产超广谱β-内酰胺酶的表型和基因型分析大肠杆菌殖民孕妇

摘要

介绍。产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）细菌引起的感染仍然是选择合适治疗方法的一个挑战，因为它们可能与许多其他种类的抗生素表现出协同耐药性。这项研究的目的是在黎巴嫩贝鲁特对孕妇进行产ESBL细菌的筛选，检查其表型和基因型特征，并研究ESBL定植与新生儿不良结局之间的关系。方法。在这个横断面研究，从308名孕妇在35-37周的妊娠阴道样本期间一年时间进行了研究。将样品铺于MacConkey琼脂和选择性MacConkey琼脂补充有头孢他啶。ESBL生产的表型的确认通过双盘协同试验进行，并且所有的分离物通过PCR筛选耐药基因BLA_SHV公司，布拉_TEM,bla_CTX-M型. 克隆相关性大肠杆菌采用脉冲场凝胶电泳对分离物进行了研究。结果。308名妇女中有59名（19.1%）被产ESBL的革兰阴性菌定殖。感染ESBL的母亲所生的两个婴儿被诊断为败血症。对其他抗生素的敏感率分别为：复方新诺明39%，环丙沙星49.2%，庆大霉素91.5%，氨曲南18.6%，头孢吡肟35.6%。大多数菌株对美罗培南和亚胺培南高度敏感，敏感率为93.2%。对所有大肠杆菌分离出最常见的ESBL产生基因;布拉_CTX-M型为优势基因（90.7%），其次为bla_TEM（88.4%）最后是bla_SHV公司(44.2%)。的34 PFGE分析大肠杆菌分离株显示出22个不同的簇，显示出85%以上的相似性。结论。总之，这项研究表明，黎巴嫩孕妇携带ESBL的比例很高。应开展进一步的研究，包括对孕妇进行持续筛查和对其新生儿临床状况进行随访，以预测传播的风险。

1.介绍

新生儿败血症是一种血液感染在出生后的第一个月期间发生。早期发作新生儿败血症（EOS）被认为是在新生儿[死亡率和发病率的主要原因1个]. 它发生在出生后的头三天，通常在分娩时由母亲传给婴儿[1个]. 当羊膜破裂或分娩前引起羊膜内感染时，感染也可能垂直传播[1个,2个]。最常与环境状态相联系的有机体是无乳链球菌和大肠杆菌[1个,2个]. 后者约占所有EOS的24%；81%的病例发生在早产儿身上[1个]. 高定植率超广谱β-内酰胺酶的产生肠杆菌科尤其是在母亲的阴道内大肠杆菌和克雷伯氏菌肺炎，也曾在受感染的新生儿身上发现[三,4个]。因此，可能出现传输到分娩的新生儿和EOS继发大肠杆菌可能导致菌血症具有或不具有在交货时间脑膜炎[1个]。

产ESBL细菌引起的感染仍然是选择合适治疗方法的一个挑战，因为它们可能与许多其他种类的抗生素有协同作用[5个,6个]。在关于孕妇产ESBL的细菌定植文献存在稀疏的信息。重要的是要知道在特定的地理位置，这些微生物的流行和制定适当的筛选政策是非常重要的。

这项研究的目的是在黎巴嫩贝鲁特筛选孕妇体内产ESBL的细菌，并检测其表型和基因型特征。该研究还旨在探讨ESBL定植与新生儿不良结局之间的关系。

2。材料和方法

2.1条。研究人群

2016年3月至2017年3月进行了一项横断面描述性研究，涉及308名怀孕35-37周的孕妇，她们在贝鲁特及其周围的不同妇产科诊所进行产前检查。妇女签署了一份同意书，同意她们参加这项研究。主治医师从每个到诊所接受产前护理的患者身上采集一块阴道拭子。样品在室温下保存在Stuart培养基（Oxoid，UK）中，直到运送到临床诊断实验室。

2.2。数据采集

165例(55%)患者的社会人口学资料、临床状况和妊娠史由妇科医生通过问卷调查收集。问卷的目的是测量女性的年龄、教育程度、健康和分娩相关的变量(分娩类型和分娩时间、妊娠糖尿病、贫血、以前的流产、尿路感染、引产和与动物接触作为自变量。问卷还测量了新生儿结局(新生儿体重、身高和Apgar评分)作为因变量。问卷由对参与者进行检查的医生填写。匿名和保密得到保证，参与者签署了书面知情同意书。本研究得到了贝鲁特阿拉伯大学机构审查委员会的批准。

