文摘
白血病是儿童最常见的癌症之一,影响成年人的最常见的和致命的癌症。几种金属氧化物纳米颗粒、生物聚合物和植物化学物质被发现的目标肿瘤细胞选择性而造成低伤害健康细胞。现有的纳米粒子的合成方法中,生物合成纳米粒子使用植物化学物质已成为一个简单的,经济的,环保的策略。ZnO-TiO协同抗肿瘤的潜力2MOLT-4 -chitosan-farnesol纳米复合材料(nc)对白血病细胞研究在当前的研究中。合成了nc后,使用XRD表征进行了相同的,DLS, FESEM, TEM, PL谱和红外光谱。分析其抗癌活性,MOLT-4细胞培养在不同剂量的nc和治疗。细胞的生存能力在治疗由MTT试验检查。形态和核修改被双重染色观察。ROS和MMP的水平被DCFH-DA染色观察和rh - 123染料,分别。此外,半胱天冬酶3 8和9的水平被执行ELISA检测。XRD模式表现出nc的六角结构。DLS光谱,观察nc的水动力直径是126.2海里。静电ZnO-TiO之间的接口2-chitosan-farnesol nc红外光谱证实了。细胞生存能力的重大损失是剂量依赖性的趋势证实了nc的细胞毒性效应。ROS升高水平和MMP损耗建议通过内在途径凋亡和细胞死亡,证实了高半胱天冬酶3的表达,8,9标记。因此,结果表明,合成的nc对白血病细胞表现出显著的抗癌潜力,在癌症治疗可能有价值。这项研究的结果得出结论,这是一个新的方法修改ZnO-TiO的物理化学特性2-chitosan-farnesol复合材料提高性能和表现出协同抗癌性能在人类白血病癌细胞。
1。介绍
白血病是白细胞的癌症,血液中的免疫细胞增殖失控,脾脏和骨髓1]。根据病人的年龄和造血细胞谱系,它可以分为急性或慢性白血病(2]。辐射、干细胞移植和化疗药物是血液肿瘤的主要治疗策略3]。然而,因为这些疗法是强烈而造成一些不利影响免疫系统,寻找更安全、更有效的治疗方案是必要的。MOLT-4 T细胞系都彻底研究immunophenotypically和karyotypically识别一个不寻常的T细胞受体gamma-chain基因重排。MOLT-4细胞被发现表达CD1和CD5 immunophenotypic标记显示胸腺细胞特征(4]。
在过去的几年里,纳米技术已经发展成为一个强大的和创造性的研究领域,专注于从生物医学领域的纳米材料的使用,药物输送,医疗、基因传递,环境科学,等等5]。纳米颗粒(NPs)就业的疾病治疗,特别是癌症,提供了可能性,摧毁癌细胞,而分钟没有损害健康的细胞和组织。金属纳米粒子已被证明有一个有效的对各种癌症的影响。他们具有能力容易在体内分布,渗透细胞膜,并引发细胞毒性(6,7]。
氧化锌是一种有趣的无机化合物和特殊电气、化学和光学特征已经使用在许多不同的应用程序。此外,由于其抗真菌,抗菌,抗癌,药物输送,和抗糖尿病的能力,氧化锌NPs拥有巨大的可能性在生物应用中(8]。二氧化钛(TiO2),除了氧化锌,是一个可以使金属具有高表面积的生物相容性和介孔特征。大量研究nano-TiO的使用2色素增感太阳能电池,有机退化,葡萄糖传感器,特别是作为延迟的载体和药物管理局进行了持续9,10]。
合成不同大小和形状的多金属nc是有利的,因为他们比单本位制的纳米颗粒特异性而言,功能,结构稳定性10]。多金属NPs往往具有独特的或更高性能,当集成,而不是他们显示的元素(6]。此外,合并等生物高分子壳聚糖提供了额外的这些合成NPs特征,包括生物降解性、生物相容性、低免疫原性和无毒性(11,12]。一系列chitosan-based NPs一直用于tumor-targeted药应用程序(13,14]。
