焦谷氨酸的影响:硫化叶菌acidocaldarius比水飞糖浆Glutamate-Containing媒体

摘要

微生物很好地适应了它们的栖息地，但对其他有机体分泌的有毒代谢物或非生物化合物或在各自环境条件下形成的化学物质部分敏感。嗜热菌受到焦谷氨酸的挑战，焦谷氨酸是一种内酰胺，在需氧嗜热条件下由谷氨酸环化自发形成。众所周知，嗜热嗜酸crenarchaeon的生长水飞糖浆(原硫化叶菌）由焦谷氨酸完全抑制。在本研究中，我们调查的生长焦谷氨酸的作用S、 索尔法塔里科斯和近亲crenarchaeon酸黄杨。相比S、 索尔法塔里科斯,美国acidocaldarius以焦谷氨酸为唯一碳源成功栽培。生物信息学分析表明，这两个成员Sulfolobaceae至少有一种5-氧脯氨酸酶的候选，它可以催化atp依赖的焦谷氨酸转化为谷氨酸。在S、 索尔法塔里科斯，我们观察到细胞内积累的焦谷氨酸和粗细胞提取试验显示，焦谷氨酸降解效果较差。很显然,美国acidocaldarius似乎是在碳水化合物和更喜欢肽生长的多才多艺S、 索尔法塔里科斯。Concludingly，美国acidocaldarius表现出焦谷氨酸更有效地利用，并且不被该化合物抑制，使其在高温下与含有谷氨酸媒体应用更好的候选者。

1.介绍

由于极端的培养条件为许多不同的应用提供了新的可能性，嗜热菌对生物技术具有很高的兴趣。在Sulfolobaceae[1个]在不同碳源（包括胰蛋白酶原和casaminoid酸）上进行有氧运动[2个pH为2-3，温度在75-80℃左右。然而，大多数嗜热酸菌受到非常低的生物量产量的限制[三]，禁止一个高效生产高附加值产品。其中一个原因是潜在的生长抑制的低分子量，其与基于发酵罐培养期间观察到的离子化合物的积累水飞糖浆[三]。这些化合物之一已被确定为焦谷氨酸盐，其自发地从谷氨酸和谷氨酰胺在高温下和在低pH下形成[4个,5个]。

到目前为止，关于焦谷氨酸盐对真核生物和原核生物的影响，人们所知不多。患有谷胱甘肽合成酶缺乏症的人会在血浆(焦谷氨酸血症)和尿液(焦谷氨酸尿症)中积累焦谷氨酸，从而发展为慢性代谢性酸中毒[6个]. 杨和他的同事们发现，由乳酸菌产生的焦谷氨酸对所调查的革兰阴性菌有抗菌作用[7个]。焦谷氨酸浓度已经达到0.3% ( )一些抑制生长假单胞菌和肠杆菌菌株。由于在液体培养基中比在琼脂培养基中有更强的抑制作用，杨和他的同事预测，抗菌作用取决于非解离形式，它通过细胞膜，部分破坏了质子梯度。焦谷氨酸也能抑制S、 索尔法塔里科斯和其他嗜热酸菌，例如，Metallosphaera sedula和热原体属acidophilum[4个,八]。Park和他的同事们发现，在含有谷氨酸盐的培养基中添加焦谷氨酸会降低谷氨酸盐的生长速度S、 索尔法塔里科斯在3.3-15.5 mM的浓度范围内。在浓度为12.1 mM时，其生长速度下降了50%，而在浓度为15.5 mM时，其生长速度完全消失[4个]。

值得注意的是，一些水解蛋白在微生物培养中用作营养物质，如酪蛋白水解物和酵母提取物[9个，以谷氨酸为主要氨基酸。生物工艺过程通常包括含有水解蛋白的复合培养基。这些蛋白质从动物源性食物废物(如皮肤或内脏)中获得，在生物技术中作为廉价的碳源发挥着重要作用[八]。嗜热生物体通常培养在补充有氨基酸作为碳源[媒体三,10,11]。然而，当pH值为2至3.5及高于室温时，谷氨酸会自发转变为焦谷氨酸[八,12]. 这使得许多嗜热嗜酸菌，比如，S、 索尔法塔里科斯，不太适合于许多生物技术来焦谷氨酸诱导的生长限制接近所致。

