文摘

病毒-宿主相互作用扮演关键的角色在促进有效的出口很多RNA病毒,包括埃博拉病毒(EBOV或“e”)和马尔堡病毒(MARV或“m”)。(晚)- L -域守恒在病毒基质蛋白招募特定宿主蛋白质,如Tsg101 Nedd4,促进发芽过程。这些交互作为有吸引力的广谱崭露头角的抑制剂的发展目标。我们理解的主要差距仍然存在filovirus出芽机制由于难以检测病毒-宿主复合物和映射的交易模式细胞的自然环境。为了解决这个差距,我们使用一个双分子的互补(BiMC)方法探测、定位,并遵循eVP40-Tsg101复合物的交易模式在哺乳动物细胞。此外,我们使用了BiMC崭露头角的测定方法以及车牌区域测试确认的小分子抑制剂在网上筛查的能力阻止eVP40 PTAP-mediated交互eVP40 Tsg101和随后的萌芽的一种。我们展示了潜在的广谱活性的领先候选人抑制剂通过展示其能力来阻止PTAP-dependent绑定的hiv - 1的呕吐Tsg101和随后的hiv - 1的呕吐一种出路。

1。介绍

丝状病毒是人类病原体引起严重的出血性疾病和潜在的生物恐怖主义(代理1,2]。EBOV和MARV BSL-4代理和NIAID类别优先病原体由于他们与高死亡率和缺乏批准疫苗和抗病毒药物(2]。丝状病毒包膜,nonsegmented段RNA病毒,一个大约19.0千碱基基因组编码的核蛋白(NP), VP35,基质蛋白(VP40),附件糖蛋白(GP), VP30, VP24, RNA聚合酶蛋白(L) (3]。VP40是病毒的主要组成部分,表达VP40独自在哺乳动物细胞足以产生细胞外的病毒样颗粒(一种),这就像真正的病毒粒子在整体形态(4- - - - - -10]。(晚)- L -域主题守恒VP40蛋白质至关重要的有效的出口一种病毒粒子,劫持他们功能的特定的宿主蛋白质参与空泡的蛋白分类(vps)途径促进virus-cell分离的最后一步3,6,10- - - - - -14]。EBOV VP40 (eVP40)具有两个区域主题(PTAP和PPEY)的n端(₇-PTAPPEY -₁₃)[4,6]而MARV VP40 (mVP40)和NP (mNP)包含单一PPPY和PTAP区域主题,分别是(12,15]。蛋白质亲和色谱法等各种方法,GST-pulldowns,酵母二者混合屏幕已经成功地用于检测这些功能相关区域介导病毒-宿主相互作用在体外(6,12,15]。例如,PTAP区域eVP40成员主机Tsg101,组件的细胞ESCRT (endosomal排序所需的复杂传输)通路参与排序monoubiquitinated蛋白质进入多泡体(多功能车辆总线)3,6,10,12,15- - - - - -22]而PPEY eVP40调和的主题与主机的交互Nedd4泛素连接酶(4)导致eVP40泛素化和增强车牌区域出口(4,10,19,23,24]。尽管有这些在体外研究,检测和可视化这些宿主的复合物,以及细胞内的交易模式,这些复合物在宿主细胞的自然环境仍然是难以捉摸的。

解决这些漏洞和识别有效的小分子抑制剂filovirus萌芽,我们使用一个双分子的互补(BiMC)试验25- - - - - -28)与金星增强的黄色荧光蛋白(EYFP)调查filovirus VP40-host实时交互在哺乳动物细胞(8]。金星EYFP,含有绿色荧光蛋白变体小说F46L突变,可以分为N - c端片段,和重建这两个EYFP片段由本质上是一个不可逆转的荧光信号蛋白质相互作用的结果。这种方法用于检测和记录瞬态交互事件,允许短暂的检测和/或弱相伴完整活细胞中蛋白质-蛋白质之间的关系(26,28- - - - - -31日]。使用这种方法,我们不仅能够可视化的eVP40-Tsg101交互生活哺乳动物细胞(8),但也可以本地化和遵循eVP40-Tsg101复合物在活细胞的迁移。最后,我们使用BiMC崭露头角的化验和车牌区域评估具体的抑制效应旨在阻止PTAP-mediated病毒-宿主相互作用的小分子化合物和随后的病毒出芽。