2.3条。细菌分离鉴定

The clinical samples were plated on MacConkey agar and selective MacConkey agar supplemented with 1 mg/L of ceftazidime (CAZ). Plates were incubated at 37°C under aerobic conditions and examined after 24 and 48 h incubation. All isolates were identified by their culture characteristics, standard biochemical tests, and confirmed by API 20E (Biomerieux, Mary l’Etoile, France) according to the manufacturer’s instructions.

2.4条。ESBL的表型筛选

根据临床实验室标准研究所(CLSI)的建议，采用克比-鲍尔碟扩散法对收集的分离株进行了抗生素敏感性测试。使用的抗生素片(Hi-Media，印度)为庆大霉素(GN, 10g） ，头孢他啶（CAZ，30 ）g） ，头孢噻肟（CTX，30 g)、环丙沙星(CIP, 5g） ，复方新诺明（SXT，25 g） ，亚胺培南（IPM，10 克），阿莫西林/克拉维酸（AMC 20/10，µg） ，美罗培南（MEM，10 g） ，头孢吡肟（CPM，30 g） 和aztreonam（自动取款机，30 g). ESBL产生的表型确认采用双盘协同试验(DDST)。该方法利用三个光盘:AMC, CAZ和CTX，放置25 - 30mm间距的AMC光盘在中间。在37℃空气中孵育过夜后，当CAZ和CTX周围的抑制区域扩大到AMC附近至少5毫米时，对ESBL产生菌的确认进行了评估[7个]. Etest（AB Biodisk，Solna，Sweden）也证实了ESBL的生产，使用了含有CAZ（0.5–32 ）的双条带g/mL）和CAZ/克拉维酸（0.064–4 g/mL)， CTX (0.5-32g/mL）和CTX/克拉维酸（0.064–4 g/mL)置于Mueller-Hinton琼脂上。当克拉维酸导致MIC中>3 2倍浓度下降(比值>8)时，分离物被认为是ESBL的生产者。此外，如果观察到CAZ周围的幻像区或变形区，且与比值或MICs无关，则应变被认为是ESBL产生者[7个]. ATCC®35218™ 和ATCC®25922™大肠杆菌对照菌株连续作为β-内酰胺酶和非β-内酰胺酶产生菌的阳性对照。

2.5。核酸提取和扩增β内酰胺酶基因

从分离的产ESBL菌株中提取DNA大肠杆菌菌株在过夜生长，按照制造商的说明书，使用QIAamp的DNA Mini试剂盒（Qiagen社，德国希尔登）。所有菌株中筛选出的抗性基因BLA_SHV公司，布拉_TEM，布拉_CTX-M型使用通用引物进行PCR（表1个). 总体积为20 ，进行PCR扩增反应l含2 1个10 X PCR缓冲液，0.5 每个正向和反向底漆的l（10 mM），1.2 一升氯化镁_2个（25 毫米），2 1 l dNTP mix (20mm)， 0.5 g AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts)和21个DNA模板。扩增周期如下：在95°C下初始变性15 min；然后在95°C下40个周期变性30 s，56°C（bla_SHV公司，布拉_TEM)或58°C（bla_CTX-M型) 30秒，72℃60秒;最后在72°C温度下延长10分钟。PCR扩增产物在1×TAE缓冲液中1.5%琼脂糖凝胶电泳。

2.6条。脉冲场凝胶电泳（PFGE）

PFGE使用Xba I限制性内切酶（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）进行大肠杆菌隔离根据协议PulseNet的孕妇鉴定。克隆和基因组关联性，使用的CHEF映射器（Bio-Rad公司，奥斯汀，TX）测定。该BioNumeric指纹软件（Applied数学，比利时）来分析的轮廓和生成描述分离株之间的关系的树形图。使用Tenover的标准PFGE模式进行分析（同一群集如果骰子相似性指数> 85％和<大于6个频带的差异）。

