CY-09抑制NLRP3 Inflammasome激活通过TRPA1减轻疼痛

文摘

外周组织损伤会导致炎症性疼痛,和炎性细胞因子释放的关键因素是诱发痛觉受器的敏感。钙离子通道,TRPA1在疼痛和炎症中起着重要的作用,因而成为一种新型的抗炎、镇痛的目标。然而,没有共识这个通道的作用在机械痛觉过敏引起的炎症。在这里,我们的目标是探索inflammasome抑制剂的作用和基本机制CY-09在两个经典的炎性疼痛模型。我们评估疼痛行为在动物模型,细胞因子水平,细胞内的钙^{2 +}水平,瞬时表达TRPA1, NF -κB转录,NLPR3 inflammasome激活。一致,CY-09减少炎性细胞因子的生产,细胞内Ca^{2 +}水平,TRPA1的激活通过抑制inflammasomes的激活,从而减少巨噬细胞的促炎的极化和减轻动物的痛苦和伤害。重要的是,AITC (TRPA1受体激动剂)显著逆转CY-09的镇痛效果,表明TRPA1参与CY-09的镇痛效果。我们的研究结果表明,通过抑制TRPA1-mediated CY-09减轻炎症和疼痛激活NLRP3 inflammasomes。因此,NLRP3 inflammasome可能是一个潜在的治疗目标为治疗疼痛和CY-09可能是药理剂来缓解炎性疼痛,这需要进一步的研究。

1。介绍

疼痛是一种不愉快的情感和感官体验造成组织损伤。目前,有三种模式的痛苦:病理性疼痛,疼痛的痛苦和炎性疼痛(1,2]。炎性疼痛主要是由于细胞内离子积累和炎性介质分泌,如前列腺素、5 -羟色胺、缓激肽。炎性疼痛伴随着许多疾病,包括糖尿病、癌症、感染、自身免疫性疾病、化疗,和创伤。此外,大多数病人总是与精神症状,如焦虑、抑郁、失眠,严重影响生活质量(3- - - - - -6]。疼痛和抑郁加重对方。有些炎症,如关节炎,可引起中枢神经系统强调太多,导致中央灵敏度,然后导致慢性疼痛和情绪困扰恶化[7]。人们遭受疼痛和炎症更抑郁,导致自杀率增加,负担社会公共安全。因此,寻找特异性靶分子和发展有效的,安全的,low-tolerated止痛药在疼痛治疗研究成为一个热点。

瞬时受体电位锚蛋白1 (TRPA1)是一个calcium-permeable阳离子通道,属于TRP通道总科(8]。TRPA1广泛表现在神经系统、消化系统、呼吸系统,神经兴奋性的规定和各种器官的功能。TRPA1通道在疼痛和炎症中起着重要的作用,成为一种新型的抗炎、镇痛目标(9,10]。不同的受体激动剂可以调节人体的生理功能或引起病理损伤移植TRPA1通道的功能。在缺乏TRPA1、热痛觉过敏消失后管理完全弗氏佐剂(CFA)或小鼠角叉菜胶;TRPA1基因敲除小鼠有限组织学的变化模式11- - - - - -13]。

许多研究人员发现,il - 1β和地震过程中分泌炎性疼痛和促进NLRP3 inflammasome组装(14,15]。激活NLRP3和ASC形成一个支架来刺激procaspase-1和促进pro-IL-1的水解β和pro-IL-18。迄今为止,几项研究表明NLRP3 inflammasome充当“中继站”痛苦的过程(16]。例如,CCI老鼠疼痛模型中,吗啡治疗导致p38磷酸化和NLRP3激活导致持续疼痛的刺激17]。电针刺激(EA)可以抑制激活NLRP3 inflammasome缓解炎性疼痛(18]。尽管一些研究报道NLRP3 inflammasomes涉及炎性疼痛,它的下游分子机制和其抑制剂是否可以作为治疗疼痛仍不明朗。

CY-09 NLRP3抑制剂,通过绑定到其纳赫特域抑制腺苷三磷酸酶活性(19]。CY-09有效抑制il - 1β生产和单钠尿酸盐的大量中性粒细胞(MSU) injection-induced痛风模型,表明CY-09起着至关重要的作用在阻止NLRP3 inflammasome激活体内。CY-09治疗也可以抑制经典之中NLRP3细胞质LPS激活诱导的BMDM [19]。尽管CY-09被用于一些疼痛模型,机制尚不清楚。

