后期异位骨化的分子机制的生物信息学分析

抽象

背景. 异位骨化（HO）是软组织损伤后常见的疾病。本研究利用生物资讯学的方法，分析小鼠烧伤/肌腱切开诱导的HO模型中的HO样本，以确定可能的关键点和治疗目标。方法. GSE126118的转录组图谱来自基因表达综合数据库（GEO）。本研究以小鼠烧伤/肌腱切断术诱导的HO模型为基础，于伤后3周采集2个肌腱切断标本和3个未损伤的对侧后肢肌腱标本进行进一步分析。每百万个转录本进行背景校正和标准化；然后，使用limma R包和设置检测差异表达基因（DEGs） 和 。基因本体论（GO），京都基因与基因组百科（KEGG）途径富集，和蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络分析，与所检测的DEGS进行。结果. 肌腱切断组与未损伤组共有74例DEGs上调，159例DEGs下调。途径和过程富集分析表明，上调的DEGs主要与ECM重塑、骨化、血管生成、炎症等有关，下调的DEGs主要与氧化磷酸化、代谢过程等有关。结论. GO、KEGG和PPI网络分析结果表明，肌腱切断处的ECM重塑、骨化、血管生成和炎症过程明显上调。氧化磷酸化和代谢过程明显下调。这些发现为揭示晚期HO的特点和探讨可能的治疗方法提供了有价值的线索。

一。介绍

异位骨化（HO）是一种常见的疾病发生在软组织损伤后[1]. 获得性和遗传性HO病例已被广泛讨论，尚未开发出有效的治疗方法。与遗传性HO的低发病率不同，由于损伤和组织修复失败，获得性HO的发病率更高。获得性HO多发生在局部或全身损伤/炎症后，如骨科手术、烧伤、脑/脊髓损伤、损伤，甚至免疫相关疾病。几乎所有获得性HO都是通过软骨内骨化形成的，这是一种生物学过程，通常见于骨发育和骨折愈合。异位软骨内骨化过程在间充质基质细胞（MSC）募集、软骨分化和最终骨化形成后，引发损伤/炎症[2]。为了防止HO，软骨细胞分化过程的抑制是最重要的考虑促进再生和抑制骨化之间的平衡;然而，用于治疗晚期HO，临界点可以是骨生成和促进吸收骨化的抑制。不幸的，既不阻止也不治疗方法HO已经实现有效呢。在晚期HO，各种生物过程中涉及，包括炎性疾病，软骨，成骨，血管生成，矿化，和骨的吸收。用于治疗晚期HO的策略已经与各种生物过程中得到了广泛的研究。例如，低剂量辐射已被广泛用于在与杀软骨和成骨细胞的能力[HO处理3，4]. 消炎药环氧合酶-2抑制剂除了能抑制引发骨髓间充质干细胞凋亡的炎症外，还能抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化[五，6]. 同样，BMP途径抑制剂和RARγ激动剂也能减少软骨生成，从而减少异位软骨内骨化[7-11]. 但不幸的是，现在没有一种疗法足够有效。

本研究中使用的生物信息学的方法来分析在小鼠烧伤/割腱诱导HO模型中的HO的样品，以确定可能的关键点和治疗靶标。该HO样品和未受伤的肌腱对侧样品的具体而言，差异表达的基因（DEGS）通过通路和功能富集分析评价。然后将蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）网络使用这些DEGS构成。这些分析表明可能导致后期异位骨化多种分子机制。

2。方法

2.1条。数据源

从生物技术信息国家中心（NCBI）的基因表达综合数据库（GEO获得GSE126118的转录谱，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。GSE126118，其包括总共7个芯片，包括2米切断术的样品，3个未受损伤的对侧后肢肌腱样本，和2个正常腱样品，基于GPL13112 Illumina公司HiSeq 2000（小家鼠）的平台上。这项研究是基于对老鼠烧伤/切断术诱导HO模型，简单地说，一个部分厚度烫伤烧伤与跟腱中点横切切断术在一起。对于每一个组，都属于相同种类和批次，以及所有的外科手术将小鼠由同一人在同一时间进行。肌腱样品收集，和总RNA，损伤后3周隔离。

