织体积减少,低矿物附着率,和骨形成率低SCD-fed老鼠相比,尽管增加甲状旁腺激素水平。总的来说,观察表型HPD7组更明显。总之,我们建立了一个新的非侵入性,因此容易执行复制CKD-MBD模型,显示媒体钙化、继发性甲状旁腺功能亢进,低收入骨病。

1。介绍

慢性肾脏疾病(CKD)是一个主要的健康负担每年每2011年美国肾脏数据系统的数据报告;15.1%的美国成年人有慢性肾病(1]。CKD本身,尤其是终末期肾病(ESRD),与高发病率和死亡率[2]。心血管疾病死亡率的最大原因CKD / ESRD和在很大程度上可归因于矿物质代谢异常导致广泛动脉钙化物质,降低血管合规、左心室肥大,心脏性猝死3]。当开始透析,50%的患者髋部骨折后骨折和存活率是0% (4,5]。

而不是nonuraemic科目在动脉钙化通常影响内膜的动脉粥样硬化斑块,CKD患者主要开发钙化的中模6,7]。当前的知识,放松管制矿物质和骨代谢相关慢性肾病的主要驱动力是媒体钙化的发生,导致这个词CKD-mineral和骨骼疾病(MBD) [8,9]。另外包括肾骨营养不良,这在大多数发展CKD患者。肾骨营养不良的光谱范围从低收入衰弱的骨疾病说骨炎fibrosa和超过一种类型可以共处在同一个病人9]。骨骼疾病发展由于甲状旁腺素放松管制,FGF23, sclerostin、和维生素D的水平,解除与肾功能下降(10]。所有形式的肾骨营养不良都伴随着骨质流失最终导致显著增加骨折的风险包括CKD人口(髋部骨折11,12]。尤其是衰弱的骨疾病患者容易发展广泛动脉钙化(4,5]。不幸的是,现有的生物标记物,如甲状旁腺素,FGF23,碱性磷酸酶只能差预测肾骨营养不良的各自的形式和有限的使用指导治疗。因此,根据KDIGO指南,骨活检和骨骼histomorphometry仍然是黄金标准诊断肾骨营养不良。然而,不建议经常执行ESRD患者骨活检(8,9]。然而,很少有随机对照试验评估不同治疗策略取决于肾骨营养不良的类型。小鼠CKD-MBD模型显然是需要测试假定的治疗策略治疗血管钙化和/或肾骨营养不良。最近,一位小计和尿毒症肾切除术/慢性肾病模型骨营养不良和异常骨体积和矿化已经发表(13]。这里,我们描述了一种新的非侵入性,因此容易执行复制CKD-MBD模型与继发性甲状旁腺功能亢进和媒体钙化。小计切除/慢性肾病模型相反,我们发现低收入骨病在我们的老鼠。

2。材料和方法

2.1。研究设计

女性8-week-old稀释布朗non-agouti 2 (DBA / 2 ncrl,以下称为DBA / 2)老鼠从查尔斯河(Sulzfeld、德国)和安置在病毒/ antibody-free环境在格拉茨医科大学的实验动物设施。这些老鼠容易受到异位肾钙化和媒体钙化暴露在增加口服磷酸盐负荷(14- - - - - -16]。为了引起肾损害,这些老鼠标准粮(SCD; 4)或高磷饮食(HPD4; )、7 (HPD7; )天之后回到SCD直到84天之后开始HPD的饮食。高磷饮食(Altromin拉赫,德国)包含20.2克的磷,9.4克钙,镁的0.7克,500 IU维生素D3的/公斤。磷的标准食物含有7.0克,10.0克钙,镁的2.2克,1000 IU维生素D3的/公斤。

所有动物实验动物实验的伦理委员会批准的奥地利外交部(bmwfw - 66.010/0061 - wf / V / 3 b / 2016)。所有实验的严格遵循法律规定的奥地利。

2.2。代谢研究

血液代谢研究得到实验的最后retro-orbital麻醉小鼠的出血。血清尿素含量测定标准的实验室技术。血清纤维母细胞生长因子23 (FGF23)水平(美国Immutopics国际,圣克莱门特,CA)和血清甲状旁腺激素(素水平(Immutopics国际)量化使用商用酶联免疫吸附试验板。

