Notch信号抑制促进心外膜祖细胞向脂肪细胞分化

摘要

背景．Notch信号通路在心外膜祖细胞(EPCs)向脂肪细胞分化中的作用尚不清楚。目的是研究Notch信号在EPCs向脂肪细胞分化中的作用。方法．冻结的部分C57BL / 6.用J小鼠心脏观察心外膜脂肪组织(EAT)，用遗传谱系法追踪EPCs。将EPCs培养在Notch -1或锯齿状配体的成脂诱导培养基中γ分泌酶抑制剂榫眼。测定脂肪细胞标记物、Notch信号通路和脂肪形成转录因子。结果．小鼠房室沟处有EAT。通过遗传谱系追踪方法，我们发现EPCs是心外膜脂肪细胞的一个来源。EPCs出现脂滴积累，脂肪细胞标志物FABP-4和perilipin-1在成脂诱导下表达上调。通过jaged -1激活Notch信号减弱了EPCs的成脂分化，下调了关键的成脂转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR -γ)，抑制信号转导，促进成脂分化，上调PPAR-γ．当阻塞PPAR -γ然而，抑制了Notch信号传导在促进脂肪生成分化中的作用。结论．EPCs是心外膜脂肪细胞的来源。Notch信号通路下调通过PPAR-促进EPCs向脂肪细胞分化γ．

1.介绍

心外膜脂肪组织(EAT)位于心肌和心外膜之间，覆盖人类心脏表面的四分之三以上，构成人类心脏质量的20% [1］．EAT起缓冲作用，保护冠状动脉免受动脉脉搏波引起的扭转，并在能量受限时向相邻心肌提供能量[1］．EAT不仅含有脂肪细胞，还含有基质细胞和免疫细胞。它分泌大量的细胞因子(包括脂肪因子、白介素和趋化因子)，被认为是一种活跃的内分泌器官[2］．EAT量与冠状动脉疾病、房颤、睡眠呼吸暂停综合征和代谢综合征之间的关系已经得到证实[3.，4］．虽然EAT具有重要的保护作用和病理生理意义，但其起源和扩展的研究甚少。

心外膜是覆盖心脏表面最外层的细胞层。在心脏发育过程中，心外膜祖细胞(EPCs)迁移到心脏外表面形成心外膜[5］．EPCs在小鼠心脏特异表达T-box转录因子(Tbx18)和Wilms肿瘤基因1 (Wt1)。它们在胚胎期通过分泌生长因子和细胞因子影响心肌的发育。此外，EPCs经历上皮-间质转化(EMT)并迁移到心肌，分化为平滑肌细胞和成纤维细胞，这些细胞也可能有分化为内皮细胞和心肌细胞的潜力[6］．最近有几项研究报道，EPCs具有向脂肪细胞分化的能力[7- - - - - -11］．转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR -γ)、胰岛素样生长因子1受体(IGF1-R)、促动素2和心房利钠肽(ANP)调节EPCs成脂分化[7，8，10，11］．

Notch信号通路在调节EPCs的分化和增殖中起重要作用[12，13］．四个Notch受体(Notch-1到4)和五个配体(Jagged-1、Jagged-2、Dll1、Dll3、Dll4)参与信号转导过程。一旦配体与Notch受体结合，它就会被γ-分泌酶，然后形成Notch胞内结构域(NICD) [6］．接下来，NICD进入细胞核，与重组信号结合蛋白J (recombination signal binding protein J, RBP-j)结合，激活hes1、Hey-1、Hey-L等多种靶基因的转录。N-[N-(3,5-二氟苯乙酰- l-丙氨酸)]- s -苯甘氨酸丁基酯γ-分泌酶抑制剂，可阻止Notch受体的切割和NICD的释放。Jagged-1和DAPT调控Notch信号通路，间接决定干细胞的命运[14］．有证据表明Notch信号调节干细胞成脂分化[15- - - - - -17］．然而，Notch信号在EPCs向脂肪细胞分化中的作用尚不清楚。因此，我们在本研究中研究Notch信号通路在EPCs成脂分化中的作用。

