MEK抑制目标癌症干细胞和阻碍胰腺癌细胞的迁移在体外和在活的有机体内

文摘

胰腺导管腺癌(PDAC)仍然是一个毁灭性的疾病,预后很差。与此同时,其发病率正在上升,PDAC有望成为2030年癌症死亡的第二大原因。尽管广泛的新的治疗方法,中位总生存期只有6 - 12个月后诊断和5年生存率小于7%。虽然胰腺癌是特别难以治疗,患者通常屈服原发肿瘤的生长,但广泛转移;因此,策略来降低胰腺癌细胞的迁移和转移能力值得密切关注。绝大多数的胰腺癌港RAS突变。优秀的相关性的RAS / MEK / ERK通路在胰腺癌生物学先前已被广泛证实。由于他们的高依赖Ras突变,胰腺癌可能特别敏感Ras抑制剂作用的下游。,我们使用一个胰腺癌转基因小鼠模型和主要胰腺癌细胞来源于这个模型表明小分子MEK抑制剂功能废除癌症干细胞的数量,减少了球面和瀑样的形成能力。此外,我们表明,MEK抑制抑制TGFβ全身epithelial-to-mesenchymal转换和迁移在体外和最终的结果在一个高度显著减少循环肿瘤细胞在小鼠体内。

1。介绍

胰腺导管腺癌(PDAC),已经有一个最致命的恶性肿瘤(目前4在癌症相关的死亡人数),预计将成为第二个最常见的死亡原因,由于2030年恶性肿瘤(1]。这个异常攻击性密不可分胰腺癌的肿瘤生物学和加剧更由于(1)诊断晚期由于缺乏早期症状,(2)明显抵抗治疗,和(3)早期转移扩散。绝大多数(80%)患有胰腺癌诊断阶段,他们不再有资格领取切除(潜在治愈疾病),使化疗成功的至关重要的问题和研究相关性(2]。然而,尽管广泛的努力来改善治疗,中位数生存仍低于预期,即使最成功的治疗方法如FOLFIRINOX(11.1个月)或吉西他滨+ nab-paclitaxel(8.5个月)3,4]。

而抵抗化疗和放疗是胰腺癌的特点之一,早期转移性传播和高转移性负载最终会杀死病人。我们和其他人证实癌症干细胞的存在(CSC)人口在人类胰腺肿瘤(5,6),这是最终负责治疗耐药性的传播也和这些肿瘤的转移性活动5,7- - - - - -9]。

脑转移是一个多因素的过程,涉及epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT),分离的肿瘤细胞从原发肿瘤,迁移,内和外渗,自导,利基市场的形成和增长转移性网站。鼠标乳腺的最近的证据表明,EMT和具备干细胞可能被蛞蝓(Snail2)监管的同时,蜗牛总科的一员转录因子(10]。成功破坏这种信号可能因此导致二者的同时消灭以及废除的迁移/转移性肿瘤细胞。因此,在目前的研究中我们调查详细EMT MEK抑制剂的影响,具备干细胞在初级胰腺癌细胞(干细胞)。

2。材料和方法

2.1。老鼠和主要的细胞系

主要小鼠胰腺癌细胞系生成如前所述[7]。简单地说,从喀斯特PDAC肿瘤切除^{wt / LSL-G12D};Trp53^{loxP / loxP};Ptf1a^{wt / Cre};LSL-tdRFP^{KI /吻};Slug-YFP (KPCRS)小鼠表达一个致癌Kras突变(11),有条件的损失Trp53 [12),一个R26-LSL-tdRFP [13]Cre重组酶的控制下Ptf1a启动子(14系统[],Slug-YFP记者10]。Slug-YFP老鼠慷慨提供的罗伯特·温伯格怀特黑德生物医学研究所,Cambridge, MA。为在活的有机体内治疗,动物收到refametinib (bay86 - 9766)发布之前(15]。原发性肿瘤被剁碎,用胶原酶消化(干细胞技术,07902)。纤维母细胞去除后,附着胰腺癌细胞扩张和培养如前所述9]。PD0325901 0.5μ米(5493细胞)或5μM(8926和9228个细胞),trametinib 0.035μ0.175米(5493)或μ米(8926和9228细胞)除非另有说明。TGFβ在10纳米。