在这项研究中，生长两个密切相关的crenarchaea-的行为美国acidocaldarius和S、 索尔法塔里科斯-on谷氨酸和焦谷氨酸作为检查唯一碳源。而美国acidocaldarius即使在高浓度的情况下也能利用焦谷氨酸，S、 索尔法塔里科斯即使在其他合适的碳源存在的情况下，较高的焦谷氨酸浓度也会抑制其生长。在谷氨酸和焦谷氨酸的作用下，S、 索尔法塔里科斯表现出低效率的焦谷氨酸代谢相比美国acidocaldarius。因此，焦谷氨酸盐是较不适合作为碳源S、 索尔法塔里科斯因为它在细胞内积聚并在高浓度下抑制生长。

2.材料和方法

2.1。应变和生长条件

硫化叶菌acidocaldariusMW001 [13),水飞糖浆P2 [14,15]在布罗克培养基中生长[1个]pH值为3。媒介美国acidocaldariusMW001补充了20个μ克/毫升尿嘧啶。添加24mm l -谷氨酸盐或24mm l -焦谷氨酸盐。这两个菌株都适应了谷氨酸的生长，从一个单一的适应周期(5天)的酪蛋白水解物培养开始。在两个周期(14天和4天)中，使用谷氨酸适应细胞对焦谷氨酸进行适应。在接下来的实验中，我们使用了已适应细胞的甘油储备。

每种条件下进行四种独立的培养。培养物接种(初始OD)₆₀₀: 0.05-0.06) with a preculture that was inoculated with an adapted glycerol stock of the same carbon source and were incubated in long neck flasks (500 mL flasks, medium volume 100 mL) at 75°C and 160 rpm (Thermotron, Infors AG, Switzerland). During growth, pH was regulated with 0.5 M H_2个所以_4个. 通过测量600 nm（OD）处的光密度来监测细胞的生长₆₀₀)。

2.2。细胞内和细胞外氨基酸浓度的定量

为了测定细胞外氨基酸浓度，生长过程中定期取上清样品，离心(20,000×g, 5min, RT)。

To determine intracellular concentration of amino acids, a culture volume corresponding to 2 mg cell dry weight was harvested at each timepoint by centrifugation (12,000 ×g, 5 min, 4°C). The used OD-biomass correlation was calculated for each carbon source individually. Cell lysis and preparation were performed as described previously [16]with minor modifications: cell pellet was resuspended in 5 mL 0.9% NaCl ( )洗涤2次，用1/3体积的甲醇(不含利比特醇)、去离子水、氯仿进行代谢物提取，极性相旋转干燥过夜，干燥后的样品于100分钟后复苏μ去离子水。如前所述，从样本中去除铵根[17]。

如Macpherson和Slater所述，焦谷氨酸在转化为谷氨酸后进行了分析[18略加修改。30.μL的无氨样品经旋转干燥后在100℃下分解μL 6 M HCl，然后在95℃下至少孵育1.5 h，并进行中和步骤。然后，将样品旋转干燥，在30分钟内分解μ去离子水。

如前所述，样本由HPLC-FLD进行分析[17]with some modifications to focus on glutamate detection: the mobile phase A was changed to 25 mM sodium acetate (pH 6.5) and the gradient was altered for phase B to 3% for 5.3 min, 3-4% within 0.05 min, 4-7% within 4.65 min, 7-15% within 2 min, 15% for 6 min, 15-25% within 0.5 min, 25% for 1 min, 25-30% within 0.5 min, 30-100% within 1 min, and 100% for 2 min.

焦谷氨酸含量的计算方法如下:未转化样品中的谷氨酸含量由转化后样品中的谷氨酸含量减去。产生的浓度对应于焦谷氨酸的含量。该方法通过测量已知的焦谷氨酸浓度得到证实，并显示出向谷氨酸的定量转换(图S1a-b)。

