文摘

背景。本研究的目的是探讨hesperadin在脑出血(我)小鼠,与哺乳动物的参与ste20-like激酶4 (MST4) / AKT信号通路。方法。所有小鼠被分为四组:虚假的集团,假+橘皮苷组,我组和我+ hesperadin组。hesperadin的影响进行评估的基础上脑水肿和神经行为功能。AKT,此外,我们观察到MST4一种蛋白激酶的磷酸化(pAKT)和microtubule-associated蛋白轻链3 (LC3)免疫印迹。蛋白质的本地化MST4 LC3由免疫荧光。结果。MST4的表达调节在12 h和24 h后我。脑水肿明显下降和神经功能改善hesperadin治疗组相比,我集团( )。Hesperadin增加MST的表达式和减少pAKT我之后。自噬在我组显著增加,而hesperadin减少增加。结论。Hesperadin提供神经保护对我通过抑制MST4 / AKT信号通路。

1。介绍

脑出血(我)作为中风亚型与严重神经赤字和高死亡率(1- - - - - -3]。目前,仍有我后缺乏有效的治疗脑损伤。自噬溶酶体降解途径,是主要的细胞胞质细胞器退化和长寿的过程,错误折叠,或损坏的蛋白质(4]。作为一种重要的细胞死亡机制,后神经元自噬是关心我(5- - - - - -7]。

哺乳动物ste20-like激酶4 (MST4) GCKIII的激酶家族的一员,在大脑中高度表达,胎盘,胸腺和外周血白细胞(8,9]。这三个亚科的成员包括STK25 MST3, MST4 [10]。MST4由416个氨基酸组成的分子量46 kDa位于染色体Xq26 [9]。熊等人报道,MST4激酶调节垂体细胞的增殖和生存通过p38 MAPK和一种蛋白激酶信号级联11]。AKT,多样的丝氨酸/苏氨酸激酶扮演一个关键的角色在促进细胞存活,据报道是一个下游的目标MST4 [12]。黄等人建议MST4介导LC3在自噬通路的表达13]。microtubule-associated蛋白轻链的存在3 (LC3)自噬小体和LC3-II标记的自噬的变换14]。Hesperadin报道是极光激酶B的ATP竞争性抑制剂,抑制细胞增殖减少Aurora B活动(15]。海拉细胞被hesperadin表示校准和分离的缺陷,而姐妹染色单体分离是完整的16]。Hesperadin抑制的临床孤立各种甲型和乙型流感病毒(17]。最近,熊等人表示,hesperadin是一种有效和选择性抑制剂MST4激酶(12]。随着勘探我后的脑损伤机制,防止脑损伤和促进神经元存活已经成为治疗的目标。本研究旨在探讨是否MST4-specific抑制剂hesperadin改善神经功能通过抑制MST4-mediated自噬通路。

2。材料和方法

2.1。动物

雄性C57BL / 6小鼠(7 - 8周大)从青龙山农场购买(中国南京)。所有老鼠关在单独的笼子里,免费获取标准实验室饲料和水。在这项研究中使用的所有程序符合国家卫生研究院实验室动物保健和使用指南,并经伦理委员会批准使用在皖南医学院实验动物。

2.2。我的模型

诱导脑出血模型的注射胶原酶IV一直在前面描述的18]。小鼠腹腔内注射麻醉的400毫克/公斤水合氯醛和定位立体定位器(Yuyan YAN-1仪器类型、上海、中国)。实验我感应到基底神经节sterically直接注入IV型胶原酶(500年0.075个单位μl PBS)。基底神经节的位置是2.0毫米的中线,前囱前,0.8毫米和3.5毫米腹侧的皮质表面。微量试样注入超过五分钟,针是留给另一个5分钟。骨蜡用于密封毛刺并关闭伤口。虚假的老鼠注射50μl 0.9%无菌生理盐水以同样的方式,而非自体血。老鼠维持在 加热灯。老鼠在对照组治疗。Sham-operated老鼠经历同样的过程,用无菌生理盐水代替IV型胶原酶。

2.3。实验的程序

实验进行了如下(图1)。在这项研究中,老鼠被随机分配到下面的两个独立的实验。实验由两名实验者都是盲目的实验设计。

2.3.1。实验1

定义MST4的时间进程,pAKT AKT,和LC3我后,小鼠随机分为5组:骗局,我6 h,我12 h,我24小时,我72 h ( )。我们比较MST4的表达,一种蛋白激酶,pAKT, LC3在不同群体免疫印迹( )和神经系统评估测试(包括加西亚测试和角落 )。总共30老鼠用于实验1。

2.3.2。实验2

为了检测MST4活动是否参与了一种蛋白激酶,LC3-related自噬通路和MST4是否影响认知在老鼠脑内出血后,我们比较小鼠接受hesperadin(美国hy - 12054 MedChemExpress)参与老鼠。我之前Hesperadin脑室注射1 h。实验1的结果显示,脑出血后12小时确定时间点。小鼠随机分为四组:虚假的集团,假+ hesperadin集团,我集团和我+ hesperadin集团( 在每组)。在每一组中,老鼠被选随机免疫印迹( ),免疫荧光( ),和脑水肿( )。共有52个老鼠用于实验2,和所有在四组老鼠进行安乐死之前的行为。