在我们的研究中,基于假设CY-09可以抑制NLRP3 inflammasome形成和减少TRPA1通道激活减轻炎性疼痛,我们发现抑制TRPA1-mediated激活NLRP3 inflammasomes有关CY-09在炎性疼痛的镇痛效果。

2。材料和方法

2.1。动物

C57 / BL6小鼠(6 - 8周,22 g)购买的第二军医大学实验动物中心和驯化实验前1周(生产许可证。SCXK(胡)2012 - 0003)。动物保健设施被批准的动物保健和使用委员会长征医院,跟着导游。

2.2。热撤出延迟测试

老鼠放在热板,热刺激老鼠的脚疼痛反应。老鼠舔脚的时间作为指标的疼痛反应,确定药物镇痛效果。我们首先选择了正常小鼠疼痛反应在30年代,把鼠标放在一个 热板装置,并使用鼠标作为一个观察的hindfoot指数来确定小鼠的痛阈。测量每5分钟执行两次。

2.3。爪子舔时间测试

老鼠注射LPS或福尔马林茎,然后对待CY-09通过胃内的管理。爪子舔时间后被蒙蔽的方式测量有限合伙人或福尔马林的挑战。观察每组的老鼠,数了数舔时间在60分钟。

2.4。实时定量聚合酶链反应

RNA提取工具包(试剂盒、德国)介绍了孤立从脚组织总RNA。逆转录数组后,实时定量PCR进行使用SYBR绿色PCR主结构,分析了光周期计480(罗氏公司、德国)。表达式是使用特定的引物进行了测试。il - 6意义上底漆是5 - - - - - -TAAGCCTCCGACTTGTGAAGTGGT-3 ,反义底漆是5 - - - - - -ATCCAGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3 ;的il - 1β意义上底漆是5 - - - - - -CAGGCAGGCAGTATCACTCA-3 ,反义底漆是5 - - - - - -AGCTCATATGGGTCCGACAG-3 ;肿瘤坏死因子-α意义上底漆是5 - - - - - -CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3 ,反义底漆是5 - - - - - -TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC-3 ;NLRP3意义上底漆是5 - - - - - -ATGCTGCTTCGACATCTCCT-3 ,反义底漆是5 - - - - - -AACCAATGCGAGATCCTGAC-3 ;caspase-1意义上底漆是5 - - - - - -CACAGCTCTGGAGATGGTGA-3 ,反义底漆是5 - - - - - -TCTTTCAAGCTTGGGCACTT-3 ;NF -κB底漆是5 - - - - - -CTCCCTGACAAGCCTGCTAC-3 ,反义底漆是5 - - - - - -TCTTCCTTCAGCGTCTGGAT-3 ;TRPA1意义上底漆是5 - - - - - -CTACTGGCTTTTGGCCTCAG-3 ,反义底漆是5 - - - - - -CCAAAGGTCAGGACTGGGTA-3 ;GAPDH意义上底漆是5 - - - - - -CCGCATCTTCTTGTGCAGT-3 ,反义底漆是5 - - - - - -GGCAACAATCTCCACTTTGC-3 。

2.5。Ca^{2 +}浓度检测

细胞内钙的^{2 +}浓度均质和离心机的组织样本测定使用BioVision工具包。然后,吸光度测量通过标在575海里。

2.6。西方墨点法

组织收集和里帕细胞溶解。蛋白质浓度检测后,蛋白质样本加载和膜与初级抗体TRPA1孵化(pa1 - 29421,英杰公司)和GAPDH (ab181602 Abcam)。

2.7。流式细胞术

老鼠脚组织收割,碎成小块,然后用胶原酶消化二世和dispase II(美国密苏里州Sigma-Aldrich) PBS为30分钟37°C。细胞悬液的过滤、离心、resuspended,阻塞CD16/32抗体。然后,主要抗体的细胞被染色流式细胞仪缓冲30分钟在黑暗中在4°C。流式细胞术分析在BD流式细胞仪石中剑使用6天后软件(BD生物科学,圣何塞、钙、美国)。结果分析了使用FlowJo软件V10.2(美国或TreeStar)。

2.8。统计分析

8.0数据分析使用GraphPad棱镜。所有数据了 。所有的实验都重复三次。比较组是使用一个未配对的学生执行 - - - - - -测试。 , ,和 显示统计学意义。