2.3。评估组织病理学、Histomorphometry和免疫病理

Formalin-fixed肾组织和主动脉是嵌入在石蜡,切成4μ部分染色之前。媒体以及肾钙化的程度确定组织学上用茜素红的技术。茜素红染色法是由孵化水化石蜡2%茜素红S溶液中部分(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。此外,picrosirius红染色是由孵化患者肾0.1% picrosirius红溶液中石蜡切片(Sigma-Aldrich)。

calcein-labelling,小鼠腹腔注射20毫克/公斤的钙黄绿素(Sigma-Aldrich) 7和2天前牺牲。此后,胫骨固定在70%乙醇和嵌入在甲基丙烯酸甲酯和分段。为进一步分析,采用甲苯胺蓝染色法。脱蜡、水化骨部分沉浸在甲苯胺蓝工作的解决方案(1%甲苯胺蓝啊,Sigma-Aldrich;2.5%的碳酸钠,70%乙醇)5分钟。此后,部分在dH2O洗,脱水在醋酸正丁酯和下滑。骨histomorphometric参数通过组织部分分析OsteoMeasure™软件(美国OsteoMetrics迪凯特,GA)。

OCT-embedded(樱花Finetek圣托兰斯、钙、美国)冷冻组织部分(4μ米)降低了免疫组织化学染色。三层immunoperoxidase技术用于检测浸润的巨噬细胞和T细胞在肾组织。巨噬细胞被染色使用老鼠anti-mouse马伯(anti-CD68克隆FA-11;Serotec,英国牛津大学)。半定量的评分系统kidney-infiltrating巨噬细胞进行如下:0 = 0 - 4细胞染色阳性,1 = 5 - 10细胞,2 = 10 - 50细胞,3 = 50 - 200细胞,4 = > 200细胞染色阳性/低功耗领域。

CD4检测⁺和CD8⁺T细胞,老鼠anti-mouse CD4(克隆YTS191.1;Serotec)和CD8 -α(克隆KT15;Serotec mAb)。Biotin-conjugated山羊anti-rat IgG抗体(美国杰克逊ImmunoResearch实验室、西树林、PA)被用作二次抗体,其后孵化streptavidin-biotin复杂(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)和后续发展有0.4% 3-amino-9-ethylcarbazole 5分钟和吉尔的苏木精复染色。T细胞是由定量计数阳性细胞的数量在6邻大功率肾皮质和髓质。

2.4。实时逆转录聚合酶链反应

小鼠组织存储在−80°C。总RNA从肾脏孤立使用三试剂(Sigma-Aldrich)根据标准协议。此后,2μg总RNA的使用上标三世反向转录的转录工具包(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和随机引物(表达载体)。产生Hprt基因是担任管家参考和评估使用SYBR绿色主人混合(英杰公司)和以下引物:5GCT太极拳柠檬酸广汽CGG TTT TTG C 3和反向5ATC GCT AAT CAC广汽GCT GGG 3 G行动 。量化的Foxp3,Gata3,Rorc,Tnfa,Tbx21,Ccr2,CCr5、基因表达分析Mm00475162_m1 Mm00484683_m1 Mm01261022, Mm00443258_m1, Mm00450960, Mm00438270,和Mm01216171(美国应用生物系统公司,培育城市,DA)被使用,分别。

实时PCR在重复执行CF96实时检测系统(Bio-Rad,维也纳,奥地利)。使用2 -数据评估^ΔΔCT方法。

2.5。肾小球滤过率(GFR)的测量

肾小球滤过率(GFR)被FITC-inulin间隙测量。FITC-inulin (Sigma-Aldrich;5%在0.85%氯化钠)透析24小时对0.85%的氯化钠。在透析FITC-inulin解决方案是无菌过滤和静脉注射(2μl / g体重)。3、5、7、10、15日,56岁,75分钟后注入,从尾静脉血液收集。离心后,血浆稀释1:10 0.5 mol / L玫瑰和荧光测定。肾小球滤过率(GFR)计算使用两阶段的两舱制模型指数衰减。

2.6。鼠标超声心动图

2 d-guided M-mode回声(30 MHz)从短期和烈度视图中得到的最大的使用VS-VEVO LV-diameter 770高分辨率成像系统(Visualsonics,多伦多,加拿大)配备30 MHz RMV(实时micro-visualization)扫描头。老鼠和2%异氟烷麻醉,被允许自然呼吸。胸部是剃,凝胶应用声学耦合,变暖垫是用来维持正常体温。老鼠成像在浅左侧卧位位置。LV舒张(EDD)和收缩末期(ESD)从原始轮廓尺寸测量使用前沿的超声心动图的美国社会。LV百分比分数缩短(LVFS), LV质量(LVM),舒张末期壁厚/腔比率计算如前所述[17]。

