从甲醇提取物九里koenigiiL.抑制谷氨酸引起的疼痛，涉及ATP敏感性K⁺通道作为镇痛机制

抽象

九里koenigiiL.是一种多年生灌木，属于芸香科植物。传统上，这种植物的叶子在治疗范围广泛的疾病和病症，包括疼痛和炎症的被广泛使用。虽然研究人员发现这种植物的叶子在过去几年里，镇痛作用，这些潜在作用的机制仍不清楚。因此，本研究中评价的甲醇提取物的一些镇痛机制M. koenigii用几种动物模型的镇痛潜力沿（MEMK）叶。The antinociceptive effects of MEMK were evaluated using formalin-induced licking and acetic acid-induced writhing tests at the doses of 50, 100, and 200 mg/kg. In addition, we also justified the possible participations of glutamatergic system and ATP-sensitive potassium channels in the observed activities. Our results demonstrated that MEMK significantly (）抑制以剂量依赖的方式诱导福尔马林和乙酸的疼痛阈值。MEMK也显著（）抑制谷氨酸 - 诱导的疼痛。更多over, pretreatment with glibenclamide (an ATP-sensitive potassium channel blocker) at 10 mg/kg significantly (）逆转MEMK介导的镇痛作用。这些表明，MEMK可能与谷氨酸系统和ATP敏感性钾通道显示其镇痛活动互动的潜力。因此，我们的研究结果强烈支持的镇痛作用M. koenigii叶提供传统医学的止痛用途的科学依据。

1.简介

九里koenigiiL.紫茎泽兰（家庭：芸香科）是一个小而强的气味多年生灌木，一般生长在东南亚国家和被称为咖喱叶植物。这种植物广泛种植它的叶子，其具有特色风味和香气，被用作民族风味食品[调味品和调味剂1，2]。传统上，这种植物的叶子用于治疗大范围的疾病和病症如疼痛，炎症，瘙痒，癌症，糖尿病，和血液疾病〔1，3]。上一页植物化学筛选揭示了简单的酚酸包括没食子，肉桂酸，单宁酸，咖啡酸，阿魏酸，绿原，和咖喱叶香草酸[一个丰富的个人资料1]。在这些叶子识别精油包括α蒎烯，β水芹烯，（E）石竹烯，α-selinene，十四烷酸，十六烷酸，C桉叶醇，α-muurolol，（Z，E）法呢醇，和（Z，Z）法呢醇[4]。叶子还含有单萜衍生的烃和醇具有抗氧化电位体外[五]。在2013年，中村和马的研究小组分离六个新的咔唑生物碱包括karapinchamines甲乙[6]，N-苄基咔唑-A，N-苄基咔唑-B，异koenidine，并与具有保肝14种其它已知的咔唑生物碱和抗癌性质[沿着异koenigine7]。

随着这种植物化学丰富的个人资料，研究人员还发现了降血脂，抗糖尿病[1]，保肝，止泻，和抗氧化性能[3咖喱叶。虽然它们的镇痛活性有很好的描述[8，9]，行动的机制尚未透露。因此，对于第一次，我们评估了谷氨酸系统的可能参股以及ATP敏感性钾⁺在的甲醇提取物通道M. koenigii- （MEMK-）介导的抗伤害小鼠。此外，我们也有理由MEMK在两个常规疼痛模型的动作包括醋酸诱导扭体和福尔马林引起的舔测试。

2。材料和方法

2.1。植物材料和提取

M. koenigiileaves were collected from Baily Road, Dhaka, Bangladesh, in April 2015. The samples were then identified by Busra Khan, Principle Scientific Officer, Bangladesh National Herbarium, with a voucher number of DACB: 41516. Powdered dried leaves (300 g) were macerated with 500 mL of methanol with occasional stirring for 72 hours at℃的温度。Then the collected filtrate was dried using rotary evaporator and normal air flow, respectively, resulting in 16.50 g of extract (yield: 5.50%). This crude extract was further used for the acute toxicity and antinociceptive activity analysis.