类异戊二烯是一个家族的植物化学物质,可能引发细胞凋亡以及活性氧积累,线粒体分裂,还存在大量的活性升高在一些癌症细胞类型(15]。类异戊二烯的一个例子是金合欢醇,15-carbon化合物,橙皮,草莓,洋甘菊,以及精油包括柠檬草、麝香,香茅油,玫瑰,妥鲁香胶,仙客来,香脂,块茎状的16,17]。
一些报告显示,法尼醇具有广泛的药理特性,如chemopreventative,抗氧化,抗焦虑药,止痛,抗炎,抑郁和神经保护操作18- - - - - -21]。这些属性使其用法治疗各种疾病如糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、高脂血症(22]。此外,chemoprotective行动研究在许多癌症类型包括乳腺肿瘤(23,24),肺癌25)、结肠癌癌(26)、口腔鳞状细胞癌(27)、白血病(28),胰腺腺癌(29日]。
检查ZnO-TiO的协同抗癌潜力2-chitosan-farnesol nc对人类的所有(MOLT-4)细胞是当前工作的主要目标。合成nc后,使用XRD表征进行了相同的,DLS、FESEM, TEM, PL、EDAX和红外光谱。分析其抗癌活性,人类所有(MOLT-4)细胞和不同剂量的nc种植和管理。治疗后,细胞的生存能力是通过MTT试验研究。AO / EtBr染色显示形态和核的变化。活性氧的水平和MMP的测定使用DCFH-DA染色和rh - 123染料,分别。此外,ELISA法用于确定水平的半胱天冬酶3,8,9文化上层清液中的蛋白质。
2。材料和方法
2.1。合成ZnO-TiO2-Chitosan-Farnesol nc
制定ZnO-TiO2-chitosan-farnesol nc是通过化学沉淀技术完成的。500毫克的TiO2NPs是锌(没有的加上0.1米3)2。接下来,50毫升含有1%乙酸的水溶液中,用于500毫克的壳聚糖溶解。此外,50毫克的植物化学的金合欢醇与ZnO-TiO不一2壳聚糖的解决方案。0.1 M氢氧化钠溶液混合在ZnO-TiO一滴一滴地2-chitosan-farnesol解决方案,最后,白色残留物。残留激动在37°C 3 h,然后,获得技术与蒸馏水冲洗三次之后,乙醇的解决方案。最终的解决方案是离心机−3°C为40分钟15000 rpm。最终的解决方案是脱水2 h在200°C和获得进一步研究nc被保持在4°C (30.]。
2.2。表征ZnO-TiO2-Chitosan-Farnesol nc
获得的ZnO-TiO2-chitosan-farnesol nc研究使用XRD (X模型:'PERT PRO PANalytical)。ZnO-TiO2-chitosan-farnesol nc XRD结果2中捕获θ范围使用单色CuK 25°-80°α衍射光束波长的1.5406。的ZnO-TiO2-chitosan-farnesol nc的粒度使用NanoPlus DLS研究纳米粒子,然后通过SEM分析(EDAX卡尔蔡司超55 FESEM)光谱法(模型:印加)。ZnO-TiO的形态2-chitosan-farnesol nc检查通过TEM (Tecnai F20模型)的乐器。使用珀金埃尔默光谱仪、红外光谱被抓获在400 - 4000厘米−1波数范围。光致发光(PL)光谱被使用帕金Elmer-LS 14光谱仪(31日]。
2.3。细胞培养和治疗
写明ATCC MOLT-4细胞被收购,美国。这些细胞被维持在37°C和在媒体DMEM培养富含的边后卫(10%)和1%的抗生素青霉素和链霉素有限公司2孵化器。
2.4。MTT细胞毒性试验