2.7。统计分析

从实验结果显示为±SEM手段。检验正态分布与Dallal-Wilkinson-Lilliefors使用Kolmogorov-Smirnov测试完成修正。当比较两组,根据分布参数Mann-WhitneyU测试或未配对的学生的t以及使用。比较三组时,方差分析或与后续邓恩克鲁斯卡尔-沃利斯执行测试的测试与调整为多个比较。一个双边 被认为是具有统计学意义。所有统计分析使用GraphPad Prism 6.0(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。

3所示。结果

3.1。高磷饮食4和7天诱发慢性肾脏疾病(CKD)随访后84天

女性DBA / 2小鼠喂养4 (HPD4)或7 (HPD7)天高磷饮食和随后直到84年天标准食物(SCD)。他们与DBA / 2小鼠化合物。在第84天,所有老鼠受到HPD发达与管状钙磷酸盐肾病羟磷灰石晶体,这是与茜素红染色阳性。只有小和大大减少茜素红积极存款DBA / 2小鼠中发现了标准的食物(SCD)(图1(一),上半部分)。评估纤维化,天狼星红染色。所有HPD的老鼠显示显著增加纤维领域特别是在小地区而不影响肾小球(图1(一)较低的面板)。组织学表型是增加HPD7老鼠比HPD4老鼠。

量化肾功能,我们执行FITC-inulin间隙,显示肾小球滤过率(GFR)下降在HPD组相比,控制SCD组,但意义只是达到HPD7组小鼠相比,SCD(数字1 (b)和1 (c))。,血清尿素增加HPD组相比,SCD(图1 (d))。

管状钙过羟磷灰石降雨与著名的有关肾白细胞(图的渗透2)。CD4⁺和CD8⁺T细胞被发现渗透到老鼠的肾脏处理HPD在间质面积,而显著减少人数检测分割组(图2(一个))。CD68的渗透主要包括⁺巨噬细胞,它被发现在HPD-treated数量显著增加小鼠(数字2 (b)和2 (c))。在一行中,我们发现增加巨噬细胞信使rna标记等碳碳趋化因子受体(Ccr)2和Ccr 5以及Tnfa肾脏的HPD老鼠(图2 (d))。TH1、TH2和TH17标记Tbx21,Gata3,Rorc分别没有监管在转录水平(图2 (d))。只有调节性T细胞的标记FoxP3提高黄芪丹参滴丸小鼠相比SCD-treated老鼠(图2 (d))。

3.2。心血管变化小鼠高磷饮食治疗,疗程7天84天标准Chow紧随其后

HPD7小鼠或SCD老鼠被超声心动图评估开始前的饮食和后续的第84天。超声心动图观察的主要限制是(n)数字84天HPD7老鼠小( )。没有区别在左心室(LV)收缩功能(EF和FS)或质量被发现老鼠之间的基线。HPD7老鼠在84天,初步观察显示没有区别在EF和科幻SCD的老鼠相比,虽然LV HPD7大众倾向于增加小鼠(数字3(一个),3 (b),3 (c))。小鼠心脏重量HPD7没有差异和SCD(图3 (d))。值得注意的是,未发现显著的心肌钙化物质在我们的老鼠(数据未显示)。

腹主动脉钙化的老鼠评估通过执行茜素污渍。钙化区域被发现在媒体上的主动脉HPD7老鼠,而没有发现钙化SCD老鼠(图3 (e))。

3.3。的模型CKD-Associated低收入骨病

代理参数骨病在CKD甲状旁腺激素(甲状旁腺素)和成纤维细胞生长因子23 (FGF23)进行评估。而我们发现显著增加甲状旁腺素在小鼠天HPD7组有84人SCD的老鼠相比,没有发现差异FGF23水平之间的三组数据4(一)和4 (b))。

老鼠calcein-labelled牺牲后,胫骨被骨histomorphometry评估84天。总的来说,骨骼结构更加恶化HPD7组。在细节中,我们发现骨体积/组织体积减少(BV /电视),矿物附着率(3月),骨形成率(BFR),侵蚀面/骨表面(ES / BS),类骨质表面/骨表面(OS / BS)和小梁厚度(Tb.Th) HPD4 HPD7组相比SCD老鼠,但意义只是达到HPD7组(数据4 (c),4 (d),4 (e),4 (f),4 (g),4 (h))。小梁分离(Tb.Sp)和骨小梁数量(Tb.N)组(数据之间没有差别4(我)和4 (j))。