2。材料和方法

2.1。细胞、质粒和抗血清

293年人类t细胞在DMEM维护富含10%的边后卫。所有的嵌合结构被克隆到pCAGGS表达载体。质粒eVP40-WT和eVP40-ΔPT / PY前面描述的(6]。最初的MARV VP40表达质粒是请提供的Stephan贝克尔(马尔堡,德国)。质粒pCS2包含完整的金星EYFP Roselyn j·艾森伯格提供的慷慨,加里·科恩和多Atanasiu(宾夕法尼亚大学牙科医学院的)。hiv - 1的呕吐表达式构造和anti-Gag抗血清是请提供的保罗·贝茨(宾夕法尼亚大学)。NYFP和CYFP片段扩增和融合独立完整的菌进行基因Tsg101, eVP40, mVP40, HIV呕吐,或区域突变体eVP40或呕吐pCAGGS标准克隆技术(8]。质粒CYFP-mVP40包含一个在坐标系国旗CYFP片段之间的表位标记和mVP40羊痘疮。Anti-eVP40单克隆抗血清是请提供基因澳林格博士(英尺Detrick USAMRIID, MD) [6]。鼠单克隆抗体标记抗原决定基(Sigma-Aldrich)是根据制造商的指示使用。山羊多克隆抗体对pericentrin-B购自圣克鲁斯生物技术。小分子化合物5539 - 0062 (ChemDiv,圣地亚哥,CA)溶解在二甲亚砜(DMSO, FisherBiotech)浓度4 - 10毫米,储存在−20°C。

2.2。车牌区域崭露头角的化验

人类293 t细胞被单独或与指定的质粒co-transfected使用Lipofectamine(表达载体)Opti-MEM(英杰公司)根据制造商的指示。车牌区域崭露头角的化验和西方墨点法进行如前所述[8]。

2.3。BiMC、免疫荧光共焦显微镜

人类293 t细胞生长在玻璃盖玻片six-well板块和cotransfected表明质粒。转染24小时后,细胞用PBS、固定与冷甲醇/丙酮(/卷,卷1:1)和沾染了适当的主要和第二抗体表示。细胞被洗如上所述,随后沾4′,6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI)在室温下10分钟。与PBS细胞被洗了四次,贴在玻璃幻灯片延长不变色(表达载体/分子探针)。幻灯片被认为使用一个lsm - 510元共焦显微镜(卡尔蔡司)。活细胞成像,293 t细胞被播种在玻璃底部microwell菜肴和转染质粒。在转染后4 h, YFP使用时不时观察荧光共焦显微镜的5%的股份有限公司₂和湿度在37°C。细胞被监测YFP荧光一段转染后的20 - 24小时。

2.4。核转染

Tsg101-specific核小干扰rna(用作负控制)和随机买来Dharmacon Inc .转染了使用Lipofectamine 2000(英杰公司)根据制造商的指示。短暂,293 t细胞被播种在24-well盘子2小时。然后转染细胞和20 nM Tsg101-specific或随机核。在第二次细胞转染24高压汽轮机与相同数量的核和质粒(s)表示。在48 h.p.t。这些细胞被洗、固定和YFP荧光检测如上所述。细胞提取物中收获里帕缓冲区,用于免疫印迹分析。

2.5。小分子抑制剂VP40萌芽

人类293 t细胞在6-well播种板是单独使用车辆(DMSO),或复合5539 - 0062在DMSO浓度表示的1 h在37°C。细胞随后表示质粒的转染。病毒蛋白质在细胞中提取和一种被西方墨点法如上所述。

3所示。结果

3.1。代EYFP融合质粒和EYFP融合蛋白的表达

我们生成一系列的质粒(其中一些前面描述的,看到8)用于BiMC试验包含的氨基端EYFP片段(残留1 - 173,NYFP来表示),或c端EYFP片段(残留174 - 239,表示CYFP)加入主机Tsg101在坐标系,或WT eVP40区域突变体,mVP40, hiv - 1 p55-Gag(图1)。所有质粒被自动化的DNA测序验证,证实了所有YFP融合蛋白的表达蛋白免疫印迹(8];(刘和哈蒂,数据未显示)。CYFP片段的重要的是,融合所有病毒蛋白质的N-termini并不影响蛋白表达,特征明显,L-domain-dependent崭露头角的这些病毒基质蛋白的性质(刘和哈蒂,数据未显示);(8,32]。