2.2。药品与试剂

双氯芬酸钠和格列本脲是从广场制药有限公司（孟加拉国达卡）购买。甲醇，99％二甲亚砜（DMSO），L-谷氨酸，乙酸，福尔马林和从Merck（达姆施塔特，德国）获得。

2.3。植物化学筛选

的粗甲醇提取物M. koenigii定性测试根据标准协议[检测生物碱，苷，鞣质，碳水化合物，还原糖，黄酮类，和皂苷的存在10]。

2.4。动物

Male Swiss Albino mice of 20–25 g body weight were collected from the Animal Research Branch of the International Center for Diarrheal Disease and Research, Bangladesh (ICDDR,B). Animals were maintained under standard laboratory conditions (maintaining 12 h light/dark cycle,℃的室温，并55-65％相对湿度）与ICDDR，B配制标准饮食和提供干净的水自由采食。将动物保持为实验前14天的实验室环境，将实验前禁食过夜。所有实验动物进行治疗继医学科学院瑞士科学院和瑞士科学院制定了动物伦理原则和准则的科学实验（1995年）。在这项研究中进行的所有方案由斯坦福大学孟加拉国的伦理委员会（SUB /原子能委员会/ 15.07）的批准。

2.5。药物和治疗

Diclofenac sodium (10 mg/kg) was administered intraperitoneally (i.p.) 15 min before the nociceptive stimuli. In all experiments, DMSO (vehicle, 0.1 mL/mouse) or MEMK (50, 100, and 200 mg/kg) were administered orally 30 min prior to the induction of nociception. Moreover, glibenclamide at the dose of 10 mg/kg was given 15 min prior to the standard drug in addition to MEMK to justify the possible involvement of K⁺渠道。

2.6。急性毒性试验

将动物分成所需基团，与含有五只至七个各组动物。MEMK was administered to the animals at the doses of 1000, 2000, and 3000 mg/kg p.o. and animals were observed for any allergic reaction or mortality for next 72 h. In the meantime, they were allowed free access of food and water自由采食[11]。

2.7。福尔马林引起痛觉

所使用的程序类似于先前由桑托斯和了Calixto [描述12]。将动物随机选择用于每个组，并用标准药物或MEMK预处理。60 min after MEMK and 30 min after drug, 20 μ2.5％福尔马林的L向小鼠的右后爪的腹面注入。然后观察动物和和揍注射的爪子的bitings的数字被记录0-5th分钟（神经源性或早期阶段）和福尔马林注射后15-30th分钟期间（炎症或晚期阶段）。

2.8。醋酸引起的扭体试验

Nociception in mice was induced with intraperitoneal injection of 0.6% acetic acid (10 mL/kg) 15 min after the drug and 30 min after MEMK treatments. 5 min after the acetic acid injection, mice were observed and the total number of writhings (abdominal constriction and stretching of hind limb) was counted for 30 min [13]。

2.9。谷氨酸诱导的痛觉

在谷氨酸试验，将小鼠用的提取物或如以上提及的标准药物治疗。30 min after extract and 15 min after drug, 20 μ大号谷氨酸（10 μM /爪）在小鼠的右后爪的足底区注入。Mice were then observed for 15 min and numbers of lickings and bitings of the injected paw were counted as a score of nociception [14]。

2.10。ATP敏感性钾的参与⁺渠道通路

ATP敏感性钾可能参与⁺在MEMK介导的止痛作用信道使用由蒂尔等人先前所描述的方法进行评价。和Perimal等。[15，16]。15 min before the treatment with MEMK (200 mg/kg), animals were treated with glibenclamide (10 mg/kg). Following 30 min of MEMK administration, animals were challenged with i.p. injection of 0.6% acetic acid and immediately placed in a chamber. Then the number of writhings was recorded for 30 min, starting from 5 min after injection.

2.11。统计分析

结果表示为平均值±SEM。使用单向随后Dunnett的方差分析（ANOVA）进行统计分析事后测试使用SPSS软件。ED₅₀值使用GraphPad Prism和数据使用的SigmaPlot软件计算得出。

3。结果与讨论

本研究中评估了疼痛的不同动物模型如福尔马林诱发舔和乙酸诱导的扭体试验MEMK的动作。这项研究还揭示了可能的基础机制，包括谷氨酸能系统的参与以及ATP敏感性K⁺通道在MEMK的镇痛活性。更多over, our study demonstrated that oral administration of MEMK at 1000–3000 mg/kg doses did not produce any allergic reactions, abnormal behavior, and mortality of the animals within 72 h of observation period, revealing its nontoxic profile within our experimental doses tested up to 3000 mg/kg.