2.3。粗细胞提取物中焦谷氨酸转化率的监测

Just before the cultures reached maximal optical density, a culture volume corresponding to 10 mg cell dry weight was harvested by centrifugation (12,000 ×g, 5 min, 4°C) and resuspended in 500μL 10 mM HEPES buffer (pH 6.5). Cells were disrupted by sonication thrice with 1 min pulse and 2 min of cooling. Cell debris was removed by centrifugation, and the supernatant was used as crude cell extract. 100μL of crude cell extract was heated at 65°C for 24 h in 10 mM HEPES buffer containing 2.2 mM L-pyroglutamate and 1 mM MgCl_2个添加或不添加14mm ATP (pH 6.5)(总容量为1ml)。作为对照，在加入1mm MgCl的10mm HEPES缓冲液中，将2.2 mM l -焦谷氨酸盐和14mm ATP在65℃下加热24h_2个（pH 6.5）。加热后，用氯仿沉淀蛋白质，离心（20000×g，5 min，4°C）除去蛋白质，分析上清液中谷氨酸和焦谷氨酸的含量。粗细胞提取物的蛋白质浓度根据制造商的说明，使用双辛酸蛋白质测定试剂盒（德国西格玛奥尔德里奇）测定。根据初始焦谷氨酸浓度（细胞粗提物添加焦谷氨酸和焦谷氨酸（CE对照））和培养24小时后焦谷氨酸浓度（CE-/+ATP）之间的差异计算酶活性，并与未添加细胞粗提物的对照（Glp对照）和细胞粗提物蛋白质含量。用细菌滴度Glo定量ATP™ 美国威斯康星州麦迪逊市Promega微生物细胞活力测定。

2.4。5-羟脯氨酸酶候选体的计算分析美国acidocaldarius和S、 索尔法塔里科斯

被使用BLASTP [识别的所有5- oxoprolinase候选的蛋白质序列19的OXP1基因的蛋白序列拟南芥(UniProt: Q9FIZ7) (20.]. 实验证实的5-氧丙烷酶序列来自UniProt数据库[21]，所有序列均用的Clustal欧米茄[对齐22]。利用微生物基因组文脉查看器对候选基因的基因组文脉进行了分析[23]。

3。结果与讨论

3.1。硫化叶菌acidocaldarius在谷氨酸上表现出更快的生长，并使用焦谷氨酸作为唯一的碳源

直接比较它们的生长行为，美国acidocaldarius生长速度快，细胞最大干重比S、 索尔法塔里科斯在相同的栽培条件下对谷氨酸(图)1（甲）；表格1个)。两株菌接种后均在相同的时间内进入指数生长阶段和稳定期。S、 索尔法塔里科斯显示出降低的最大生长速率和吸收速率更低的生物量相关的基板相比美国acidocaldarius（表1个)。当培养物到达静止相时，培养基中含有1-2 mM的谷氨酸，在静止相中完全消耗(图2)1（b）)。

谷氨酸在75°C和pH 3下不稳定[12]，导致焦谷氨酸盐的形成（图1（b）)，反应速率常数为0.0066 h^-1。因此，在培养的过程中Sulfolobaceae在谷氨酸上，在培养基中观察到焦谷氨酸的形成。由于焦谷氨酸在选定的培养条件下是稳定的(图S1B)，减少的内容是消费的结果。两种培养基中检测到的最高焦谷氨酸浓度几乎相同，在48小时时约为6.5 mM(图2)1（b）)。然后，将焦谷氨酸浓度在两种培养物上清液减少。After 48 h, a continuous decrease of glutamate and pyroglutamate was detectable in the supernatant of美国acidocaldarius没有增长的限制。在coutilization开始时，初始浓度谷氨酸的46％仍然是在上清液中检测到。在文化S、 索尔法塔里科斯当谷氨酸浓度为初始浓度的20%时，75 h后，焦谷氨酸浓度持续下降。这种对邻苯二甲酸酯的吸收没有导致进一步的生长增加。在栽培结束时，焦谷氨酸几乎完全被吸收美国acidocaldarius而约4毫米焦谷氨酸仍可在生长培养基中检测到S、 索尔法塔里科斯。在OD组合最大细胞干重和残留的底物_最大，两者产量系数相似(见表)1个在OD)_最大。

S、 索尔法塔里科斯在24毫米焦谷氨酸盐作为唯一碳源和存在14毫米焦谷氨酸盐的情况下根本不生长，既不是作为生长培养物的补充物，也不是作为生长培养物的添加物(图2 (b))。美国acidocaldarius能够在24 mM焦谷氨酸盐上生长（图2(一个)),reaching a maximum cell dry weight of 0.64 g L^-1和a maximum growth rate of 0.055 h^-1within 96 h of cultivation (Table1个)。美国acidocaldarius增长相比谷氨酸上焦谷氨酸较慢（图2(一个)，但细胞最大干重、最大基质吸收速率和产量系数相似(表2)1个)。