针对MOLT-4 nc的细胞毒性细胞的方法检查按Mosmann (1983) (32]。细胞被播种在96孔板和处理几个浓度(60μ准备nc的g / ml) 24 h。治疗后,20μl (MTT(2.5毫克/毫升)混合,和孵化的解决方案是一个额外的4 h。后来,150年甲瓒形成晶体被停职μDMSO的l。分光光度计是用来确定在570 nm的吸光度。50%抑制浓度(IC50),细胞生存能力的百分比表示。细胞生存能力决定价值的比例每个吸光度相比,控制细胞井。数据是通过一式三份化验。细胞的形态学处理最优浓度进一步在20 x放大光学显微镜下观察到。
2.5。AO / EtBr染色
观察凋亡细胞死亡的nc的影响,AO / EtBr染色方法进行。双重染色(AO / EtBr: 100μg / ml)结合细胞治疗nc(50和60μ24 h和g / ml)的盖玻片放置在涂片染色。然后,幻灯片是维持5分钟37°C。使用荧光显微镜的放大20 x,凋亡细胞检测使用荧光显微镜(Labomed;(美国)33]。显微镜下的照片是通过三个独立的实验。
2.6。估计细胞ROS水平
DCFH-DA染色的细胞内ROS水平进行评估。细胞内,脱乙酰作用使染料与自由基反应在一个可量化的形式,导致其荧光染料的转换DCF副产品。处理后nc(50和60μ24 h g / ml),细胞被移除和resuspended PBS。在那之后,DCFH-DA解决方案(10μ米)被添加到悬架(2×105细胞/毫升)和留给孵化为30分钟37°C。细胞然后用PBS清洗两次,然后检查在485 - 530海里,荧光强度测量spectrofluorometrically使用SpectraMax®M2(分子设备;(美国)31日]。由三个独立的实验得到的数据在一式三份。
2.7。MMP的测量
线粒体去极化测量使用罗丹明- 123 (rh - 123),荧光染料。这些细胞被装载在6-well板和孵化nc(50和60μg / ml) 24 h。染料后,暂停30分钟保持在37°C。然后,冲洗1×PBS在荧光显微镜下检查(Labomed;美国),强度被蓝色滤光片(450 - 490海里),并记录图像的荧光强度检查使用ImageJ软件(30.]。这些照片是通过三个独立的实验一式三份。
2.8。测量还存在3 8和9的活动
白血病细胞被装载在6-well板包含媒体和nc(50和60μg / ml) 24 h。浮在表面的收获,维持在−80°C。半胱天冬酶的水平3、8和9的提取检测colorimetrically使用包按照制造商的推荐协议(美国Abcam) [32]。由三个独立的实验得到的数据在一式三份。
2.9。统计分析
研究结果表示为一式三份的平均数±标准差。SPSS程序版本20被用来评估统计分析。单向方差分析和DMRT测试被用来计算显著性水平。结果是重要的如果 。
3所示。结果
3.1。ZnO-TiO的合成和表征2-Chitosan-Farnesol nc
ZnO-TiO的x射线衍射模式2-chitosan-farnesol nc图所示1。氧化锌作为主要出现在角(2θ)31.70°,34.35°,36.20°,47.43°、56.48°、62.77°、66.30°、67.91°,和69.01°与相应hkl值(100)、(002)、(101)、(102)、(110)、(103)、(200)、(112)和(201)六角纤锌矿结构氧化锌,并与标准JCPDS卡片。36 - 1451 (34]。TiO的2山峰被观察到24.27°,29.91°,43.79°,47.43°揭示了锐钛矿TiO2阶段结构(JCPDS卡片没有:21 - 1272)[35]。峰值为10.46°和19.64°揭示了非结晶的壳聚糖。金合欢醇衍射峰也发现了15.77°,16.18°。ZnO-TiO的形成2-chitosan-farnesol nc促成了空间效应和分子间氢键在矩阵。德拜谢乐公式计算的微晶大小ZnO-TiO2-chitosan-farnesol矩阵是52 nm (34]。