据公认，在福尔马林试验的第一阶段中，神经性疼痛是通过P物质和缓激肽的激活介导的。在另一方面，几个胺，包括组胺和五羟色胺，缓激肽和前列腺素的报道后期阶段发挥重要作用，产生炎性疼痛[12]。我们的研究结果表明，MEMK的急性管理显著（）抑制在福尔马林试验的两个阶段的动物的舔行为。The percentages of licking inhibitions were calculated as 15.66, 40.38, and 59.06 in first phase and 10.90, 53.90, and 80.27 in late phase for the doses of 50, 100, and 200 mg/kg, respectively (Figures图1（a）和图1（b））。ED₅₀values were also calculated as 146.40 mg/kg for first phase and 100.70 mg/kg for the late phases. A previously published work reported by Gupta et al. [17]支持这些发现，他们发现的含水提取物M. koenigiiat the doses of 400 and 800 mg/kg inhibited formalin-induced pain in mice. In addition, the intraperitoneal injection of acetic acid causes pH imbalance and the activation of peritoneal resident cells (macrophages and mast cells). This influences an elevated release of several inflammatory mediators such as prostaglandin E2 and TNF-[13]。如图所描绘的2，结果表明，所有剂量MEMK的显著（）抑制与ED乙酸诱导的扭体₅₀value of 77.85 mg/kg. The percentages of writhing inhibitions were calculated as 33.85, 60.22, and 78.68 for 50, 100, and 200 mg/kg doses, respectively. Moreover, the petroleum ether extract and the alkaloid fraction ofM. koenigii叶子也曾经报道有动物扭动着抑制性能[9，18]。因此，我们的研究结果与先前报道的工作非常支持MEMK被赋予了福尔马林诱导和醋酸致痛抑制性质的事实。

为了阐明MEMK的作用的镇痛机制，通过谷氨酸的足底注射诱导的伤害感受进行了测试。谷氨酸是一种兴奋性氨基酸广为人知通过外围，脊髓作用发挥疼痛的感知主要作用，和同时使用N-甲基d天冬氨酸（NMDA）和非NMDA受体[动作脊椎上的网站14]。此外，谷氨酸也被报告给几个诱导促炎介质包括一氧化氮（NO）和在中央和外周神经系统NO相关和花生四烯酸有关的物质[合成和释放19]。我们发现，MEMK显著（）抑制以剂量依赖的方式诱导谷氨酸的有害刺激。The estimated percentages of inhibitions were 48.44, 69.53, and 85.94 for 50, 100, and 200 mg/kg doses, respectively (ED₅₀: 52.76 mg/kg). Besides, the reference drug diclofenac sodium also significantly (）降低了动物占舔抑制的79.30％的疼痛行为（图3）。考虑到上述调查结果，可以认为MEMK的成分可能与谷氨酸系统进行交互，以展示其镇痛活性的潜力。更多over, it was also found that administration of glibenclamide (an ATP-sensitive potassium channel antagonist) at 10 mg/kg alone did not alter the writhing episodes evoked by the injection of 0.6% acetic acid. However, given together with the extract, glibenclamide significantly (）逆转（图MEMK的镇痛作用4）。大量的科学报告表明，格列本脲特异性阻断只有ATP敏感性钾⁺通道，但不影响其他类型的如Ca²⁺激活，并且电压 - 门控钾⁺渠道[15]。因此，结果可能表明，MEMK涉及ATP敏感性钾通道的开口，其允许K的流出⁺离子，从而导致该膜，从而降低了膜兴奋[复极化或超极化16]。

我们的初步的植物化学分析显示生物碱，苷，鞣质，碳水化合物，还原糖，和类黄酮在MEMK存在（表1）。据报道，咖喱叶中分离的咔唑生物碱以及黄酮类化合物具有强力的抗氧化性能[1，20，21]。此外，通常是已知的具有抗氧化性质的化合物通过预防脂质过氧化以及不同炎性介质的合成和释放[以减轻疼痛22]。因此，可以想到的是，植物化学物质存在于提取物中MEMK的所观察到的活动的一部分至少参与。

4。结论

总之，目前的研究结果表明的甲醇提取物的抗伤害行动M. koenigii叶子和提供有关其传统用途为镇痛剂的科学证据。这项研究中还发现了谷氨酸系统以及ATP敏感性钾通道的在MEMK介导的抗感受伤害的可能参与。

泄露

本地址马里兰州莫尼鲁扎曼是昆士兰大学中心疼痛研究，分子生物科学研究所，布里斯班，昆士兰州4072，澳大利亚。

利益争夺

作者希望确认，目前没有已知的竞争此出版物相关的利益，出现了对这项工作，可能影响了它的结果没有显著的资金支持。

作者的贡献

Nushrat Sharmin阿尼和Sudip Chakraborty的同等贡献这项工作。

致谢

作者非常感谢Bidyut Kanti达塔博士，教授，主席，斯坦福大学孟加拉国，他使用实验室设施的许可。

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