如前所述，我们观察到焦谷氨酸在S、 索尔法塔里科斯（图2 (b))。这一效应在之前的其他研究中也有报道[4个,八]。此外，我们证实，在我们的实验装置中，焦谷氨酸盐的生长抑制作用不仅仅是由于可用碳的损失，因为它添加到生长培养物中会导致细胞死亡。然而，帕克和他的同事[4个]提出焦谷氨酸是谷氨酸转运的竞争性抑制剂S、 索尔法塔里科斯。相反，我们的研究结果显示，即使在焦谷氨酸浓度升高的情况下，仍有完整的谷氨酸摄取，这意味着谷氨酸摄取与焦谷氨酸的发生相当独立。此外，这两种代谢物的结构是非常不同的，因此，我们假设这两种代谢物可能被不同的运输系统所占用。对于细菌，有人提出焦谷氨酸盐也可以被动地通过细胞膜扩散[7个在酸性栽培条件下尤其容易发生。

3.2。计算分析表明两者都有Sulfolobaceae至少有一个有希望的候选人为焦谷氨酸降解酶

为了研究这两个物种的焦谷氨酸降解能力，我们决定进行的候选酶的计算分析。唯一在BRENDA [酶发现24]降解焦谷氨酸盐是5-oxoprolinase（EC 3.5.2.9）。该酶催化焦谷氨酸对谷氨酸的ATP依赖性水解。我们选择属于从OXP1基因的蛋白质序列拟南芥作为参考，因为它是研究得最好的真核5- oxoprolinase [20.]. 我们进行了一次爆破搜索以确定美国acidocaldarius和S、 索尔法塔里科斯。确定的6个候选人为Saci_0368, Saci_0369 in美国acidocaldarius，和SSO2008、SSO2010、SSO2934和SSO2936S、 索尔法塔里科斯。每种蛋白与所有序列同一性的长度示于表2个。

基因组背景的进一步研究[23发现所有基因都以基因对的形式出现，编码了蛋白质的两个亚基(图)S2)。与生活的所有三个结构域5 oxoprolinases多重序列比对结果表明，从候选Sulfolobaceae与真核生物的5-羟脯氨酸酶具有高度同源性，序列同源性在29 - 40%之间。我们发现，与来自细菌的候选基因没有令人满意的同源性(最多18%的序列同源性)。然而，真核生物和细菌的5-羟脯氨酸酶分别由一个和三个基因编码。相反，预测的5-羟脯氨酸酶Sulfolobaceae是由两个基因编码的直接基因组背景(图S3)。swis - prot中所有7个古细菌5-羟脯氨酸酶[25[英语泛读材料属于…的成员Euryarchaeota. 它们显示出与Sulfolobaceae49和54％之间的候选者。候选基因SSO2008和SSO2010显示最高的同源性的5 oxoprolinaseMethanocaldococcus球菌（表2个)。此外，它们由两个亚基组成为好。家庭成员才甲烷八叠球菌有一个基因编码的5-氧丙烷酶。不幸的是，没有任何5-氧丙烷酶的晶体结构是已知的；因此，底物结合位点的比较是不可能的。

总之，我们预测美国acidocaldarius有一个功能性的5-羟脯氨酸酶，由两个亚基组成，和S、 索尔法塔里科斯这个酶有两个拷贝。此外，5-羟脯氨酸酶候选Sulfolobaceae比细菌更同源的真核生物。

为了进一步研究预测的5-氧丙烷酶，我们观察了候选基因转录的差异，这些差异可以解释观察到的表型。因此，我们分析了Sulfolobaceae在不同的基底上[26–29]。相比于整个转录的中值的相对表达水平进行比较，以在培养基中的谷氨酸（和相应焦谷氨酸）的存在下，并在表中示出三。虽然培养条件和培养基组成不同的研究中，我们发现谷氨酸在培养基中的存在和表达增强之间的相关性显着的（高达5倍）的5- oxoprolinase候选中美国acidocaldarius[27–29]。与此相反，所有的候选基因的表达S、 索尔法塔里科斯当谷氨酸存在于培养基中时[26]。

3.3。水飞糖浆积累高水平的焦谷氨酸，并显示较低的5-羟脯氨酸酶活性

作为生长行为表明相对于在以后的生长状态所形成的焦谷氨酸盐的使用量的强差，我们进一步研究了两种菌株是否代谢所述被合并的焦谷氨酸。因此，在固定相的细胞内和焦谷氨酸谷氨酸浓度进行了测定。