3.2。检测、定位和在哺乳动物细胞中使用BiMC贩卖eVP40-Host交互

最近,我们报道,BiMC方法可以用来检测病毒蛋白质相互作用在活哺乳动物细胞(32]。在这里,我们使用了类似的方法来检测这些filovirus-host复合物的胞内定位和地图,并遵循这些复合物在实时交通通过细胞。简而言之,人类293 t细胞与质粒表达cotransfected NYFP-Tsg101 + CYFP-eVP40-WT或NYFP-Tsg101 + CYFP-eVP40-ΔPT / PY (eVP40区域删除突变),和细胞检查在24 h.p.t YFP荧光。没有背景荧光检测融合质粒转染时单独([32刘,et al .,数据未显示)。YFP荧光观察容易和可重复293年t细胞coexpressing NYFP-Tsg101 + CYFP-eVP40-WT(图2(一)面板);然而,没有这个信号在细胞coexpressing NYFP-Tsg101 + CYFP-eVP40-ΔPT / PY(图2(一个)面板b) [32]。类似的结果除了人类293 t细胞细胞系包括Huh7,海拉,A549细胞(刘和哈蒂,数据未显示)。使用区域删除突变eVP40不仅验证观察EYFP的特异性信号(图2(一个)面板),但也证明使用BiMC方法的整体可行性检测并记录这些瞬态病毒-宿主交互在哺乳动物细胞(32]。应该注意的是,CYFP-eVP40-ΔPT / PY蛋白质BiMC试验显示功能,因为它与NYFP-eVP40-WT形成eVP40-WT eVP40-ΔPT / PY复合物导致YFP荧光细胞(32]。

进一步证明观察YFP荧光(图2(一个),面板)是由于特定的相互作用eVP40 Tsg101,我们用随机或Tsg101-specifc siRNAs cotransfected细胞。简而言之,人类293 t细胞生长在盖玻片6-well盘子mock-transfected,或转染20 nM Tsg101-specific或随机核。24小时后,细胞mock-transfected或转染与相同数量的siRNAs连同NYFP-Tsg101 + CYFP-eVP40质粒(图2(一个))。一个额外的24小时后,细胞被为YFP荧光共焦显微镜检查。YFP强信号在细胞表达Tsg101 / eVP40-WT没有核的存在(模拟),或随机核(图2(一个))。相比之下,YFP荧光在细胞几乎没有收到Tsg101-specific siRNA(图2(一个))。重要的是,的浓度Tsg101-specfic siRNAs上面使用了通过免疫印迹击倒的表达Tsg101在293 t细胞> 90%(刘和哈蒂,数据没有显示;(6])。

3.3。走私和胞内定位Tsg101 / eVP40复合物在活细胞

曾经的特异性NYFP-Tsg101 + CYFP-eVP40-WT交互确认,我们试图确定协会的动力学和细胞内的起源这宿主复杂,并遵循其通过实时细胞运动。YFP荧光在早期生成p细胞中共同表达NYFP-Tsg101 + CYFP-eVP40-WT似乎在性质和局部点状的毗邻核(图2 (b))。这种细胞内微管组织中心的立场相似,(MTOC)。因此,我们试图确定NYFP-Tsg101 + CYFP-eVP40-WT复杂最初形成的MTOC pericentrin-B利用抗体:一个MTOC标记蛋白质(图2 (b))。事实上,Tsg101 / eVP40-WT 3 - 4个小时之间复杂的首先是可见的僵化。,和this complex colocalized strongly with pericentrin-B at 6 hours p.t. (Figure2 (b)上面一行)。相比之下,colocalization Tsg101 / eVP40-WT复杂与僵化之后倍pericentrin-B并不明显。(12到24小时,图2 (b)底下一行)。这些发现表明,Tsg101 / eVP40复杂可能通过微管网络流量的最终网站崭露头角的质膜。应该注意的是,额外的细胞标记包括calnexin (ER), Giantin (独联体高尔基体)和EEA1(早期内体)被用于类似colocalization实验;然而,Tsg101 / eVP40-WT复杂并没有表现出任何重大colocalization水平与这些宿主蛋白质(刘和哈蒂,数据未显示)。