4所示。讨论

在这个手稿,我们提出一个新的模型,CKD, MBD如图所示动脉媒体特性的钙化,继发性甲状旁腺功能亢进,低收入骨病。

经典的CKD模型是5/6肾切除术模型,这很难执行始终在老鼠身上,因为健壮的CKD在大多数情况下不是诱导。因此,如今,大多数组织使用CKD模型建立了Gagnon et al .,在大多数的一个肾的肾表面凝固之后,其他几个星期后肾脏的肾切除术复苏(18]。然而,期间和之后这个过程是高死亡率和手术是必要的诱导慢性肾病(13),这是一个固有的偏见来源。在我们的模型中,我们不需要手术干预,这些小鼠的死亡率很低(5 - 10%;数据未显示),因为我们停止HPD 4或7天,分别。正如先前所显示的,死亡率迅速增加在我们的老鼠当美联储HPD超过10天(19]。值得注意的是,选择DBA / 2菌株诱导CKD至关重要,由于C57BL / 6小鼠不开发关键钙化肾脏和心血管系统(20.]。这是解释这一事实DBA / 2小鼠有替代的拼接变体Abcc6导致增加易感性基因开发组织钙化(14- - - - - -16]。

在慢性肾病模型,小鼠患CKD反映CKD第三阶段以来人类肾小球滤过率(GFR)下降了50% SCD的老鼠相比,不同的手术诱导CKD第五阶段模式13,21,22]。因此,我们的模型提供了机会学习早期CKD-MBD不同器官的变化,这是特别感兴趣的,因为只有早期干预似乎改善我们的CKD患者的死亡率和发病率。

我们的CKD老鼠患上心血管变化等媒体在腹主动脉硬化。从我们的数据,我们不能明确地告诉他,老鼠也会开发同心左心室肥大是否因为我们有低(n)数字超声心动图和心脏重量组没有差异。HPD-induced急性肾损伤模型中由于磷酸肾病,我们发现无营养心脏的照片钙质沉着造成的死亡率显著增加小鼠(19]。在慢性肾病模型,提出心脏图片看起来是不同的,因为我们没有检测相关钙化心肌(数据未显示),但超声心动图的初步观察表明,小鼠心脏肥大可能由于高血压的发展某种程度上它更像人类CKD-MBD表型。然而,增加(n)数字超声心动图和进一步评估如血压测量是必要的详细描述心脏表型。在慢性肾病模型,我们发现媒体在腹主动脉硬化主要是,这是符合我们之前的数据发表在一个HPD-induced急性肾损伤小鼠模型(23]。在CKD患者和慢性肾病小鼠模型中,有一个不同的易感性升主动脉和腹主动脉血管钙化(媒体23]。这个观察发现的机制到目前为止仍然是难以捉摸的。这是推测,由于他们不同的胚胎起源,不同部分的主动脉血管平滑肌细胞有不同的易感性钙化(23,24]。

在CKD的老鼠,我们发现低收入骨病进行骨histomorphometry即使在HPD老鼠甲状旁腺素水平显著提高。这突显出一个事实:甲状旁腺素是一个不完美的CKD评估骨疾病的标志,和骨骼histomorphometry应该被认为是黄金标准诊断骨疾病慢性肾病(8,9]。有趣的是,我们发现FGF23水平提高后14天(数据未显示),而没有可检测84天的区别。显然,早期FGF23增加是一种生理反应HPD为了清楚过度口服磷酸盐摄入量但规范化后11周的长期观察间隔标准食物的饮食。尽管如此,还会很有趣的研究以来,老鼠的骨骼FGF23表达式表达水平增加描述了最近在CKD患者肾功能的骨骨营养不良(25]。据我们所知,这是第一个实验性慢性肾病模型描述低收入骨病。其他人发布的模型在手术诱导小计切除肾骨营养不良/慢性肾病模型(13,21,22]。我们的模型相反,histomorphometry评估腰椎而不是在胫骨(13]。他们的表现microCT tibia-trabecular地区,发现增加骨体积和减少矿物质密度在老鼠的干骨后端13),而我们发现减少骨体积和矿化的胫骨慢性肾病模型。然而,我们需要进一步分析骨疾病在我们的模型中通过组织学和共焦显微镜的方法来获得额外的洞察我们新小鼠模型进行了描述。

总之,我们的鼠标模型提供了一个新的,易于执行的工具来研究CKD-MBD的发病机理和治疗方案,特别是在CKD低收入骨骼疾病。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢安玛丽Ferstl-Rohrbacher帮助他们骨头histomorphometry执行。博士生比安卡Frauscher修读博士课程的的格拉茨医科大学分子医学。这工作是进一步支持的奥地利科学基金(FWF)菲利普·埃勒(p - 27537)。博士生Ida撕咬和Foteini Moschovaki-Filippidou收到奥地利科学基金资助(FWF) (W1241)和格拉茨医科大学的博士学位项目(DK-MOLIN)炎症的分子基础。

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