我们观察到培养结束时细胞内谷氨酸和焦谷氨酸的含量有很大的差异(图)三). 在美国acidocaldarius这两种氨基酸的含量都很低(小于1)μg mg^-1细胞干重）而细胞内谷氨酸浓度是10倍，焦谷氨酸浓度是17倍S、 索尔法塔里科斯. 两种培养物的细胞内焦谷氨酸含量均从72 h下降到120 h，而在144 h时发生了积累。我们预测，细胞到达与停止代谢过程相关的静止期结束，从而导致积累。

对于细胞内焦谷氨酸含量的差异，我们进行了粗细胞提取物的检测，以考察基于焦谷氨酸消耗的酶活性的差异。此外，我们还检测了谷氨酸的形成(表S1)。然而，对谷氨酸生产的定量评估受到粗细胞提取物中其他酶可能进一步转化谷氨酸的阻碍。

我们检测在两种菌株的细胞粗提物5- oxoprolinase活性（图4个)。三磷酸腺苷(ATP)的存在使酶活性显著提高，且三磷酸腺苷粗提液的酶活性提高了1.7倍美国acidocaldarius相比S、 索尔法塔里科斯. 不含细胞粗提物的对照组在ATP存在下未显示焦谷氨酸的自发降解（表S1)。

总之，在美国acidocaldarius结果表明，谷氨酸和焦谷氨酸的检测浓度均明显低于空白对照S、 索尔法塔里科斯，表明代谢过程中的碳源的快速转换。数据表明，焦谷氨酸是较高的负担S、 索尔法塔里科斯比美国acidocaldarius因为它在细胞内累积超过0.7% ( )细胞干重。考虑到微生物通常含有大约3%( )低分子量代谢物[30.，这表示强烈的累积。我们看到细胞内焦谷氨酸水平和生长抑制的同时增强S、 索尔法塔里科斯. 在此背景下，焦谷氨酸作为一种典型的原载体，在质子化过程中具有被动吸收循环，在细胞内浓度相当低的情况下以脱质子化形式主动输出[4个,八我们的数据并不支持。我们显示了一个强大的细胞内积聚在S、 索尔法塔里科斯表明一种积极的能源需求进口没有随后的能源生产分解代谢反应。在细胞内，一种酸的积累可能导致代谢的严重改变，例如，降低蛋白质的稳定性或抑制作用，并可能作为毒性作用的一种解释。最后，进行了粗细胞提取试验，结果显示邻苯二甲酸酯的转化更有效美国acidocaldarius。因此,美国acidocaldarius利用焦谷氨酸作为合成代谢和呼吸的碳源。

4.结论

在这项研究中，我们审查了关于嗜热crenarchaea焦谷氨酸的作用硫化叶菌acidocaldarius和水飞糖浆。在谷氨酸培养过程中，我们观察到谷氨酸自发形成，促进了谷氨酸的生长美国acidocaldarius。对细胞内谷氨酸和焦谷氨酸浓度的分析表明S、 索尔法塔里科斯当达到稳定状态时，两种氨基酸在细胞质中积累的水平都要高得多，而美国acidocaldarius仍然很低。对几个候选基因的计算分析表明，这两株菌株都含有能降解焦谷氨酸的5-羟脯氨酸酶候选基因，但我们在粗细胞提取物中检测到较低的5-羟脯氨酸酶活性S、 索尔法塔里科斯. 我们的数据表明焦谷氨酸是S、 索尔法塔里科斯，因为它会导致在更高浓度下完全抑制生长。这是进一步支持的事实，只有美国acidocaldarius以焦谷氨酸为唯一碳源生长。

据我们所知，以焦谷氨酸为唯一碳源的嗜热酸古菌的生长尚未见报道。这种能力的美国acidocaldarius使其成为高温生物技术应用的一个非常合适的候选者，包括降解富含谷氨酸的培养基，而不会对自发形成的焦谷氨酸产生任何负面影响。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在文章和补充信息文件中。

利益冲突

作者宣称，有兴趣就本文发表任何冲突。

作者的贡献

Anna M. Vetter和Julia Helmecke对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