进一步的证据支持的运动从MTOC Tsg101 / eVP40复杂等离子体膜是通过持续的监控co-transfected YFP信号的细胞在16小时内(图2 (c))。实时的图像单个细胞共同表达NYFP-Tsg101表示次+ CYFP-eVP40-WT p说明了Tsg101-eVP40-WT复合物的胞内定位的变化从他们最初的形成之间的MTOC转染3 - 4小时后,其增强的积累在不同的补丁在质膜(图2 (c))。综上所述,Tsg101-eVP40-WT复合物的性质表现出细胞的自然环境似乎代表功能招聘的Tsg101 eVP40导致有效的萌芽。

3.4。小分子抑制剂Filovirus VP40-Host交互和出芽VP40车牌区域

病毒L-domains有吸引力的目标host-oriented疗法可能具有广谱活动反对过多的区域含有RNA病毒(33]。例如,五个氨基酸环肽是近日报道扰乱Tsg101之间的交互和PTAP区域主题hiv - 1的呕吐导致出口减少呕吐的一种(34,35]。我们的策略来确定抑制剂filovirus崭露头角的执行在网上锌药物类库的筛选(240万种化合物)对NMR-derived结构人类Tsg101 UEV域(PDB id: 1 m4p构象异构体# 1)专注于绑定PTAP肽(图的口袋里3)[34,36,37]。PTAP绑定口袋被残留Y63大致概述,Y68,——, M95, F142, S143 Tsg101。高通量计算筛选与AutoDock项目执行DOVIS管道(38,39]。前20000名复合物的初始屏幕最小化在CHARMM MMFF力场和reranked使用Accelrys Ligscore2 [40- - - - - -42]。

我们测试了六大得分化合物崭露头角的化验使用BiMC和车牌区域的能力破坏一个eVP40-Tsg101,或出口mVP40-Tsg101交互和随后的车牌区域。的六个分子检测、复合5539 - 0062(图4(一))表现出PTAP-specific抑制出口和eVP40-Tsg101 eVP40车牌区域复杂的形成。简而言之,人类首次治疗1小时293 t细胞与载体(DMSO),或增加化合物的浓度5539 - 0062,然后eVP40出芽或mVP40一种评估和量化数据4 (b)- - - - - -4 (d))。eVP40-WT的化合物5539 - 0062抑制PTAP-dependent崭露头角的一种低浓度> 50%,并在更高浓度> 90%(数据4 (b)和4 (c))。相比之下,PTAP-independent出芽的mVP40-WT一种降低了< 2倍浓度测试(数字4 (b)和4 (d))。表达式控制eVP40-WT和mVP40-WT细胞未加药物浓度测试数据4 (b)- - - - - -4 (d))。应该注意的是,5539 - 0062浓度的化合物用于上述实验表现出没有明显的毒性在人类293年文化为t细胞由XTT比色测定(刘和哈蒂,数据未显示)。一致的发现我们的车牌区域崭露头角的化验(数字4 (b)- - - - - -4 (d)5539 - 0062),化合物阻塞之间的交互NYFP-Tsg101 + CYFP-eVP40-WT由BiMC(图4 (e))和定量YFP荧光细胞,流式细胞仪分析。因此,复合5539 - 0062能够专门抑制PTAP-dependent出芽的eVP40一种通过扰乱eVP40-Tsg101交互而没有影响PTAP-independent mVP40出芽的一种。

进一步证明PTAP-specific抑制作用的化合物5539 - 0062和评估其能力抑制发芽的传染性病毒,我们感染了293 t细胞与VSV-WT(包含PPxY-type区域),或VSV-M40;包含PTAP-type的VSV病毒重组区域从eVP40代替正常的VSV PPxY-type区域(18)(表1)。在两个独立的实验中,细胞被感染的莫伊1.0 8个小时,和病毒释放到上层的收获和效价BHK-21细胞。当量浓度VSV-WT和VSV-M40获得的车辆(DMSO)(表1)。虽然VSV-WT略有减少的浓度在5539 - 0062的浓度增加,VSV-M40的浓度可再生产地减少3-10-fold更多比VSV-WT化合物浓度增加的5539 - 0062(表1)。这些数据关联与如图4,进一步支持复合5539 - 0062抑制病毒的特异性PTAP区域功能通过抑制发芽的水疱性口炎病毒传染性重组表达PTAP-type eVP40区域。