2.4。药品监督管理局

Hesperadin (MCE, hy - 12054, 0.5μ克/μl)溶解在1% DMSO和通过intracerebroventricular (i.c.v)注射前1小时我(2μl /鼠标)。成立一个小洞在左边的前囟门在1.0毫米,和一个没有。27汉密尔顿针是降低2.3毫米的深度和hesperadin注射0.67μl / min。

2.5。加西亚测试

加西亚Neuroscore评估动物感官通过七个测试电机性能,包括(1)自发运动,(2)一边抚摸,(3)振动本体感受,(4)肢体对称性,(5)侧旋转,(6)前肢走路,,(7)攀升。结果是盲目地12小时后收集的,如前所述[19]。

2.6。角落转测试

老鼠被允许进入一个角落30度角。老鼠的方向将被记录,包括左右当老鼠退出角落。这是重复10次在测试房间,至少30秒计算右转。仅包括完全长大变成无论是墙(即。,腹侧折叠或水平除外)。

2.7。脑水肿

确定脑水肿,老鼠牺牲深度麻醉后,在我12 h后斩首。大脑分为五个部分,包括对侧皮层(cont-cx)的基底神经节(cont-bg),侧皮层(ipsi-cx),基底神经节(ipsi-bg)和小脑。干和湿重法计算脑水肿。

2.8。免疫印迹分析

老鼠被斩首时每个实验过程,和右大脑半球分离和均质里帕缓冲区(Servicebio,武汉,中国)。西方墨点法进行如前所述[20.]。主要包括抗体anti-MST4(1: 1000年,Proteintech) anti-AKT(1: 1000年,细胞信号技术),anti-pAKT(1: 1000年,细胞信号技术),anti-LC3A / B(1: 1000年,细胞信号技术),和β肌动蛋白(1:1000年,细胞信号技术)。

2.9。免疫荧光

免疫荧光对大脑进行石蜡切片(如前所述)(20.]。我在12小时后,深深麻醉小鼠灌注冷PBS然后充满4%的多聚甲醛。大脑被浸泡在福尔马林溶液在4°C隔夜后去除,然后用30%蔗糖脱水在PBS。冠状切片在低温恒温器和分段进行免疫荧光分析。脱脂和补液后,日冕部分被孵化EDTA抗原再生缓冲区,冲洗5%正常山羊血清,和阻塞。在一个免疫荧光标记部分,日冕部分被孵化主要抗体在4°C一夜之间,包括兔子anti-MST4(1: 100年,Proteintech)和兔anti-LC3A / B(1: 100年,细胞信号技术),然后用anti-rabbit免疫球蛋白:CY3和anti-rabbit免疫球蛋白:分别FITC。在双重免疫荧光标记部分,封锁了部分被孵化与LC3A / B抗体过夜,然后HRP-labeled二级抗体。冲洗后,部分被孵化anti-rabbit免疫球蛋白:CY3 10分钟,然后用EDTA抗原再生缓冲区。相同的部分被孵化MST4抗体在一夜之间,然后用HRP-labeled二级抗体。所有的部分终于暴露DAPI (Servicebio,武汉,中国)显示核的变化。

2.10。统计分析

所有数据都表示为 。GraphPad棱镜6用于统计分析。单向方差分析是用来分析结果从不同的群体,和意义是表示值< 0.05。

3所示。结果

3.1。MST4的时间进程,AKT、pAKT和LC3表达和神经功能我老鼠

我们确定的时间表达MST4蛋白质和autophagy-associated包括一种蛋白激酶,pAKT, LC3在不同的时间后我(图2(一个))。MST4表达明显达到12 h后我(图2 (b), )。一种蛋白激酶的表达没有明显变化,而pAKT表达下降(数字2 (c)和2 (d), )。自噬标记LC3越来越表示在12 h后我(图2 (e), )。神经系统评分结果显示,神经功能恶化在12 h, 24小时,72小时后我(数据3(一个)和3 (b), )。

3.2。Hesperadin逆转ICH-Induced自噬激活

根据实验结果1,时间点我组和hesperadin脑出血的治疗组设置为12小时。MST4 pAKT, AKT, LC3显示不同实验2(图的变化4(一))。MST4明显降低(图的表达4 (b), )。相反,pAKT增加hesperadin治疗组相比,我组(图4 (c), )。AKT显示(图并没有显著变化4 (d), ),虽然LC3减少hesperadin组相比我组(图4 (e), )。pAKT MST4的表达,一种蛋白激酶,LC3显示虚假的组之间没有显著差异,假+橘皮苷组(图4, )。上述结果表明,橘皮苷能阻断自噬通过抑制MST4 AKT相关蛋白质通道。免疫荧光染色显示hesperadin减少ICH-induced upregulation LC3 MST4和自噬的标志。MST4荧光位于细胞质中,主要是在原子核周围。hesperadin组,MST4我组相比显著降低。同样,LC3表达与MST4(图5)。虚假的组MST4 LC3显示较弱的荧光强度和点状分布,当他们与原子核周围和我组。hesperadin预处理、MST4和LC3染色明显减少和不重叠的(图6)。