2.2条。数据预处理与微分表达式分析

采用百万分之转录本（TPM）方法对数据集的原始数据进行背景校正和标准化，然后使用limma R软件包检测差异表达基因（DEGs）。DGE是用设置定义的 和 基于Benjamini和Hochberg（BH）程序。然后将Ensembl转录本id转换成基因符号，如果不同的探针被注释到同一个基因上，则平均值作为基因的表达水平。热图也是由在线工具Morpheus绘制的(https://software.broadinstitute.org/morpheus网站/）。

2.3条。途径与功能富集分析

元景观(http://metascape.org/gp/index.html)利用基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）进行路径富集分析。获得富集途径，以在功能水平上分析环境中的常见DEG 。

2.4条。PPI网络建设

的蛋白 - 蛋白相互作用（PPI）网络进行分析，并通过STRING可视化（https://string-db.org). 来自字符串数据库的网络数据显示了数据的组合，包括文本挖掘、邻域、共表达、共现、基因融合和实验。最低交互要求得分为中等可信（0.400）。

三。结果

3.1。数据预处理和DEG筛选

数据集GSE126118的表达式数据用TPM方法进行了规范化。分析肌腱切断组与未损伤对侧肌腱组的DEGs。共有74 DEGs被上调，159 DEGs被下调 -值<0.01和 。火山图被用来可视化确定的DEGs（图图1（a））。最后，基因表达值的热图与表示在割腱和未受伤的肌腱组之间基因表达的变化的彩色图案构建（图图1（b））。

3.2条。途径与功能富集分析

通路和过程富集分析用进行了以下的本体在Metascape来源：KEGG途径和GO生物学过程。在基因组的所有基因用作富集背景。使用条款 ， ，和 根据成员相似性收集并分组。更具体地说， -基于累计超几何分布计算值， -使用的Benjamini-Hochberg的过程来说明多重检验（Hochberg的和的Benjamini，1990）进行了计算值，κ评分被用作相似性执行所述富集的术语的分级聚类时度量，并与子树 被认为是一个集群。对于富集路径和过程项的层次聚类，选择聚类中最具统计意义的项进行聚类标注。我们发现上调的DEGs主要与ECM重塑、骨化、血管生成、炎症等相关2（甲）和2（b）），以及下调DEGS主要与氧化磷酸化，代谢过程，等等（图相关联的3（甲）和3（b））。

3.3。PPI网络分析

为了探索已鉴定蛋白质之间的PPI网络，使用STRING软件对已鉴定的DEGs进行了分析。未连接到任何类型网络的DEG被排除在外( ）（数字4）。

四。讨论

本研究旨在探讨晚期异位骨化的相关机制。使用来自基因表达综合数据库的GSE126118公共转录组数据进行分析。首先，对原始数据进行标准化，并对差异表达基因（DEGs）进行鉴定。接下来，京都基因和基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）分析被用于评估路径和DEGs。构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。共有74 DEGs上调，159 DEGs下调损伤与未损伤对侧肌腱。GO、KEGG和PPI网络分析结果表明，肌腱切断处的ECM重塑、骨化、血管生成和炎症过程明显上调。这些发现为揭示晚期HO的特点和探讨可能的治疗方法提供了有价值的线索。

该ECM重塑是重要的HO疾病，组织再生或软骨/成骨分化不管。肌腱组织主要由细胞外基质的[12]，占干重的70-80%，包括胶原蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖。I型胶原占总胶原的97-98%[13]，用少量的其他类型，如式II，III，IX，V和X胶原胶原一起。对于软骨或纤维软骨组织，ECM也是主要内容，其由糖胺聚糖，蛋白聚糖，胶原纤维，有时，弹性蛋白组成。不同于腱，II型胶原蛋白是大多数型胶原的软骨，连同聚集蛋白聚糖为主要蛋白多糖。对于骨组织，它是比较复杂的。骨组织是由不同类型的骨细胞的组成。成骨细胞和骨细胞参与的形成和骨矿化;破骨细胞参与骨组织的再吸收。骨由柔性基质（约30％）和结合的矿物质（约70％）的，骨基质是弹性的胶原纤维，也称为骨胶原组成的90〜95％，其余的是地面物质。HO的处理涉及从腱ECM的复杂转移到骨，并且该过程主要是触发并通过细胞的自肌腱细胞转移到软骨细胞，最后到成骨细胞维持，并且最重要的是，分化成软骨细胞主要有助于在ECM重塑。