3.5。5539 - 0062复合抑制hiv - 1 Gag-Tsg101交互和出芽PTAP-Dependent插科打诨车牌区域

p6的hiv - 1地区Gag包含一个定义良好的PTAP区域主题,协调有效的hiv - 1病毒出芽,呕一种通过招募Tsg101在某种程度上类似于使用eVP40 [16,17,20.]。确定PTAP抑制剂5539 - 0062广谱antibudding活动,我们在车牌区域使用hiv - 1 Gag蛋白崭露头角的化验和生成的hiv - 1 Gag-YFP融合蛋白用于BiMC。简而言之,人类293 t细胞与NYFP-Tsg101 cotransfected + CYFP-Gag-WT或CYFP-Gag-ΔP6 (PTAP区域突变)作为控制(见图1),YFP荧光检测24小时僵化。(图5(一个))。共同表达NYFP-Tsg101 + CYFP-Gag-WT显示主要的细胞点状的YFP信号,很明显在细胞核周围的补丁和细胞边缘(图5(一个))。正如所料,YFP信号几乎没有细胞共同表达NYFP-Tsg101 + CYFP-Gag-ΔP6(图5(一个))。CYFP-Gag-WT和CYFP-Gag-ΔP6融合蛋白被证明在转染293 t细胞表达蛋白质印迹(刘和哈蒂,数据未显示)。

接下来,我们使用两个BiMC(图5 (b)初露头角的(图)和车牌区域5 (c))化验确定化合物5539 - 0062可以抑制hiv - 1病毒的Gag-Tsg101交互和随后的出口限制剂量依赖性的方式的一种。人类293 t细胞治疗与车辆(DMSO)单独或表示5539 - 0062浓度的化合物,然后用NYFP-Tsg101 co-transfected + CYFP-Gag-WT(图5 (b))。YFP荧光的细胞检查24小时通过共焦显微镜(图p5 (b))。丰富YFP阳性细胞在DMSO溶液的存在;然而,YFP阳性细胞的总数随浓度的增加而降低化合物5539 - 0062(图5 (b))。这些发现表明,化合物5539 - 0062能够抑制PTAP-mediated Tsg101与hiv - 1的呕吐剂量依赖性的方式相互作用。

接下来,人类293 t细胞首次治疗仅1小时与车辆(DMSO),或增加化合物的浓度5539 - 0062,然后用hiv - 1 p55-Gag表达质粒转染(图5 (c))。p55-Gag被免疫印迹检测和量化两种细胞提取物在24 hp.t。(图5 (c))。发芽抑制了p55-Gag化合物5539 - 0062剂量依赖性的方式如图所示通过减少p55-Gag水平在一种(图5 (c))。相当于p55-Gag水平维持在细胞提取物在整个范围的抑制剂浓度(图5 (c))。综上所述,这些数据表明区域抑制剂化合物等5539 - 0062,很可能对多种具有广谱抗病毒活性RNA病毒,取决于特定区域/主机交互高效的出口和传播。

4所示。讨论

Filovirus-host交互是病毒粒子的重要有效的出口;然而,机械的细节形成、动力学和贩卖这些病毒-宿主复合物在宿主细胞的自然环境已经难以捉摸。在这份报告中,我们使用一个BiMC可视化方法eVP40-Tsg101复合物形成的细胞。证实了这种相互作用的特异性使用区域删除突变eVP40和通过使用特定siRNAs Tsg101。重要的是,NYFP-Tsg101融合蛋白在哺乳动物细胞稳定表达,和芽CYFP-VP40融合蛋白保留他们的能力独立于细胞作为一种以L-domain-dependent的方式。BiMC方法是理想的检测弱和/或瞬态蛋白质相互作用在活细胞27,28]。我们证明eVP40-Tsg101转染后3 - 4小时之间形成复合物,与早期(6小时。僵化。)与pericentrin-B MTOC标记。我们假定初始eVP40-Tsg101复合物可能会迁移从MTOC萌芽在质膜上的网站12 - 24小时僵化。这工作模型与先前的报道暗示filovirus VP40蛋白质可能与和利用宿主细胞骨架网络在装配和出口(43,44]。

