人参皂苷Rg3通过减少细胞凋亡和炎症改善心肌缺血/再灌注后的心功能

摘要

目标．人参皂苷Rg3是从分离出的主要成分的人参皂甙的一个Panax Ginseng.．既往研究表明，人参皂苷Rg3对心肌缺血/再灌注- (I/R-)损伤有保护作用。客观的．本研究旨在探讨人参皂苷Rg3对大鼠心肌I/R所致心功能损害的影响。方法．sd大鼠心肌I/R。进行超声心动图、血流动力学参数和组织病理学检查。P53、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的表达及TNF-的水平α.和il - 1β测量左心室。结果．人参皂苷Rg3增加左室缩短分数和左室射血分数。人参皂苷Rg3也能减轻心肌I/ r大鼠左室舒张末期压升高、左室收缩压降低和±dp/dt降低。人参皂苷Rg3通过抑制caspase-3的激活而减少凋亡细胞。人参皂苷Rg3也能显著降低TNF-的含量α.和il - 1β在心肌I/ r大鼠左心室。结论．的研究结果表明，人参皂苷Rg3具有改善心肌I / R引起的心脏功能障碍的效果和人参皂苷Rg3是有关抗凋亡和抗发炎的其属性的药理作用的机制。

1.介绍

全球65岁以上人口中，心力衰竭患病率达1%。据估计，全球37%的症状性心力衰竭病例是由心肌缺血引起的[1］.心肌细胞负责收缩功能。然而，心肌细胞具有有限的再生能力。因此，保留现有的心肌细胞以支持适当的功能是重要的。心肌梗死导致该领土的缺血，这将导致达到10亿心肌细胞的死亡[2］.细胞凋亡是一种独特的细胞死亡形式，是心肌缺血时心肌细胞丢失的主要机制。梗死周和非梗死心肌细胞凋亡增高，左心室内径增大，心功能降低。因此，抑制心肌细胞凋亡的治疗是改善心肌梗死后心功能的一种很有前景的方法[3.，4］.缺血性心肌细胞也会引发强烈的炎症反应。大量实验证据表明，炎症会加重缺血性损伤[5，6］.

人参，根源Panax Ginseng.梅耶被列入中国药典，广泛用于治疗心血管疾病。人参皂苷是人参的生物活性成分。研究表明，人参皂苷通过许多机制具有潜在的心血管益处，包括抗氧化和抗炎症的特性[7］.人参皂苷Rg3是人参皂苷的一种。有报道称人参皂苷Rg3通过调节线粒体的动态重构，提高线粒体的数量和质量来改善心脏功能[8］.最近的研究表明，人参皂苷RG3通过Akt /内皮一氧化氮合酶信号通路衰减心肌缺血/再灌注（I / R）损伤[9］.到目前为止，大多数研究集中在人参皂苷Rg3对心肌I/R损伤的保护作用。然而，人参皂苷Rg3在心肌I/R后改善心功能的潜在能力尚未被研究。因此，本研究旨在评价人参皂苷Rg3是否能改善大鼠心肌I/R后心功能。

2。材料和方法

2．1．材料

吉林大学药用化学系提供了白苷RG3，是白色无定形粉末。人参皂甙RG3的化学结构如图所示1．人参皂苷Rg3的分子量为785。采用高效液相色谱法测定其纯度(>99%)。肿瘤坏死因子-α.和il - 1β酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN, USA)。

2.2。动物

雄性Sprague-Dawley大鼠称重270-290g，从吉林大学的实验动物中心获得。它们被居住在通风良好的动物单位（°C，12-H光/暗循环）并免费获得标准饮食。大鼠被给予水广告。该实验根据国家卫生研究院公布的实验动物的护理和使用指南进行（NIH出版号1996年），并由吉林大学当地伦理委员会批准（J130926）。

2.3。实验方案

用氯醛（300mg / kg，腹膜内）麻醉大鼠。通过左冠状动脉的一级闭塞产生Myactardial缺血30分钟，然后再灌注如前所述[10］.假手术组大鼠不进行冠状动脉左前降支结扎。心肌缺血/再灌注大鼠随机分为心肌缺血/再灌注组(I/R)、人参皂苷Rg3 (5 mg/kg)组和人参皂苷Rg3 (20 mg/kg)组。在再灌注时间点，假手术组和I/R组大鼠ig生理盐水。人参皂苷Rg3组动物灌胃5、20 mg/kg剂量，每日1次，连续7 d。