3所示。结果

3.1。CY-09缓解炎性疼痛和减少生产由有限合伙人或福尔马林诱发小鼠细胞因子

CY-09-pretreated小鼠接受有限合伙人或福尔马林,和两个不同的模型被用来诱导炎性疼痛。与formalin-induced炎症相比,有限合伙人是缓慢和持续时间。疼痛的程度是由热板和脚舔时间评估。注射后,老鼠疼痛行为明显和脚组织变得肿胀。5毫克/公斤CY-09明显抑制LPS引起的热痛觉过敏在5 h(图1(一)1 h(图)和福尔马林1 (b)),分别。此外,CY-09显著抑制疼痛,其镇痛的行为始终存在在60分钟。

白细胞浓缩在炎性疼痛发生和修复受损的组织。炎性细胞因子的生产是在炎症性疼痛的过程中一个重要指标。我们进一步评估炎性因子的表达通过RT-qPCR足底组织。我们第一次发现il - 6和TNF -α在急性炎症的过程中,两个指标。数据显示CY-09可以缓解炎性细胞因子释放(数字1 (c)和1 (d))。然后,我们测试了il - 1β表达水平。结果表明,细胞外分泌il - 1的水平β是调节在LPS诱导的两个模型和福尔马林,但后来,它被CY-09抑制(数据吗1 (c)和1 (d))。因此,CY-09缓解疼痛,减少炎症的水平。

3.2。CY-09抑制NF -κB转录和NLPR3 Inflammasome活化,减少巨噬细胞M1极化

探索的底层机制CY-09 antinociceptive效果,我们对经典的炎症通路的激活NF -κB和inflammasome通路。rt - pcr数据表明CY-09减少NLPR3, ASC, caspase-1表达式在有限合伙人或formalin-induced老鼠(数字2(一个)和2 (b))。此外,CY-09显著抑制核NF -κB (p65)转录(数字2(一个)和2 (b))。接下来,我们研究巨噬细胞激活的NLRP3脚组织招募。我们使用CD45和F4/80两个指标来区分白血细胞的总量和定义伊诺+ M1极化和CD206 + M2极化。与:组相比,M1的比例下降,M2标记增加(图2 (c))。这些发现表明CY-09应用减少巨噬细胞M1极化并削弱了促炎因子的分泌。

3.3。CY-09抑制TRPA1表达式在活的有机体内

据报道,TRPA1通道的激活参与NLPR3 inflammasome,我们假设CY-09可以调节TRPA1的表达。有限合伙人管理后,表达TRPA1的拦路强盗组织显著调节。然而,CY-09显著降低TRPA1表达式(数字3(一个)和3 (b))。TRPA1是一个钙离子通道。我们进一步评估组织中的钙离子水平。与单一注射LPS组相比,CY-09治疗显著降低细胞内钙^{2 +}浓度(图3 (c))。formalin-treated模型中,我们也发现类似的结果LPS-treated模型(数据3 (d)- - - - - -3 (f))。

3.4。TRPA1 CY-09 Antinociceptive效应

TRPA1以来可能是细胞内钙高程的主要原因,AITC TRPA1受体激动剂和抑制剂HC030031被用来进一步评估。AITC CY-09的抑制作用降低LPS-induced热痛觉过敏和舔,尽管老鼠AITC单独处理(数据没有明显的影响4(一)- - - - - -4 (c))。如图5,AITC特定受体激动剂显著增强的表达TRPA1(图5 (b))。此外,AITC逆转CY-09在抑制细胞内钙的活性^{2 +}水平和il - 1β和肿瘤坏死因子-α生产(数据5(一个)和5 (c))。最后,NLPR3 inflammasome激活也被评估。结果表明,AITC可以逆转减少细胞质和NLPR3激活引起CY-09(图5 (d))。