2.2。球体形成分析

球被培养为前面描述的(5在DMEM-F12(热费希尔科学,10565018)补充B-27(热费舍尔,17504044)和基本成纤维细胞生长因子(Novoprotein CO46)。后三天的PD0325901治疗,每毫升10000个细胞被播种在超低附件板(康宁,3473)。经过7天的孵化, > 120μm是量化使用卡西TT(泛光灯生命科学,5651697)。

2.3。瀑样的文化

5000单个细胞从老鼠主要贴壁细胞培养25μ肾小球滤过率(GFR) l培养基混合等量的基底膜基质(生长因子减少,康宁公司)。的培养基被描述16]。MEK抑制剂进行治疗第一天连续3天或4天。每天媒介改变了。新陈代谢活跃细胞测定CellTiter-Glo发光细胞生存能力分析(Promega G9681)根据制造商的指示。

2.4。刮伤化验

细胞生长confluency然后serum-starved 24小时之前使用无菌10抓伤了μl吸管小费。随后,细胞培养介质包含车辆或PD0325901 24小时。图像被抓获后24小时,量化使用ImageJ(1.49版本,https://imagej.nih.gov/ij/)。

2.5。迁移分析

迁移进行了分析使用插入和8μ米孔隙大小PET膜(康宁,353097)。 细胞在无血清培养基添加到插入。在底部,媒体包含10%的边后卫补充道。24小时后,入侵细胞被固定为4% PFA和DAPI染色(默克公司,10236276001)。10个随机大功率领域选择和拍摄,照片是使用ImageJ量化。

2.6。流式细胞术

流式细胞术分析使用LSR II (BD)。使用DAPI死细胞被排除在外。膜联蛋白V染色进行使用BD膜联蛋白V APC装备根据制造商的指示(BD, 550474)。识别和量化的循环肿瘤细胞在小鼠的血液,算珠(热费希尔科学、C36950)被添加到全血从右心室吸气。红细胞裂解后,样本染色EpCAM-APC抗体(热费希尔)或一个适当的控制(BD)同形像。细胞和珠子的数量在最后的样本记录,和原样品细胞的总量进行了计算。数据分析使用FlowJo v10(亚什兰或)。

2.7。蛋白质样品制备和免疫印迹

细胞细胞溶解在冰冷的里帕缓冲区(细胞信号,9806年代)补充PhosSTOp™(默克公司,4906845001)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(默克公司,11836170001)。对于每一个样本,等量的蛋白质SDS-polyacrylamide凝胶应用于12%和免疫印迹到PVDF膜(通用电气医疗集团,10600021)。膜被封锁了2小时在1 x TBST 5% BSA,探测和显示主要抗体(钙粘蛋白、波形蛋白、phospho-ERK ERK,鼻涕虫,和Gapdh)一夜之间在4°C,用1 x TBST洗净、孵化和一只山羊anti-rabbit IgG-HRP二级抗体(向量实验室、ba - 1000)为2小时。化学发光检测执行根据制造商的指示(默克,WBKLS0500)。

2.8。免疫荧光

如果染色,细胞培养在盖玻片(赫克特Assistent 41001115),然后用4%固定PFA(σ),用1 x PBST (PBS 0.3% Triton x - 100),在室温下和阻塞1 h与屏蔽解决方案(10%山羊血清和0.3% Triton x - 100在PBS)。anti-E-cadherin主要抗体(细胞信号)是稀释在屏蔽解决方案和孵化o在4°C / n,而二级抗体(Alexa萤石488山羊anti-rabbit,英杰公司)被稀释在阻止溶液在室温下和孵化2 h。都是用1 x PBST耐洗。最后洗后,盖玻片被安装与DAPI延长黄金不变色试剂(表达载体)和图像被使用BioRevo荧光显微镜(日本基恩士)。

2.9。MTT试验

1000个细胞被播种在96孔板和孵化24小时在37°C。后48 h PD0325901治疗,细胞培养3 h和5毫克/毫升MTT(默克,M2128)。最后,DMSO(罗斯,A994)补充道,与光密度测量在560 nm使用无限200 PRO板读者(Tecan、瑞士)。