2.方法

2．1．老鼠

动物实验符合美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》，并按照重庆医科大学动物研究委员会批准的协议进行。男性和女性C57BL / 6.J小鼠购自重庆医科大学实验动物中心，置于单独通风笼(IVC)条件下饲养。TBX18：CRE.敲入鼠标和R26R^EYFP：2010年1月分别从埃文斯实验室和杰克逊实验室引入了CRE谱系记者鼠标。鼠标系列都是基于C57BL / 6.J小鼠背景。我们穿过Tbx18^Cre鼠标的R26R^EYFP鼠标并获得Tbx18^Cre/ R26R^EYFP双杂合鼠[18］．Tbx18在小鼠心脏EPCs中特异性表达，可用于追踪EPCs在小鼠心脏中的命运Tbx18^Cre/ R26R^EYFP双杂合的老鼠。

2．2.小鼠心外膜祖细胞的分离与培养

原代的分离和培养C57BL / 6.J小鼠心外膜祖细胞(EPCs)以前有描述[6，19］．取胚胎(E)日龄11.5的小鼠，解剖胚胎心室组织。然后，将心室组织置于12孔培养皿中，培养皿表面涂有1%明胶，并覆盖无菌覆盖物。心室组织在37°C和5% CO下培养₂培养基中含有添加10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素链霉素的Dulbecco 's modified Eagle培养基(DMEM)。24小时后，内皮祖细胞从心室组织边缘迁移扩张。然后取出心室组织，EPCs继续生长。

2．3.脂肪形成的诱导

用10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素和链霉素在DMEM中维持EPCs。为诱导成脂分化，细胞在含2μM地塞米松（Sigma，CAT：D1756），0.5mm 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX; SIGMA，CAT：I5879）和10 μg/ml胰岛素(万邦生化药，Cat: U-40)，最多21天。培养基每3天更换一次。

2.4。锯齿状-1，dapt和ppar-γ分别拮抗剂治疗

Notch配体jagged-1肽购自R&D (R&D Systems, Minnesota, USA;猫:599 -詹- 100)。Jagged-1肽在200的浓度下重组μg/ml无菌PBS，按照厂家说明。分别在浓度为100、200、500、1000 ng/ml的培养基中加入jagged-1肽激活Notch信号。N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基- l-丙氨酸)]- s -苯甘氨酸丁酯(DAPT)购自MCE (MedChemExpress, Cat: HY-13027)。DAPT在二甲基亚砜(DMSO)中制备，-20℃保存。为了抑制Notch信号，在浓度为1、2、5、10的培养基中加入DAPTμM. gw9662(美国;Cat: HY-16578)是一种有效的选择性PPAR-γ浓度为10μGW9662的M对PPAR-有抑制作用γ［20.］．以DMSO处理的EPCs作为对照。

2．5．RNA分离与实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)

总RNA从约110⁷细胞与Trizol试剂(Takara, Cat: 9108)根据制造商的说明。反转录PCR:利用Prime Script逆转录酶试剂盒(Takara, Cat: RR047A)将RNA转化为cDNA。逆转录条件为:37℃15 s, 85℃5 s, 4℃4 min。在C1000热循环仪(BioRad)上进行实时定量PCR (qRT-PCR)，条件为:95℃30s, 95℃5 s, 60℃30s, 95℃30s 39个循环。采用比较法计算各样本的mRNA表达水平(ΔδCT)，以GAPDH为内源性对照[21.］．