2.4。超声心动图

在最后一次治疗后2小时，如前所述，使用标准设置和10S扫描头(GE Vivid I, GE Healthcare, USA)进行经胸超声心动图检查。用氨基甲酸乙酯(1 g/kg，腹腔注射)麻醉动物。进行二维和m型超声心动图测量。首先在乳头肌位置获得左心室的短轴二维图像。然后以100 mm/s的扫描速度获取m模式图像并进行数字存储。通过m型图像获取左室舒张期内径(LVIDd)和收缩期内径(LVIDs)后，自动计算左室缩短分数(FS)和左室射血分数(EF)。这些参数由一位经验丰富的超声心动图医师测量，他对治疗方法一无所知。

2．5．血流动力学测量

超声心动图测量后，用2f聚乙烯导管将大鼠右侧颈总动脉插管至左心室。因此，使用血流动力学分析系统(模型RM-6000，日本日本Kohden)测量左室收缩压(LVSP)、左室舒张末期压(LVEDP)和左室压一阶导数正、负最大值(±dp/dt)。

2.6。TUNEL染色

TUNEL染色采用原位细胞死亡检测试剂盒(POD)(罗氏公司，巴塞尔，瑞士)进行评估。心功能评价后，制作大鼠心脏切片。按照厂家提供的染色方案进行染色。采用奥林巴斯ix51反射光荧光显微镜(Olympus Corporation, Tokyo, Japan)盲法随机选取每个切片10个区域进行凋亡细胞计数。然后计算细胞凋亡。

2.7。免疫印迹分析

左心室的蛋白通过十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，然后转移到使用电泳转移系统的聚偏二氟乙烯膜。The membranes were blocked for 2 h with 5% bovine serum albumin and incubated for 24 h at 4°C with primary antibody. The primary antibodies were as follows: P53 (1 : 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), Bcl-2 (1 : 500, Abcam, Cambridge, UK), Bax (1 : 500, Abcam, Cambridge, UK), cleaved caspase-3 (1 : 1000, Abcam, Cambridge, UK), andβ-Actin（1：2000，ZSGB-Bio，北京，中国）。用马萝卜过氧化物酶 - 缀合的山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗检测初级抗体（1：2000）。ECL检测试剂用于检测结合。为了定量分析免疫印迹带的密度，用凝胶 - Pro分析仪3.0版进行密度测定法。

2.8。检测肿瘤坏死因子-α.和il - 1β在左心室

制备左心室的上清如下。Five hundred milligrams of the left ventricles was homogenized in 9 volumes of ice-cold saline and centrifuged (1000 ×g) at 4°C for 15 min. The supernatants were removed and stored at −80°C for further analysis. The amount of protein in the supernatant was measured according to the previous method [11以牛血清白蛋白为标准。tnf-的水平α.和il - 1β采用市场上可用的ELISA试剂盒，并遵循制造商的协议，使用酶联免疫吸附测定板(ELISA plate reader)对左心室上清液中的酶联免疫吸附测定。对每个样品进行重复样品分析。

2.9。统计分析

采用SPSS 22.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett’s检验确定数据的统计学意义。值< 0.05认为有统计学意义。

3.结果

３．１．人参皂苷Rg3对LVIDd、LVIDs、FS、EF的影响

我们用超声心动图评价人参皂苷Rg3对心功能的影响。如图所示1，与假组进行比较，心肌I / R大鼠显示出LVIDD的增加（相对 mm) and LVIDs (相对 mm). Moreover, FS (%与%)及EF (%与%)，与假手术组相比，I/R组显著降低。然而，与I/R组相比，人参皂苷Rg3治疗改善了心功能，降低了LVIDd和LVIDd，增加了EF和FS(图)2(一个)和2 (b)）.

３.２．人参皂苷Rg3对LVSP、LVEDP及±dp/dt的影响

与假手术组相比，心肌I/R诱发心功能损害，LVEDP显著升高，LVSP和±dp/dt降低。5 mg/kg或20 mg/kg人参皂苷Rg3治疗可缓解心肌I/R引起的LVEDP升高及LVSP和±dp/dt降低(或， 数字3.）.

３．３．人参皂苷Rg3对凋亡细胞的影响

为了评价人参皂苷Rg3对心肌细胞凋亡的作用，TUNEL染色在左心室的梗塞周围地区开展。代表性图像在图中显示4(一)．tunel阳性细胞表现为明显的绿色凋亡细胞核。与假手术组相比，I/R组凋亡细胞明显增多。人参皂苷Rg3可显著减少凋亡细胞数量(或， 数字4 (b)）.

3．4．人参皂苷Rg3对P53、Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3表达的影响

如图所示4，P53，Bax和Cleave Caspase-3的蛋白质表达增加，而Bcl-2的蛋白表达在心肌I / R后降低。人参皂苷RG3处理降低了P53，Bax和Cleaved Caspase-3水平，并增强了Bcl-2的表达（或,数据图5（a）和图5（b））.