2.10。RNAseq

RNAseq实验,主要短期培养细胞系来自PDAC Ptf1a^{wt / Cre},喀斯特^{wt / LSL-G12D};Trp53^{loxP / loxP}(CKP)动物17)在标准培养细胞培养菜肴和对待各自的IC₅₀trametinib浓度(4细胞系,IC₅₀从8-25海里)。48小时后,利用麦克斯韦®RSC simplyRNA细胞分离出RNA工具包(Promega)根据制造商的指示。RNAseq是由CeGaT(德国图宾根)。图书馆准备与执行TruSeq滞留mRNA工具包(Illumina公司),和2 x 100 bp测序HiSeq 4000 (Illumina公司)。多路分解的执行顺序读取Illumina公司树薯粉(2.17)。适配器是修剪针(0.1.116版)(江et al . 2014年)。使用quasimapping RNAseq数据量化方法的鲑鱼18]。TXImport [19]和DESeq2 [20.)被用来导入转录水平数和微分表达式进行分析。

2.11。RNA隔离和实时PCR

总RNA制备使用RNeasy工具包和列基因组DNA消化后,制造商的指令(试剂盒)。第一链cDNA准备使用QuantiTect逆转录工具包(试剂盒)。反应进行的正序连赢SYBR绿色FastMix PCR试剂(量子)使用QuantStudio 3机(应用生物系统公司)。使用2的结果进行了分析^-ddCt方法相对于YWHAZ表达式。反应进行了从至少三个独立的实验。引物序列提供了补充信息。

2.12。统计分析

结果提出了连续变量 除非另有规定。使用Mann-Whitney治疗组进行比较测试除非另有规定。值< 0.05被认为是具有统计学意义。统计分析使用GraphPad Prism 5.0 (CA)圣地亚哥。

3所示。结果

3.1。MEK小鼠PDAC细胞的生长抑制妥协

我们第一次评估的影响小分子MEK抑制剂以初级细胞系来源于PD0325901 KPCRS老鼠。MTT检测显示存在剂量依赖的相关性对MEK抑制利用的主要细胞,展示其依赖功能RAS-RAF-MEK-ERK通路。有趣的是,不同的细胞显示变量响应PD0325901(图1(一))。进一步的实验与每个细胞株进行使用PD0325901浓度略高于相应的集成电路₅₀。我们能够证明在使用浓度下,没有明显的细胞凋亡和细胞死亡的变化被发现在两个细胞系(图72 h后治疗1 (b)增刊,无花果。1)。此外,我们发现ERK的磷酸化,MEK下游目标,要废除MEK抑制剂治疗后,确认化合物的有效性在我们的模型系统(图1 (c))。

3.2。MEK抑制减少迁移剂量依赖性的方式

早期胰腺癌的特点是转移性传播通过增加细胞迁移特性。为了描绘MEK信号在细胞迁移的作用,我们进行了刮伤化验在三个主要的肿瘤细胞系。MEK抑制导致显著降低(即“伤口关闭”。在所有主要的细胞系,迁移能力)。减少的迁徙活动显然是存在剂量依赖的相关性(图1 (d)代表两个细胞系增刊的照片。无花果。1 b)。因为刮伤化验是容易出错的由于扩散的影响,我们使用更可靠Transwell迁移分析进一步调查MEK抑制对细胞迁移的影响。与PD0325901预处理后,显著减少移民观察(图1 (e))。这些结果表明,MEK信号PDAC细胞的迁徙活动至关重要。

3.3。MEK抑制切除TGFβ全身的EMT

转化生长因子β(TGFβ)促进肿瘤进展的晚期癌症诱导肿瘤的生长阶段,但最重要的是通过激活EMT诱导转移,导致增加入侵和转移(21)通过upregulation转录因子如锌指蛋白蜗牛和蛞蝓(22]。我们在这项研究中使用的细胞系是原发肿瘤细胞来源于鼠标模型自发发展转移PDAC和报告胰腺和pancreas-derived细胞通过Ptf1a-mediated RFP表达式和报告蛞蝓活动通过YFP表达式。鉴于TGF的重要作用β在EMT感应和随后的转移,我们怀疑MEK抑制可能废除一个活跃的EMT计划,由TGFβ。因此我们对待TGF的细胞β3 - 6天(实验概述图2(一个))。PD0325901添加后3天的预处理。