FESEM TEM / SAED模式被用来确定ZnO-TiO的表面形貌2-chitosan-farnesol nc,如图2和3。TEM照片显示,法尼醇(第一层)和壳聚糖(中间层)封装在金属氧化物(ZnO-TiO2)在一个分层的模式(最后一层)。
(一)
(b)
(一)
(b)
(c)
(d)
ZnO-TiO的六角结构2-chitosan-farnesol nc也明显FESEM和TEM图像。六角结构形成边缘数据(图中就非常明显3(c))。在奈米棒的顶端,金属氧化物与生物聚合物封装壳聚糖和phytocompounds金合欢醇。粒子的平均尺寸是50±3海里,由x射线衍射。氧化锌的创建六角纤锌矿晶体TiO的阶段2金合欢醇,壳聚糖纳米材料被SAED模式(图3(d))。合成ZnO-TiO的元素2-chitosan-farnesol nc被EDAX确定频谱如图4(一)。的ZnO-TiO2-chitosan-farnesol nc原子百分比是13.58% (C), 9.53% (N), 31.76%(锌),9.49% (Ti), 35.11%在ZnO-TiO (O)2-chitosan-farnesol nc。
(一)
(b)
ZnO-TiO DLS光谱2-chitosan-farnesol nc测量126.20 nm(图4 (b))。此外,提高了DLS粒子的水动力大小相比,XRD和TEM研究nc以来被水媒体包围。红外光谱显示在图中5(一个)。这些结果证实,氧化锌,TiO2、壳聚糖、金合欢醇不同官能团在ZnO-TiO被发现2-chitosan-farnesol样本。壳聚糖的特征峰出现在3413和1634厘米−1,这是由于广泛的哦与H债券和nh峰,表明酰胺我集团(切断拉伸以及H变形模式)。羧酸盐峰的首席运营官——位于1316厘米−1。葡萄糖圆C-O-C伸展振动被观察到1067厘米−1(36]。然而,金合欢醇特征峰,碳氢键不对称和对称拉伸观察到2914和2837厘米−1认证的羧基。碳氢键弯曲(烷烃)伸展峰出现在1461和1384厘米−1。然而,山峰ZnO-TiO中找到2金合欢醇在932厘米−1和1030厘米−1是由于哦噢,拉伸,弯曲,分别和证实的交互37]。等金属氧(MO)伸缩振动Zn-Ti-O观察到724年,485厘米−1(38]。红外光谱谱结果证实,金合欢醇已成功与壳聚糖,氧化锌,TiO2的ZnO-TiO2-chitosan-farnesol表面矩阵。从ZnO-TiO这些交互了2-chitosan-farnesol nc的静电相互接触。
(一)
(b)
使用325纳米波长激发nc。图5 (b)显示了ZnO-TiO2-chitosan-farnesol nc的光致发光光谱。山峰ZnO-TiO2-chitosan-farnesol nc样品发射光谱被发现在378海里,395 nm、417 nm、442 nm、458 nm、474 nm和510 nm。紫外线排放(带边沿附近)被发现在378 nm和395 nm的自由激子辐射复合的碰撞机理(36]。紫罗兰发射观察到417海里可能是由于表面的电子转移捐赠到价带顶部(36]。单电离锌空缺(V锌)是由三个蓝色发射乐队在442海里,458 nm和474 nm,分别为(36]。由于氧空位(ov),绿色的发射光谱带集中在510海里(36]。
3.2。ZnO-TiO的影响2-Chitosan-Farnesol nc在细胞生存能力