软骨细胞的起源仍然不明朗。假设很多已经提出，并且干细胞的分化误认为负责。间充质干被招募到损伤部位，在微环境小生的影响，并最终分化为软骨细胞[14，15]。截至目前，没有结果已经得到了关于起源型祖细胞，包括组织驻地祖细胞，间充质干从循环招募细胞，血管内皮细胞，神经内膜和细胞[14-18]。对于肌腱骨化，组织居民祖细胞，即肌腱来源的干细胞，被认为是最重要的。在HO的后期，主要的生物过程是软骨内骨化，胎儿发育和骨折愈合过程中的必要过程。典型地，所述软骨模型已经形成在后期，它由软骨细胞的连续细胞分裂生长在长度。然后，骨化的第一个位点上的软骨细胞和成骨细胞的分化肥大发生。软骨细胞的增殖和成骨分化的抑制似乎是治疗晚期HO有用。低剂量的辐射可以杀死或诱导衰老到靶细胞，从而，减少了增殖和分化。和RAR的含义γ激动剂也能减少软骨生成，从而减少异位软骨内骨化[7-11]。同样，考虑到刺猬在成骨信令的重要性，使用HH信号传导抑制剂也已经被广泛地研究[19]。药物如三氧化二砷（ATO）和GANT58已经发现，以减少HO在逐步骨发育异常模型[19-21]。

血管生成在异位骨化病理中也很重要，包括重要的血管建模和重塑。早期HO血管生成明显，毛细血管数目最多。当软骨区形成时，血管数目明显减少，少量血管位于无血管软骨痂周围。但晚期HO可观察到大量大小不等的血管，当骨化成熟时，体积最大的血管较少。血管生成在HO中非常重要，具有免疫信号传导、生长因子、营养等能力。用小分子（TNP-470）或靶向生物（血管内皮生长因子受体2型[VEGFR2]阻断抗体）抑制血管生成可防止异位骨形成83%和77%，分别抑制软骨生成或肥大前增生，以及破骨细胞的募集和吸收几乎完全被抑制[22]。

炎症也很重要，在后期HO，虽然比早期弱得多。破骨细胞，免疫细胞之一，在异位骨重塑极其重要的[23]. 破骨细胞对骨的破坏增加导致HO骨形成增加。众所周知，免疫系统通过多种细胞对破骨细胞的形成有广泛的影响，进而影响HO的形成。消炎药在预防和减少HO各阶段的骨形成方面总是有用的。环氧合酶-2抑制剂除了能抑制炎症反应外，还能抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化[五，6]。

下调基因的富集主要集中在氧化磷酸化和代谢过程，这可能是由于组织间细胞类型不同所致。氧化磷酸化/代谢过程与HO关系的研究尚未见报道，有待进一步研究。

本研究利用生物信息学方法来确定晚期异位骨化可能的关键点。然而，本研究也存在一些局限性，一个局限性是样本量少，数据集少，这限制了结论的准确性。另一个限制是目前的研究未能确定一个确切的蛋白质/途径，主要是对HO的贡献。进一步的研究需要确定这些生物事件参与HO的分子机制。

五，结论

本研究利用生物资讯学的方法，分析小鼠烧伤/肌腱切开诱导的HO模型中的HO样本，以确定可能的关键点和治疗目标。共有74 DEGs上调，159 DEGs下调损伤与未损伤对侧肌腱。GO、KEGG和PPI网络分析结果表明，肌腱切断处的ECM重塑、骨化、血管生成和炎症过程明显上调。氧化磷酸化和代谢过程明显下调。这些发现为揭示晚期HO的特点和探讨可能的治疗方法提供了有价值的线索。

数据可用性

用于支持本研究结果的原始数据可从地理数据集（GSE126118）获得。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

董周和谭军设计了本研究。张强、张艳、颜美君、朱凯进行了数据分析和统计分析。张强撰写并修改了手稿。董周和谭军指导了本研究。所有作者都阅读并批准了最后的手稿。

致谢

这项研究是由晚期慢性脊髓损伤治疗HUC-MSCs的多中心临床研究资助（2017YFA0105404），上海浦东卫生局重点学科建设项目（PWZxk2017-08），国家自然科学青年项目中国（81601919），健康与常州市重大科技项目计划生育委员会（ZD201504）的基础上，和H级的医学人才培训项目（2016CZBJ033）。

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