2．6．免疫荧光

将细胞固定在具有4％PFA的PBS中，20分钟，用PBS洗涤，并与10％山羊血清一起孵育，用于阻断非特异性结合。随后用以下抗体染色细胞：兔抗TBX18（ABCAM，CAT：AB115262），兔抗WT1（ABCAM，CAT：AB180840），兔抗Periipin-1（Abcam，Cat：AB3526），兔抗-FABP4（脂肪酸结合蛋白4; ABCAM，CAT：AB92501），兔抗激活Notch-1（ABCAM，CAT：AB52301），小鼠抗HES-1（Santa，Cat：SC-166410），兔抗 -C / EBP-α(Cell signaling Technology, Cat: 8178T)，兔抗ppar -γ(Cell signaling Technology, Cat: 2435T)，兔抗α-SMA (Abcam, Cat: ab124964)， rabbit anti-Myh11 (Abcam, Cat: ab224804)， mouse anti-Periostin (Santa, Cat: sc-398631)在4°C下保存至少12小时[22.］．然后用cy3标记的山羊抗兔IgG (Proteintech, Cat: SA00009-2)、Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG (Abcam, Cat: ab150079)或fitc标记的山羊抗小鼠IgG (Proteintech, Cat: SA00003-1)在37℃下孵育30分钟，细胞核用4染色 ，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，Beyotime，CAT：C1005）在室温下6分钟。对于冷冻切片，分离小鼠心脏，固定在具有4％PFA的PBS中24小时，在15％蔗糖溶液中脱水12小时，30％左右6小时，嵌入最佳切削温度化合物（OCT）中，并切成10 μ米厚的部分。PBS洗涤切片，10%山羊血清孵育阻断非特异性结合，并用以下抗体染色:rabbit anti-perilipin-1 (Abcam, Cat: ab3526)， rabbit anti-FABP-4 (Abcam, Cat: ab92501)， rabbit anti-activated Notch-1 (Notch-1胞内结构域，NICD) (Abcam, Cat:ab52301)、rabbit anti-Notch-1 (Cell signaling Technology, Cat: 4380T)和rabbit anti-Jagged-1(Cell signaling Technology, Cat: 70109T)在4°C至少12小时。然后用cy3标记的山羊抗兔IgG (Proteintech, Cat: SA00009-2)和Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG (Abcam, Cat: ab150079)在37℃孵育30分钟，细胞核用4染色 ，在室温下6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）6分钟。

2.7。油红O染色

细胞和冰冻组织切片在室温下用4% PFA的PBS固定20分钟，PBS洗涤3次，每次5分钟，60%异丙醇浸润3分钟。细胞和组织切片在室温下用Oil Red O (0.3% in 60%异丙醇)染色30分钟，60%异丙醇洗涤30秒，苏木精染色20秒，自来水洗涤5分钟。

2.8。苏木精和伊红染色

由于脂肪组织会被有机溶剂溶解，组织不能被石蜡包埋。因此，采用冷冻切片进行HE染色。切片用苏木精染色30秒，自来水冲洗5分钟。随后用伊红染色10秒，用自来水冲洗10分钟。

2.9。统计分析

采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。数据表示为 ．两组间的差异用 -测试。用单因素方差分析评估两组以上的差异。值<0.05被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.老鼠吃了，Tbx18⁺EPCs是心外膜脂肪细胞的来源

我们观察不同年龄小鼠的心脏，寻找心外膜脂肪组织(EAT)，包括胚胎11.5天(E11.5)、新生儿和出生后2、4、8周龄小鼠。然而，我们在E11.5、新生儿、2周和4周大的油红O染色小鼠中没有发现EAT(补充图。1)．相反，我们发现8周龄小鼠的EAT位于左右房室沟(图)1(一)-1(d))。我们还通过确定adipocyte特异性标记Perilipin-1来发现吃（图1(e)和1(f))。在小鼠心脏的EPCs中特异性表达了Tbx18, EPCs被标记为最初在小鼠心脏中形成Tbx18^Cre/ R26R^EYFP杂合的老鼠。我们采用遗传谱系追踪的方法来研究心外膜脂肪细胞的来源。结果表明，部分紫杉醇-1⁺和fabp4.⁺脂肪细胞与家族标记物EYFP共定位(图1（G）-1(l))，说明部分心外膜脂肪细胞来源于EPCs。