4所示。讨论

直接注射福尔马林或有限合伙人爪子的鼠标是一种常见的炎症性疼痛模型。福尔马林模型主要代表了自发痛行为和过敏症的机械和热刺激20.]。有限合伙人,革兰氏阴性细菌的主要因素,结合影响受体和触发一个细胞内的信号级联,随后产生炎性细胞因子,导致中性粒细胞和巨噬细胞招聘14,21]。在这项研究中,我们使用两种不同的动物模型。发现有典型特征的炎性疼痛模型,包括痛觉过敏,爪子水肿和巨噬细胞浸润。我们发现,NF -κB转录的激活有积极的监管作用NLRP3 / ASC / procaspase-1 / pro-IL-1β。在刺激下,有限合伙人或福尔马林增强NF -κB (p65)磷酸化和促进了NLRP3的组装/ ASC / procaspase-1 inflammasomes,导致caspase-1和il - 1的乳沟β分泌。il - 1β进一步成熟和极化巨噬细胞分泌促炎模式M1。

越来越多的证据表明,NLRP3 inflammasome参与炎性疼痛。NLRP3 inflammasome激活,ASC迅速从细胞核,细胞质中分配和参与caspase-1前兆的激活15,22,23]。不管CCI、SCI或SNL-induced小鼠模型,NLRP3, caspase-1, ASC表达式不仅增加外围背根神经节神经元也表达了在小胶质细胞和星形胶质细胞24,25]。然而,也有相互矛盾的结果。研究表明,NLRP3 inflammasome和il - 1β不参与疼痛的发生模式26]。我们推测,NLRP3 inflammasomes可能扮演不同的角色在个人疼痛模型,需要进一步确认。自从NLRP3在痛苦中扮演着重要角色,NLRP3可能是一个潜在的治疗目标。因此,它是特别重要的确认NLRP3激活机制和功能在不同的疼痛模型。在我们的工作中,除了inflammasomes的激活,促进分泌的促炎因子,激活巨噬细胞,我们也发现细胞内Ca^{2 +}浓度的增加组织。

细胞内钙的高程^{2 +}水平是由于钙的释放^{2 +}存储从内质网(27]。我们专注于钙通道TRPA1。TRPA1 Ca是一个^{2 +}透水阳离子通道。伤害感受器,它一直被认为是治疗疼痛的一个重要目标。研究发现,突变N855S位于TRPA1 S4的跨膜结构可能导致家族性疼痛综合征,这是第一个离子通道疾病疼痛反应(28]。各种外生TRPA1受体激动剂能引起人体的神经递质释放,炎症和疼痛,如AITC、福尔马林、肉桂醛。内源性TRPA1受体激动剂也能导致在DRG神经元钙流入和疼痛反应剂量依赖性的方式(8,29日,30.]。我们的结果表明,激活NLRP3 inflammasomes LPS诱导的相关表达TRPA1的增加,和TRPA1 CY-09的目标,表明TRPA1-mediated NLRP3 inflammasomes的激活可能参与CY-09对炎性疼痛的止痛剂的影响。

inflammasomes作为抑制剂,据报道CY-09镇痛活性和抵抗炎症性疼痛(19]。值得注意的是,CY-09可以减轻炎症引起的痛觉过敏有限合伙人或福尔马林。CY-09还显示激活的抑制能力NLRP3 inflammasomes和招募巨噬细胞。此外,消除影响AITC(特殊TRPA1受体激动剂)CY-09进一步证实TRPA1参与炎性疼痛。TRPA1受体激动剂的存在,在NF - CY-09治疗的抑制作用κB (p65)转录不能逆转,表明其他信号转导途径或机制可能参与镇痛CY-09的过程。然而,两者之间的上游和下游的关系TRPA1和CY-09仍然相互反馈,需要进一步挖掘。

综上所述,我们的研究结果揭示CY-09缓解炎性疼痛在老鼠模型中,部分相关的规定NF -κB转录,NLRP3 inflammasome形成,TRPA1 / Ca^{2 +}动员。因此,NLRP3 inflammasome可能是一个潜在的治疗目标为治疗疼痛和CY-09可能是一种镇痛候选人,值得进一步研究。这项研究提供了重要的实验基础研究NLRP3是一个潜在的治疗目标是否疼痛治疗和CY-09是否可以用作药物药物来缓解炎性疼痛。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以在请求从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

r和H.Y.构思和设计研究。Y.F.,G.X., and Q.C. performed the experiments. Y.F., G.X., and Q.C. analyzed the data. Y.F., G.X., and Y.L. contributed to animal feeding and treatment. R.D. and H.Y. wrote the draft manuscript. All authors revised the final submission. Youjia Fan, Gaici Xue, and Qianbo Chen contributed equally to this work.

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金资助(81971046和81971046)。

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