说明分子的复杂性和动态宿主相互作用导致的自然细胞环境将增强我们的能力来有效地屏幕和验证新的抗病毒药物(29日,31日,33]。最近的研究已经确定了两种化合物,fgi - 104和fgi - 106,显示活动对丝状病毒在细胞培养和动物(45,46];然而,fgi - 104和fgi - 106的目标仍有待确定。此外,小分子抑制剂filovirus条目最近被识别和特征(47- - - - - -49]。病毒结构区域/宿主相互作用仍然是一个有吸引力的目标发展的小说,广谱发芽抑制剂(33- - - - - -35,50]。BiMC试验的成功开发评估filovirus-host交互(手稿)发芽试验和使用我们的车牌区域代表强大的工具,使我们筛选和验证filovirus崭露头角的小分子抑制剂。通过使用已知的三维原子结构PTAP Tsg101绑定的主题,我们使用一个在网上策略来识别和排序商用性质预测药物类的化合物,可以阻止这种交互。从这个屏幕,我们确定了化合物5539 - 0062,根据BiMC和车牌区域崭露头角的化验证明这个小分子抑制PTAP-dependent eVP40的崭露头角的一种,但不是PTAP-independent萌芽mVP40种。此外,化合物5539 - 0062还表现出特定的抗病毒活性在细胞感染水疱性口炎病毒重组(VSV-M40)表达PTAP eVP40的区域。低水平的抑制的原因PPxY-dependent出芽VSV-WT观察到的化合物的存在5539 - 0062还有待决定(表1化合物的潜在效果一样),5539 - 0062年在其他阶段的VSV病毒复制。PTAP-specific抑制活动表现出单,第一代化合物是鼓励和使用此策略作为理论水平和BiMC分析识别和验证崭露头角的抑制剂。化合物5539 - 0062可能优化提高亲和力通过寻找相似的化学分子的商用数据库,或通过使用结构交互指纹方法包括选择化合物预计将有相同的protein-ligand交互(5539 - 006251]。区域抑制剂的一个优点是其潜在用途广泛的活动广泛的RNA病毒。事实上,我们能够表明,除了抑制萌芽eVP40种,复合5539 - 0062还能够阻止PTAP-mediated Tsg101之间的交互和hiv - 1的呕吐,导致抑制hiv - 1的呕吐出芽。

虽然重点是抑制剂PTAP-type区域活动,正在进行类似的研究,确定抑制剂PPxY-type L-domains以及(刘、李、奥尔森和哈蒂,未公开的数据)。病毒PPxY-type L-domains已知与宿主蛋白质如Nedd4 E3泛素连接酶(4,24]。可以设想,鸡尾酒崭露头角的抑制剂的使用包含PTAP PPxY-specific化合物,例如,可能会更有效地阻断病毒比单一出口区域抑制剂。事实上,EBOV和MARV似乎利用两个PTAP PPxY L-domains高效出口(6,12]。

除了这些病毒-宿主相互作用的研究中,我们调查的贡献病毒VP40-VP40 VP40-NP, VP40-VP35交互filovirus组装和出口(5,7,32,52]。BiMC方法的广泛适用性以及多色荧光战略将提高我们理解这些复杂的生物相关性multiprotein RNA病毒出口的交互。扩展这些研究包括活病毒和/或动物模型是至关重要的,将有助于带来新的见解filovirus发病机理和新颖的治疗方案。

确认

作者要感谢Drs。斯蒂芬。贝克尔基因澳林格,保罗·贝茨Roselyn艾森伯格,加里·科恩和多Atanasiu好心地为他们提供试剂和/或讨论。他们也感谢Andrea赵胖和茉莉花的共焦显微镜的帮助。他们也感谢Zelman谋求帮助构建hiv - 1 YFP-Gag融合质粒,和哈蒂实验室的所有成员有益的讨论。本文的部分支持由国家卫生研究院的基金AI077014, AI090284,从宾夕法尼亚大学研究基金会和资助r·n·哈蒂和国防部国防威胁降低局授予4.10011 _07_rd_b m·a·奥尔森。