细胞毒性的潜在的nc MOLT-4细胞生存能力是描绘在图6。MOLT-4与nc透露大量的细胞毒性细胞管理IC5047.98μ克/毫升。光学显微镜是参与调查MOLT-4细胞形态学改变。在50和60的剂量μg / ml, nc显示非凡的生存能力和形态异常的外观包括超然,收缩膜起泡、和扭曲的形状(数字6(一)和6 (b))。与浓度增加,进一步发生形态学改变。从集成电路50结果,两个浓度的nc(50和60μg / ml)被选作进一步的研究。
(一)
(b)
3.3。nc通过细胞凋亡诱导细胞死亡
NCs-treated凋亡和细胞死亡的细胞,研究了使用双AO / EtBr染色方法。由AO控制细胞显示绿色荧光染色,表明活细胞无细胞凋亡;然而,细胞暴露在nc表现出黄色和橙色荧光,标志着细胞凋亡,细胞核破裂和坏死细胞。黄色和橙色荧光强度增加的剂量nc增加。因此,nc的能力导致MOLT-4凋亡细胞明显(图7)。
(一)
(b)
3.4。测量细胞内ROS水平细胞
DCFH-DA染色方法来确定被处决MOLT-4细胞中活性氧的生产受到两种不同剂量的nc(50和60μg / ml),结果在图中进行了描述8。控制细胞会在暗绿色,表明最小ROS生产。MOLT-4细胞接受nc (50μg / ml)显示微弱的背景荧光,但这些细胞治疗高剂量的nc (60μg / ml)显示强烈的绿色荧光,表明ROS升高生产与处理浓度的增加与nc(图8)。
3.5。测量细胞MMP的水平
rh - 123染色是用来评估在nc(50和60 MMP的水平μg / ml)治疗MOLT-4细胞,结果见图9。控制细胞有强烈的绿色荧光,表示MMP的水平更高。然而,MOLT-4细胞治疗与nc显示一个沉闷的绿色荧光,表明耗尽MMP的细胞。这一发现表明,nc MOLT-4细胞可以降低MMP的水平,这也解释了活性氧水平升高(图9)。
3.6。参与细胞凋亡蛋白酶3 8和9蛋白质在细胞死亡
nc管理MOLT-4细胞显示半胱天冬酶3的表达升高,8,9相比,控制细胞(图10)。这些发现表明,ZnO-TiO2-chitosan-farnesol nc MOLT-4细胞诱导凋亡发生通过caspase-dependent通路。nc治疗proapoptotic标记的表达显著增加(50μg / ml, ;60μg / ml, )。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
金属纳米粒子和生物聚合物的结合已经用于治疗白血病在过去的几年里。多糖甲壳素脱乙酰作用得到的壳聚糖,是利用阳离子还原剂合成金属纳米颗粒。这个应用程序是可行的,因为它许多生物学特性,包括生物相容性,癌症细胞毒性,诊断癌症的能力,并且能够作为车辆的运输药物在癌症治疗39,40]。此外,植物化学物质进入nanoparticle-biopolymer组合增强抗癌效果(41,42]。
一个这样的类异戊二烯是金合欢醇,它已被证明能够诱导细胞死亡在多个细胞系(16]。此外,金合欢醇已经证明对肿瘤细胞具有选择性毒性,尤其是白血病细胞,显示其巨大的潜力为癌症治疗(有效工作43]。因此,当前研究的主要目标是合成,表征和测试生成的ZnO-TiO的抗癌效果2-chitosan-farnesol nc对白血病MOLT-4细胞系。
纳米毒理学研究中最重要的技术之一是细胞毒性研究,揭示了细胞的响应任何毒物和细胞存活率和死亡率提供信息44]。治疗的白血病MOLT-4细胞合成nc实质细胞毒性浓度的方式展出。与以前的研究结果是一致的与氧化锌/二氧化钛nc (45,46]。此外,nc的毒性浓度可以认证的金合欢醇合成nc的出现。通常,金合欢醇也是众所周知的氧化锌和TiO相比显著的抗癌特性2(28]。