3.2。胚胎第11.5天EPCS的培养与鉴定EPCS

为了探讨Notch信号在EPCs成脂分化中的作用，我们采用胚胎日(E) 11.5胚胎小鼠心室组织培养EPCs。培养24小时后，可以看到细胞从心室组织边缘向外迁移，呈鹅卵石样形态，并在组织块周围向外扩张(图)2(一个))．细胞继续生长，呈均匀的上皮样形态(图)2 (b)和2 (c))．免疫荧光法检测EPCs特异性标记物Wt1和Tbx18，鉴定原代细胞性质。结果显示，所有细胞均表达EPCs的特异性标记物Tbx18和Wt1(图)2 (d)和2 (e))．综上所述，我们根据细胞形态和特异性标记物确定培养的细胞为EPCs。

3．3．Jagged-1激活而DAPT抑制EPCs的Notch信号

为了确定jagged-1激活Notch信号和DAPT抑制Notch信号的最佳浓度，我们将EPCs分别培养在jagged-1(100、200、500、1000 ng/ml)和DAPT(1、2、5、10)的成脂诱导培养基中μM)两天。确定了Notch信号相关基因Notch-1 ~ -4和靶基因hes1、Hey-1。结果显示，jagged-1处理增强了Notch-1、Notch-2、he -1和Hey-1的mRNA表达水平，jagged-1处理在500 ng/ml时效果最大，而jagged-1处理在1000 ng/ml时没有进一步激活Notch信号(图)3.(一)和3.(b))。在DAPT治疗组，10μM DAPT导致细胞死亡，5 μM DAPT显著抑制Notch信号及其靶基因(图)3.（c）和3.(d))。与mRNA表达一致的是，500 ng/ml jagged-1处理后，EPCs中激活的Notch-1和he -1蛋白水平显著上调，而5 ng/ml时则降低μM DAPT处理(图3.(e)和3.(f))。这些数据表明，500 ng/ml jaged -1激活Notch信号，而5μM DAPT抑制Notch信号，在后续实验中使用。

3．4．Notch信号抑制促进EPCs成脂分化

为了研究Notch信号对EPCs成脂的影响，我们在成脂诱导下用jaged -1激活Notch信号，用DAPT抑制Notch信号。培养7天后，检测脂肪细胞相关蛋白，以评估Notch信号对脂肪形成的影响。jagwed -1处理显著降低脂联素和脂肪酸结合蛋白-4 (FABP-4)的成脂标记物的mRNA表达水平，而DAPT处理增加了脂联素、FABP4和periilipin -1的mRNA表达(图)4(a))。为了验证mRNA的表达结果，我们通过免疫染色检测脂肪细胞标记物FABP-4和perilipin-1。与mRNA表达结果一致的是，锯齿状1处理组FABP4和perilipin-1的比例明显降低，而DAPT处理组FABP4和perilipin-1的比例增加(图)4(b)和4(c))。而油红O染色显示各组培养7、14 d后均无明显脂质积累。在21天的成脂诱导培养后出现脂质积累，DAPT处理组脂质积累增加，而锯齿-1处理组脂质积累减少(图)4(d))。这些结果表明，jagged-1处理减弱了EPCs的成脂分化，而DAPT处理增强了EPCs的成脂分化。

3．5.小鼠心外膜中Notch信号逐渐下调

为了观察小鼠心外膜细胞中Notch信号的动态变化，我们在E11.5、新生儿和出生后2、4、8周龄小鼠心脏中检测了jaged -1、Notch-1和NICD (Notch-1胞内结构域(NICD))。我们发现Jagged-1主要表达于E11.5和新生小鼠的心外膜，但在2、4、8周龄小鼠中不明显(图)5(a))。Notch-1在不同年龄的小鼠心外膜中均持续表达，但在E11.5和新生儿时表达量最高(图5)5(b))。NICD仅在E11.5和新生小鼠中表达，但在出生后2、4、8周龄小鼠心外膜中表达不明显(图)5(c))，与Jagged-1的表达一致。