2.7条。统计分析

使用频率和百分比计算抗生素敏感率。以ESBL为自变量的定植与新生儿身高、体重和Apgar评分（分娩后立即对新生儿进行全面健康评估）作为因变量相关，同时考虑到其他可能的混杂变量，包括母亲的年龄、母亲的教育程度，以前流产，分娩周，分娩类型，引产，复发性尿路感染，妊娠糖尿病，贫血，阴道分泌物，与家畜接触。在多元回归分析中，测量自变量对因变量影响程度的β系数被计算出来。统计显著性计算使用 -值和置信区间。

定植与ESBL的分类结果变量（妊娠合并糖尿病，阴道分泌物增多，诱发劳动和复发性尿路感染）的影响，使用独立的卡方的试验探索。 -计算值时考虑作为重要的结果。

三。结果

3.1。产ESBL菌株药敏

本研究对308例参与试验的孕妇进行了研究，共获得产ESBL的革兰阴性杆菌59株（19.1%），其中革兰阴性杆菌中最常见的分离菌为大肠杆菌， 43株(72.9%)，其次为15株K、 肺炎（25.4%）和一个分离物奇异变形杆菌（1.7%）。

本研究采用三种表型分析方法对所有分离株进行了检测。分离的ESBLs纸片扩散敏感试验结果显示，均对阿莫西林克拉维酸、头孢他啶和头孢噻肟耐药。对其他抗生素的敏感率分别为：复方新诺明39%，环丙沙星49.2%，庆大霉素91.5%，氨曲南18.6%，头孢吡肟35.6%。大多数菌株对美罗培南和亚胺培南高度敏感，敏感率为93.2%。所有菌株对所有抗生素均不敏感，所有菌株对两种以上抗生素均表现出耐药性。对3种及以上抗生素的多重耐药率为25.4%。数字1个和表2个说明59个分离株中不同分离株ESBL的耐药模式。

3.2条。超广谱β-内酰胺酶基因在大肠杆菌阳性菌株中的流行

对所有大肠杆菌检测最常见ESBL的分离物大肠杆菌产生基因；bla_CTX-M型占主导地位大肠杆菌基因（90.7%），其次是bla_TEM（88.4%）最后是bla_SHV公司（44.2%）（表三)。38个分离株(88.4%)携带一种以上的b-内酰胺酶基因。bla的共存_CTX-M型还有布拉_TEM在19株（44.2％），血乳酸检测_CTX-M型还有布拉_SHV公司在3株（6.8％）和BLA_CTX-M型，布拉_SHV公司还有布拉_TEM16株(37.2%)。单一基因的携带，等等_CTX-M型或BLA_TEM分别在1个和3个分离株中观察到基因。

3.3。脉冲场凝胶电泳分析

的34 PFGE分析大肠杆菌分离株显示出22个不同的簇，显示出85%以上的相似性。在8株（23%）分离株中，第4群表现突出。集群10、11、13、15和19出现在多个大肠杆菌隔离。Clutser 4株具有不同的抗菌药物敏感性曲线（图2个). 样本25和样本26具有非常相似的轮廓，两个分离株之间的差异是SHV基因的额外存在。

3.4条。感染与新生儿结局的关系

在目前的研究中，回顾性的数据收集显示，两个婴儿出生的母亲定殖ESBL被诊断为败血症。然而，母亲和婴儿分离株都不能用于基因比较。

以新生儿结局（体重、身高和Apgar评分）为因变量的三个多元回归模型的结果如表所示4个. 结果表明，ESBL定殖与新生儿身高呈负相关，但无统计学意义。然而，分娩周与新生儿身高呈显著正相关，母亲年龄、分娩类型与新生儿身高呈显著负相关。新生儿身高增加0.38 cm，分娩时间增加1周(值 = 0.003）随母亲年龄的增加而减小0.23 cm(值 = 0.04）。新生儿身高也随剖腹产而降低（β =0.46；值 = 0.004）。另一方面，ESBL定殖与新生儿体重下降呈显著负相关（β = -0.31； )。剖腹产与体重也有显著负相关(Beta = - 0.41;第页值= 0.009)，分娩时间与新生儿体重显著正相关;额外分娩周体重增加0.33克(值= 0.008)。ESBL定植与Apgar评分呈负相关，但无统计学意义。其他协变量没有产生显著的相关性。