3.3。Hesperadin降低脑水肿和提高Neurobehavior在12小时后我

我+ hesperadin组显示显著降低脑水肿侧基底神经节相比我组;此外,没有发现意义之间大脑的其他部分(图组7(一), )。Hesperadin治疗我的老鼠明显改善神经赤字相比对照组(数字7 (b)和7 (c), )。脑水含量没有显著差异和行为功能之间的虚假的组和假+橘皮苷组(图7, )。

4所示。讨论

尽管我病理学研究,有效的神经保护治疗仍然是有限的(21,22]。与我相关的病理机制是复杂的,涉及到不同的细胞信号通路,导致神经元死亡和细胞应激损伤。据报道,自噬途径激活后神经元中发现我(6]。越来越多的证据表明,自噬的作用在我病理学是至关重要的23]。MST4扮演多个角色,拥有许多特异性功能。在乳腺癌细胞[MST4显示proapoptotic效果24]。此外,MST4可能调节细胞迁移在海拉细胞25]。据报道,MST4参与自噬,导致增强的自噬流量(13]。

本研究的首要目标是阐明MST4表达我的变化和影响。尽管MST4显然是大脑中的表达,表达和病理改变的作用还不清楚,尤其是心脑血管疾病。我们的研究表明,MST4广泛表达于健康的大脑,而增加,达到一个峰值在12 h跟着我。AKT我后没有明显变化,而pAKT表达降低,达到底部我后6 h和72 h。自噬的表达标记LC3在我12 h后达到顶峰。因此,它表明我可以直接激活自噬和移植MST4表达式。因此,我12 h后的时间点是用相应的机制用于后续实验。因此我的老鼠表现出不同程度的功能障碍。另外,可能是由于反馈的响应差别pAKT对这些MST4通过一种蛋白激酶磷酸化的影响。这些观察表明MST4可能参与控制自噬我的老鼠。

我们的第二个目标是调查是否小说MST4抑制剂hesperadin,以前认为是极光激酶抑制剂,能有效地抑制MST4的表达。基底节出血是导致脑水肿和神经赤字(26]。我们确认我老鼠hesperadin政府大大提高了水肿,缓解神经赤字在12 h后我相比我组。MST4表达我的老鼠接受hesperadin明显低于我的老鼠,这证明了潜在的hesperadin MST4抑制剂。我们发现hesperadin是神经,改善脑水肿和行为赤字在老鼠实验我后。在这项研究中,hesperadin确认显示神经保护作用,可以改善我的老鼠的脑水肿和neurofunction赤字。

最后,我们研究了MST4的调节作用在神经损伤自噬及其意义。为了进一步证明我们的假设,我们通过政府抑制MST4 hesperadin。它已经表明MST4抑制会减少一种蛋白激酶磷酸化,从而减少自噬小体的形成LC3-II。一种蛋白激酶的激活/ LC3在自噬过程中,脑水肿和神经赤字相应提高。免疫印迹分析MST4在12小时后我虚假的组相比有显著提高;此外,减少hesperadin-treated组,这证实了我们的假设,hesperadin抑制自噬由我造成的。我们已经发现,MST4表达式与LC3并行相关,和MST4周围出血的差别可能的解释是,对这些可能保护细胞通过促进一种蛋白激酶磷酸化,然后抑制自噬小体的形成。MST4之间的关系和LC3尚未报道,而且可能有潜在关系MST4和自噬。我们的实验证明MST4和自噬:之间的潜在关系的表达MST4影响自噬的发生。这将带来一个新的视角来探索autophagy-related通路在接下来的探索。

根据这项研究,我们得出结论,hesperadin可能是一个神经保护因子,减轻血肿周围神经细胞自噬,以及显著地提高神经系统。它可能提供一个新的方法,探索潜在的分子和细胞机制MST4和AKT之间我后,以及一个特殊的目标治疗我。然而,我们的研究中存在的一些局限性。首先,MST4之间的直接关系,我没有研究,我的详细和准确的机制影响MST4表达还有待探索。第二,我们只关注我之后MST4对自噬的影响。此外,我们的研究只有测试报告的推荐剂量和只有一个时间点选择的机制研究。我们将进一步研究在我hesperadin保护脑损伤机制。

总之,hesperadin变弱自噬通过MST4 / AKT通路在脑出血的老鼠,它可能会提供新的治疗ICH-induced自噬的观点。治疗目标限制脑损伤或自噬促进复苏后我仍然需要进一步的研究。

数据可用性

数据分析了在目前的研究可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

吴小东和吴Jinting同样这项工作。

确认

这项研究是由中国国家自然科学基金(81701161)、科研基金项目人才引进Yijishan医院,皖南医学院、安徽、中国(YR201802),和“峰值”培训项目科研Yijishan医院、皖南医学院(KGF2019G02)。