3.6。Notch信号传导抑制通过PPAR-抑制EPC的脂肪生成分化γ

要了解体外脂肪发生中缺口信号传导的潜在机制，我们确定了母转录因子过氧化物体增殖物激活的受体 -γ(PPAR -γ)和CCAAT/增强子结合蛋白-α（C / EBP-α）脂肪发生。但是，我们没有发现C / EBP的显着差异α(图6(一)和6(c))。有趣的是，我们发现PPAR-γ随着DAPT治疗而增加，同时用锯齿状-1处理减少（图6(b)和6(c))。我们推测Notch信号通过转录因子PPAR-抑制EPCs成脂分化γ．因此，我们使用DAPT来下调陷波信令和PPAR-γ拮抗剂阻断PPAR-的转录作用γ．我们发现了PPAR-γ拮抗剂显著下调FABP4和perilipin-1的表达，并减少脂滴的形成(图)6(d) -6(f))。脂肪细胞相关基因mRNA表达也下调(图)6(g))。

3.7。Notch信号抑制抑制EPCs向平滑肌细胞分化

EPCs在体外具有自发分化为平滑肌细胞和成纤维细胞的能力。为了研究Notch信号对平滑肌细胞和成纤维细胞分化的影响，将EPCs在Jagged-1或DAPT培养基中培养7天。我们发现平滑肌细胞具有特异性标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和肌球蛋白重链11 (Myh11)在jagded -1处理下增加，而在DAPT处理下减少(图)7(一)和7(b))。然而，我们没有发现成纤维细胞特异性标记物骨膜蛋白在组间有显著差异(图)7(c))。

4.讨论

在本研究中，我们发现小鼠的心外膜脂肪组织(EAT)位于房室沟，心外膜祖细胞(EPCs)是心外膜脂肪细胞的来源。EPCs在体外成脂诱导下具有向脂肪细胞分化的潜力。jaged -1上调Notch信号减弱EPCs的成脂性，DAPT抑制Notch信号增强EPCs的成脂性分化。同时Notch信号作为PPAR-的上游γ并通过PPAR-抑制EPCs成脂分化γ．

早期的研究报告称，在常用的实验动物，包括两栖动物、鸟类和啮齿动物中，没有EAT，但最新的研究表明，成年小鼠的EAT位于心房和房室沟[7，8］．我们的研究也证实了EAT位于左、右房室沟，但我们没有在房室沟外发现EAT。EAT在出生后逐渐形成，伴Notch信号下调。心外膜可能是心外膜脂肪细胞的来源，并有助于EAT的形成和扩张。心肌损伤、高脂饮食和ANP触发EPCs成脂过程，促进EPCs向心外膜脂肪细胞分化[8，9］．然而，EPCs产生的心外膜脂肪细胞的比例仍有争议。采用谱系追踪的方法，我们的研究表明心外膜脂肪细胞部分来源于EPCs。

小鼠EPCs已被证明具有多能性，在不同的诱导条件下可以分化为平滑肌细胞和成纤维细胞，甚至软骨细胞和成骨细胞谱系[9］．有报道称小鼠心外膜细胞在体内心肌损伤条件下可分化为心外膜脂肪细胞[9，10］．PPAR -γ、IGF-1R、ANP和prokineticin-2已被证实参与了EPCs的成脂分化[7，8，10，11］．Notch信号通路已被证明在干细胞的细胞增殖和分化中发挥重要作用[23.］．Notch激活抑制原始人类骨髓基质细胞的脂肪生成，甚至驱动小鼠脂肪细胞去分化[16，17］．Notch配体Jagged-1通过上调he -1表达降低3T3-L1前脂肪细胞向脂肪细胞分化。的γ-分泌酶抑制剂DAPT可阻断Notch信号的激活，促进干细胞成脂分化[24.］．到目前为止，Notch信号在EPCs脂肪形成中的作用尚未被研究。在我们的研究中，我们发现EPCs在体外成脂诱导下具有向脂肪细胞分化的潜力。上调Notch信号抑制EPCs成脂分化，下调Notch信号增强EPCs成脂分化。此外，出生后小鼠心脏的Notch信号通路逐渐下调，并伴有EAT的形成。提示Notch信号下调可促进EPCs向心外膜脂肪细胞分化。我们还发现Notch信号的激活促进了EPCs向平滑肌细胞的分化。这些结果表明Notch信号通路影响EPCs的命运。