4.讨论

在黎巴嫩，抗药性正成为一个主要威胁。以前曾有报道称，黎巴嫩患者胃肠道中存在着对抗生素耐药的微生物定植[八]。经验性治疗、抗生素处方不当以及大量使用非处方抗生素加剧了抗生素耐药性的出现[9个]. 2013年，中国大肠杆菌和克雷伯氏菌种数分别达32.3-29.2% [10]. 在2016年肠杆菌科第三代头孢菌素类药物占59%[11]。

这项研究是黎巴嫩首次评估孕妇体内ESBL的流行情况。我们的研究显示19.1%的患病率，这与之前报道的7.5%到25%的患病率相似[12–14]. 对头孢吡肟、三甲氧苄氨苯并噻唑、氨曲南和环丙沙星的高耐药率反映了黎巴嫩耐药率的上升。庆大霉素、美罗培南和英培南对大多数分离菌株敏感，可作为预防感染的产时抗生素。抗药性菌株可能存在于母亲的生殖道中，并可能在分娩期间传播给新生儿。早产儿极易产生ESBL肠杆菌科新生儿护理室败血症。[三,4个,15]. 已报告母婴传播，在母婴之间通过垂直传播确定了相同的菌株[16–18]。

目前尚不清楚在分娩过程中使用抗生素是否可以降低新生儿感染ESBL的风险。有争议的数据显示，抗生素能够通过胎盘到达胎儿，因此增加了新生儿获得ESBL-PE的风险(新生儿获得ESBL-PE的风险)。到目前为止，在黎巴嫩，还没有就监测ESBL殖民化的孕妇达成协议。孕妇物种筛选仅用于链球菌agalactiae作为黎巴嫩和其他中东国家产前检查的一部分[19,20]. 因此，传播和感染的风险很小。其他感染的母婴传播率应通过进一步的研究进行调查，包括持续收集和筛选母亲的阴道样本，并对其新生儿的临床状况进行随访。在目前的研究中，两个婴儿被诊断为新生儿败血症。此外，对分娩前后接触过抗生素的ESBL感染妇女所生的孩子进行长期随访也很重要。因此，早期诊断可以将传染给婴儿的风险降到最低。研究致病因子如K1胶囊对新生儿脑膜炎的发生有重要意义。

获得ESBL耐药性的危险因素包括过度使用抗生素[21]中，除了从社区，家畜，动物和环境[抗性基因的传输22]. 在当前的研究中，我们证明了CTX-M和TEM基因在社区患者中的高患病率。这一结果与该地区的其他研究结果一致；然而，大多数研究都是在调查从住院病人中分离出的带有CTX-M-15基因的菌株[23,24]。CTX-M-producing大肠杆菌分离物通常对各种抗生素类，包括复方新诺明、氨基糖苷类和氟喹诺酮类有协同抗性[25]. 在我们的研究中，18大肠杆菌携带CTX-M基因的菌株对环丙沙星耐药，24株对复方新诺明耐药。

PFGE分析显示中的基因组多样性大肠杆菌孕妇产ESBL菌株中存在一个主要循环克隆的菌株。应该对新生儿做进一步的分析，以调查是否有着色剂传播。

5个。结论

总之，这项研究表明，黎巴嫩ESBL运输孕妇患病率较高。应当指出的是，目前的研究有一些限制;只有孕妇没有进行对他们的新生的后续研究，衡量传输速率检测。此外，我们没有筛选可能已经启用了作者，以确定是否怀孕可获取性菌株的危险因素未孕妇女。

数据可用性

所有作者都确认所有数据和资料都是可用的。

伦理批准

研究活动由贝鲁特阿拉伯大学国际审查委员会（IRB）根据IRB#0041-S-P-0336进行审查。

的利益冲突

所有作者都声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

除了数据分析和手稿的撰写外，NG还负责研究设计、执行和分析实验。MEC负责研究设计，监督和分析实验，并负责撰写手稿。AE和RH负责采样和临床解释。GM、ABF和NS进行了PFGE实验和分析。AG负责数据的流行病学和统计分析。RD，WAF和HY修改了手稿。所有作者都审阅并批准了手稿。

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