我们感谢Sabine Kaltenhauser提供的出色技术援助。这项工作是由e:Bio计划、HotSysAPP (031L0078E)资助的。

补充材料

图S1:焦谷氨酸测量程序的评估。(a)符合指定和测量的焦谷氨酸浓度。添加24mm焦谷氨酸后，上清液0 h和24 h的焦谷氨酸含量(见图)2(一个)). （b） 嗜热条件下焦谷氨酸的稳定性。22 mM焦谷氨酸盐在Brock培养基中以75°C和pH 3培养144 h。值代表四个独立培养的平均值，误差条代表标准误差。图S2：来自硫化叶菌acidocaldarius和水飞糖浆。这个数字是使用微生物基因组的状况浏览器创​​建。图S3：从生活的所有三个结构域5 oxoprolinases的多序列比对的指纹。蓝序列名称指示从5 oxoprolinase候选人硫化叶菌acidocaldarius和水飞糖浆. 浅灰色阴影表示非服务区域，蓝色阴影表示30%以上的保护，红色阴影表示类似区域。生物体：BACSU = 枯草芽孢杆菌168年,ECOLI =大肠杆菌K12的METJA =Methanocaldococcus球菌JAL-1 SULAC =硫化叶菌acidocaldariusDSM 639, SULSO =水飞糖浆P2, METBF =巴氏甲烷八叠球菌DSM 804，阿拉斯 = 拟南芥，而HUMAN =智人。表S1:粗细胞提取试验中谷氨酸和焦谷氨酸的含量硫化叶菌acidocaldarius和水飞糖浆. 粗细胞提取物美国acidocaldariusMW001(尚驰)和S、 索尔法塔里科斯将P2 (Sso)与2.2 mM l -焦谷氨酸盐(Glp)在65℃存在和不存在14mm ATP (+ATP/-ATP)的情况下孵育24 h。然后测定谷氨酸(Glu)和焦谷氨酸的含量。值代表四个独立品种的平均值。误差代表四个实验之间的标准误差。（GydF4y2Ba补充材料)