3．5．人参皂苷Rg3对TNF-水平的影响α.和il - 1β在左心室

tnf-的水平α.和il - 1β在I / R组的左心室增加当与假手术组相比（）.然而，5和20 mg/kg剂量人参皂苷Rg3治疗显著抑制TNF-水平的升高α.和il - 1β心肌I / R诱导（的， 数字6）.

4。讨论

在发达国家，心肌梗死的发病率在过去二十年中有所下降。因为它最终发展为心力衰竭，心肌梗死仍然是过去十年的主要杀手[12］.虽然现有的治疗方法改善了心衰患者的临床病程，但迫切需要新的治疗方法来提高心梗患者的生活质量，降低心梗患者的发病率和死亡率。本研究的主要发现如下。首先，人参皂苷Rg3改善心肌I/ r诱导的心功能损害，表现为FS、EF、LVSP和±dp/dt升高，LVEDP降低。其次，这些实验证据表明人参皂苷Rg3的药理作用机制与其抗凋亡和抗炎性质有关。

心脏功能与心室收缩和舒张功能密切相关。研究表明，心肌I/R损伤可引起心脏血流动力学参数的改变，进而影响心功能[13］.超声心动图和血液动力学分析系统广泛用于测量心肌缺血性动物模型中的心脏功能[14，15］.在我们的实验中，LVIDS，FS和EF减少，而LVIDD在心肌I / R大鼠中增加，表明心肌功能障碍受损。然而，LVIDS，FS，EF和LVIDD的变化是由人参皂甙RG3处理改善的。符合这些结果，血流动力学测量的数据也表明人参皂苷RG3缓解了LVEDP的增加和由心肌I / R引起的LVSP和±DP / DT的降低。这些发现表明人参皂苷RG3可以在心肌I / R损伤后改善心脏功能。

心肌缺血后，细胞凋亡在心功能不全的机械和分子机制中都起着关键作用[16］.在本研究中，TUNEL测定来评价心肌细胞凋亡水平。的心肌细胞凋亡在患有心肌I / R大鼠心脏增大。与人参皂苷Rg3处理导致减少心肌细胞凋亡率，表明人参皂苷Rg3有助于对心脏功能的改善的抗凋亡作用。Caspase-3的在细胞凋亡中起关键作用。胱天蛋白酶-3是由一系列信号转导级联的激活。Bcl-2家族成员在调节细胞凋亡信号中发挥重要作用。Bcl-2家族成员被分成两个小组。第一组是抗凋亡蛋白，如Bcl-2和Bcl-X。第二组促进细胞凋亡Bax蛋白包括和Bak [17］.P53控制着许多参与细胞凋亡的基因的表达。P53参与细胞凋亡的内在和外在途径。它诱导Bax和Bid等几种蛋白质的转录，这被称为转录依赖性凋亡途径[18］.心肌缺血损伤触发TNF-α.从心肌细胞中释放。分泌肿瘤坏死因子-α.进一步刺激浸润的白细胞和内皮细胞释放促炎细胞因子，引发细胞因子级联[19，20.］.肿瘤坏死因子-α.和il - 1β有贡献者心功能不全。本研究揭示了与人参皂苷Rg3该治疗显著抑制P53和Bax，和裂解的胱天蛋白酶-3和Bcl-2的心肌I / R诱导的降低的增加而增加。它表明，人参皂甙Rg3也阻断TNF-α的增加α.和il - 1β在心肌I / R-RAT。因此，这些发现表明人参皂苷RG3的药理作用机制与其抗痘病和抗炎的性质有关。

本研究存在局限性。虽然凋亡被认为是一种非炎症的细胞死亡模式，但最近的研究提供了证据，凋亡细胞总是非炎症的，特别是在TNF家族成员诱导的凋亡背景下。细胞凋亡也与死亡细胞产生一系列促炎细胞因子和趋化因子有关[21］.但本研究未阐明人参皂苷Rg3抗凋亡和抗炎作用之间是否存在相关性。需要进一步的研究来证实这一重要问题。

5.结论

综上所述，本研究结果表明，人参皂苷Rg3具有改善心肌I/ r所致心功能损害的作用，其药理作用机制与人参皂苷抗凋亡、抗炎性质有关。因此，人参皂苷在有心力衰竭危险的心肌梗死患者中的可能治疗应用值得研究。

相互竞争的利益

作者报告说，他们没有利益冲突。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（授予了81473378）和吉林大学诺曼·贝斯纳卫生科学中心的优秀博士培养方案（2014年）。

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