进一步理解细胞死亡机制引发的nc、AO / EtBr染色法被用来评估与细胞凋亡相关的形态学改变。生活(控制)细胞会绿色由于AO的扩散到细胞膜,但治疗细胞凋亡和橙色会由于核收缩。早期研究氧化锌/ TiO2/ Ag nc也显示类似的观察(47]。染色质NCs-treated发生在分裂细胞表明EtBr染料的吸收,与观察壳聚糖修饰银纳米粒子在早前的报告48]。壳聚糖纳入nc包含自由胺组,这不仅提供了一个高互动积极的表面电荷,也使它容易与带负电荷的细胞膜,造成进一步的细胞死亡的凋亡[49]。
细胞内活性氧的形成常常导致氧化应激的发生,导致细胞死亡的凋亡50]。NPs毒性的主要过程是生产自由基和氧化应激的顺向建设(51]。ROS生成的同时,增加细胞治疗与早期和晚期凋亡的起始52]。当前的研究特别是显示ROS生成在NCs-treated细胞浓度升高的趋势。先前的研究已经表明,纳米颗粒治疗产生超氧化物和羟基自由基以及nonradical过氧化氢,导致DNA,脂类,蛋白质损伤,以及细胞周期阻滞(51]。据报道,ROS生产是诱导细胞凋亡的关键因素53),异常高活性氧积累耗尽细胞的抗氧化能力,可以修改细胞代谢途径和线粒体功能改变,导致细胞死亡(54]。
线粒体是细胞内活性氧的主要来源。因此,ROS水平升高触发线粒体过渡孔的开放,从而降低MMP和激活半胱天冬酶级联,最终在细胞死亡的高潮55]。NCs-treated细胞,注意到一个微弱的绿色荧光,是由于线粒体膜去极化,从而未能保留rh - 123调查。活性氧水平升高引发凋亡过程通过促进线粒体膜去极化,确凿之前与顺铂抗癌研究金合欢醇coencapsulated纳米颗粒(15]。
细胞凋亡是一个复杂的和复杂的过程,涉及一个依赖资源的分子链过程涉及细胞收缩,染色质缩合,和细胞分裂16]。因为半胱天冬酶激活是起点在凋亡过程中,评估他们的活动模式的行动研究是一个重要的组成部分。还存在一类蛋白质是由半胱天冬酶3,刺激引发细胞凋亡的细胞凋亡蛋白酶8和9 (56]。合成nc大幅度提升proapoptotic基因的表达模式和半胱天冬酶3、8和9。我们的研究结果表明,nc的细胞介导的细胞毒性潜能激活细胞凋亡,这是符合ROS的海拔,恶化MMP的水平,增加细胞的数量表现出黄色和橙色荧光在AO / EtBr染色结果。NCs-treated细胞,增强ROS水平降低MMP的水平,和半胱天冬酶激活显示细胞凋亡诱导通过内在或线粒体通路(57]。Farnesol-mediated细胞死亡在一些肿瘤细胞也被观察到的内在途径,是伴随的结果(21,27]。
5。结论
ZnO-TiO的协同抗癌潜力2-chitosan-farnesol nc MOLT-4细胞已被调查。的细胞毒性效应NPs ROS水平降低MMP的水平升高,增加半胱天冬酶3的表达,8,9表示一个重要的抗癌潜力nc。nc是注意到通过upregulation引发白血病细胞的细胞凋亡的半胱天冬酶3,8,9基因和MMP的损耗。因此,nc的细胞毒性是由通过线粒体途径凋亡诱导。总体而言,我们的研究结果显示一个创新的方法修改ZnO-TiO的物理化学特性2-chitosan-farnesol nc,以提高它们的性能和表现出协同抗癌性能在人类白血病癌细胞。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
伦理批准
本研究机构伦理委员会批准,Jouf大学Sakaka,沙特阿拉伯。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者要感谢Jouf大学科研院长以来,沙特阿拉伯的金融支持,研究合同编号(dsr2022 - rg - 0155)。