工具书类

1. t.d.b rock, k.m.b rock, r.t. Belly和r.l. Weiss "硫化叶菌：生活在低pH和高温硫氧化细菌的一个新属，”档案毛皮Mikrobiologie卷。84，没有。1，第54-68，1972。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
2. 古细菌属磺草属的表型特征:五种野生型菌株的比较细菌学杂志，第171卷，否。12页，6710-6719,1989。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
3. C. Schiraldi, F. Marulli, I. Di Lernia, A. Martino，和M. De Rosa，“一种微滤生物反应器，用于实现solfataricus发酵中的高细胞密度，”极端微生物卷。3，没有。3，第199-204，1999。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
4. C. B. Park, S. U. N. B. O. K. Lee和D. D. Y. Ryu，“由l -谷氨酸自发形成的l -焦谷氨酸抑制了嗜热菌的生长硫化叶菌”应用与环境微生物学卷。67，没有。8，第3650-3654，2001。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
5. a . Kumar和a . K. Bachhawat， <焦谷氨酸:揭示一种研究较少的代谢物>，当前的科学卷。102，2012。查看在：谷歌学术搜索
6. 刘炳荣，陈嘉敏，“成人患者之焦性谷氨酸血症”，临床化学卷。35，没有。4，第684-686，1989。查看在：谷歌学术搜索
7. Z.羊和T. Suomalainen，“由乳酸菌产生的2-吡咯烷酮-5-羧酸抗菌活性，”食品保护杂志，第60卷，no。7, 786-794页，1997。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
8. C. B.公园，D.D。Y.柳和S. B.李，“关于极端微生物的L-焦谷氨酸的抑制作用：与生长温度和pH的相关性，”《微生物学字母，第221卷，第2期，第187-190页，2003年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
9. 陈文杰，陈文英，“利用啤酒酵母细胞生产食品级酵母提取物”。第一部分:不同的酶处理对固体和蛋白质的恢复和风味特征的影响。生物资源技术，第76卷，第3期，第253-258页，2001年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
10. 《嗜热性极强的嗜热性磺洛巴酸盐在浸没和固化基质培养物中的生长比较研究》，世界微生物和生物技术杂志，第17卷，no。3、第229-234页，2001。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
11. F. J. Sturm, S. A. Hurwitz, J. W. Deming，和R. M. Kelly，《极端嗜热者的成长硫化叶菌acidocaldarius在高压氦生物反应器中生物技术和生物工程，第29卷，no。9、第1066-1074页，1987。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
12. A、 Gayte Sorbier，C.B.Airaudo和P.Armand，“模型系统条件下谷氨酸和味精的稳定性：物理和工艺因素的影响”食品科学杂志，第50卷，no。2、350-352页，1985。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
13. M、 Wagner，M.van Wolferen，A.Wagner等人，“克雷那夏奥特的多功能基因工具箱硫化叶菌acidocaldarius”微生物学前沿，第3卷，第214页，2012年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
14. W. Zillig, K. O. Stetter, S. Wunderl, W. Schulz, H. Priess，和I. Scholz， "磺酰亚砜- " Caldariella "组:基于依赖dna的RNA聚合酶结构的分类，"微生物学档案，第125卷，no。3, 259-269页，1980。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
15. 酒井恒和黑泽明，”Saccharolobus caldissimus11月1日，11月1日，一种从酸性陆地温泉中分离出的兼性厌氧还原铁的嗜热古宙，并对其进行了重新分类硫化叶菌作为水飞糖浆梳子。11月,硫化叶菌shibatae作为Saccharolobus shibatae梳子。十一月，”国际系统和进化微生物学杂志，第68卷，不4、1271-1278页，2018。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
16. 《嗜热酸古菌的热标准》，作者:M. Zaparty, D. Esser, S. Gertig et al.，极端微生物，第14卷第1期1，第119-142，2010。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
17. K. Trautwein, S. E. Will, R. Hulsch等人，“原生质粒限制Phaeobacter inhibens《DSM 17395:质粒的能量成本定量生理分析》环境微生物学，第18卷第2期。2016年第4817-4829页。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
18. H、 麦克弗森和斯莱特γ-氨基-n个-丁酸、天冬氨酸、谷氨酸和吡咯烷酸；它们在保护期间在草中的测定和出现，”生化杂志，第71卷第1期4、1959年第654-660页。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
19. C. Camacho, G. Coulouris, V. Avagyan等人，" BLAST+:架构与应用"，BMC生物信息学卷。10，没有。1，P。421，2009年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
20. Ohkama-Ohtsu, A. Oikawa, P. Zhao, C. Xiang, K. Saito和D. J. Oliverγ通过5-羟脯氨酸谷氨酰谷胱甘肽分解代谢谷氨酸的转-依赖性途径在拟南芥中，”植物生理学，第148卷，no。3、1603-1613页，2008。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
21. UniProt联盟，“UniProt：通用蛋白质知识库”核酸的研究卷。45，没有。D1，第D158-D169，2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
22. 希金斯，“欧米茄晶体，大量序列的精确排列”，发表于多序列比对方法， D.罗素，主编，第1079卷在分子生物学方法（方法和协议），第105-116页，胡玛出版社，托托瓦，美国新泽西州，2014。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
23. L. Overmars, R. Kerkhoven, R. J. Siezen，和C. Francke，“MGcV:用于比较基因组分析的微生物基因组上下文查看器，”BMC基因组学，第14卷第1期1，第209页，2013年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
24. S. Placzek，一朔，A昌等人，“布伦达在2017年：在BRENDA新的视角和新的工具，”核酸的研究，第45卷，第D1号，第D380-D388页，2017年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
25. A.贝罗奇和R. Apweiler“的SWISS-PROT蛋白质序列数据库及其补充TrEMBL中，2000年，”核酸的研究，第28卷，编号1，页45-48,2000。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
26. H.斯塔克，J.狼，A. Albersmeier等人，“在专性好氧生物氧化Stickland反应 - 在Crenarchaeon硫化叶菌氨基酸分解代谢，”2月日报，第284卷13、2078-2095页，2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
27. J.莱曼，D.咝，A. Orell等人，“古细菌的信号转导：蛋白磷酸酶缺失的细胞尺寸，运动性，和能量代谢的影响硫化叶菌acidocaldarius”分子与细胞蛋白质组学，第12卷，no。12，页3908-3923,2013。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
28. O、 Cohen，S.Doron，O.Wurtzel等人，“原核生命树的比较转录组学”核酸的研究卷。44，没有。W1，第W46-W53年，2016年。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
29. J.帕克，A.李，H.-H。李，I.帕克，y.s。和J. Cha，“葡萄糖诱导的嗜酸磺洛巴司琼639的转录谱分析，”基因基因组学，第40卷，no。11、1157-1167页，2018。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
30. Neidhardt J. L. Ingraham和M. Schaechter，细菌细胞的生理学:一种分子方法， Sinauer Associates Inc .， 1990年。

版权

版权所有©2019 Anna M.Vetter等人。这是一篇在知识共享署名许可协议，其允许在任何介质无限制地使用，分发和再现时，所提供的原始工作正确的引用。