转录因子核受体PPAR-γ和C / EBP -α被认为是干细胞转化为脂肪细胞的关键，而C/EBP-α充当PPAR-的上游调节因子γ［25.］．PPAR -γ已被证明在脂肪细胞分化中发挥重要作用，被认为是诱导成脂分化的必要和充分的因素[26.，27.］．我们测定了转录因子PPAR-γ和C / EBP -α在EPCs的脂肪形成过程中。我们发现两者表达的C/EBP-α和PPAR -γ仅在成脂诱导下是非常低的。这就是为什么在单独的成脂诱导下没有形成很多脂肪细胞。此外，我们发现Notch信号下调可促进EPCs成脂分化，增强PPAR-γ表达式。当阻塞PPAR -γNotch信号下调的成脂作用消失。这些结果表明Notch信号通过PPAR-调控EPCs的成脂分化γ．Notch信号通路被证实是PPAR-的上游γ［15］．Notch信号上调抑制PPAR-γ表达，反之亦然[28.］．he -1是Notch信号转导的靶基因。既往研究表明，上调hes1可抑制PPAR-的表达γ，防止间充质干细胞的脂肪切分化[15］．在我们的研究中，我们发现hes1的下调伴随着PPAR-的上调γ表达式。这表明PPAR-的转录γ可能受EPCs notch - he -1信号通路调控。研究表明，EAT的增加通过促进纤维化和炎症，有助于冠心病、房颤和心力衰竭的发病机制[29.，30.］．减少EAT的增加可能有助于治疗这些疾病。我们的研究提示Notch信号可能是抑制EAT扩张的一个靶点。

4．1.限制

这项研究有潜在的局限性。首先，我们观察了Notch信号通路在心脏发育过程中的动态变化，但我们并没有下调或上调Notch信号通路来观察EPC在体内成脂分化中的作用。其次，既往研究表明心肌梗死、心肌冻伤、心衰诱导EPCs向心外膜脂肪细胞分化[7- - - - - -10，但我们没有研究病理条件下Notch信号通路的变化及其对EPCs成脂分化的影响。

综上所述，我们证实小鼠有位于房室沟的EAT (EAT)。EPCs在体内外均具有向脂肪细胞分化的潜力。Notch信号通路下调通过PPAR-促进EPCs成脂分化γ．

数据可用性

在本研究中使用和/或分析的数据集可从通讯作者在合理要求。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

QS、JD、XJ、BL设计实验。BL、DW、TX、YL进行实验。BL和DW分析数据BL写的论文。BL, DW, QS对手稿进行了审核和修改。刘斌、王定辉对这项工作贡献相当。

致谢

This work was supported by grants from the National Natural Science Foundation of China (81770251), the National Natural Science Foundation of China Youth Science Fund Project (81800254), the Social Undertakings and People’s Livelihood Protection Technology Innovation of Chongqing Science Commission (cstc2017shmsA130086), and the Chongqing city Yuzhong District Science and Technology Basic and Advanced Research Projects (20170107).

补充材料

图S1:油红O染色显示E11.5，新生儿，产后2周龄和4周龄小鼠左右房室沟均无EAT。EAT:心外膜脂肪组织;艾凡:胚胎。（补充材料）

参考文献

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