然后我们衡量治疗效果蛞蝓和波形蛋白免疫印迹,TGF后强烈的调节β治疗。事实上,随后MEK抑制大大减少鼻涕虫蛋白质水平(图2 (b))。有趣的是,MEK抑制无法克服连续TGF的影响β刺激。此外,我们利用了Slug-YFP记者系统在我们的细胞:TGFβ治疗导致显著诱导EMT就是明证健壮Slug-YFP表达式,即。,高RFP的增加⁺YFP⁺细胞(图3天,6天之后2 (c))。有趣的是,MEK抑制与这个RFP PD0325901显著减少⁺YFP⁺经过3天的TGF人口的近50%β治疗;然而,通过匹配观察在西方墨点法,MEK抑制无法废除连续TGF的影响β治疗。

与前面的实验,免疫荧光染色上皮TGF时显示β治疗抑制钙治疗PD0325901导致reexpression钙表明诱导上皮细胞表型(图2(d))。

总之,上面的在体外结果表明,药物抑制MEK抑制TGFβ全身的EMT和迁移在体外。

3.4。MEK抑制剂治疗胰腺癌干细胞

增加迁移和入侵被EMT关键功能提升,这反过来,具备干细胞已被证明也赋予属性(10]。因此,我们调查与多能性相关基因的表达和具备干细胞治疗。事实上,我们观察到在差别明显对这些Sox9,Sox2,CD44,Sca1贴壁细胞培养(图3(一个))。球文化丰富的癌症干细胞,即。,tumor cells with stem cell-like features, which show unlimited self-renewal and are resistant to chemotherapeutics [5]。即使在3 d球体文化,我们观察到类似的,尽管不那么明显的影响PD0325901 stemness-associated基因在单层文化(图3 (b))。治疗与临床相关的MEK抑制剂trametinib stemness-associated的差别也导致重大对这些基因(图3 (c))。为了推广我们的方法更主要的细胞系,我们4日RNAseq执行额外trametinib——与vehicle-treated KPC-derived主要鼠标细胞系。后续的差别分析显示对这些Nanog,Sox9,Klf4(图3 (d)),匹配中存在的数据集。

为了阐明功能性MEK抑制对二者的影响,我们进行了球体形成72 h后化验与PD0325901预处理。球体形成的数量显著降低MEK抑制后,和治疗后形成的球体的大小被发现特别是vehicle-treated控制(数据相比较小3 (e)和3 (f))。

3.5。MEK抑制剂防止瀑样形成和减少ctc在活的有机体内

3 d瀑样文化是一种生理细胞培养模型比二维单层文化和更好地反映在活的有机体内通过保持细胞间信号条件。因此,瀑样更好的概括原始肿瘤和更好的预测治疗反应比单层文化(23]。因此,我们从我们的主要文化生成的3 d瀑样细胞系和瀑样执行形成和治疗实验在体外(图4(一))。正如预期的那样,我们观察到显著降低瀑样形成和MEK抑制治疗。这适用于瀑样的形成与PD0325901或trametinib(图接受治疗4(一)),以及治疗已经建立了瀑样(图4 (b))。

作为一个功能在活的有机体内读出MEK抑制剂的功效PDAC细胞迁移,我们量化ctc KPC小鼠接受另一个clinical-grade MEK抑制剂,refametinib。Refametinib是一个强有力的MEK1/2抑制剂有益治疗胰腺癌患者(24]。为此,我们提取的血液从右心室的CKP小鼠与refametinib或车辆控制(详细的实验设置中,肿瘤的生长数据和成像的原发肿瘤已经被发表在15])。在协议在体外数据,我们观察到显著减少血液的ctc这些老鼠refametinib治疗后(图4 (c))。

4所示。讨论

使用主要癌症细胞来源于转基因小鼠自发发展PDAC,我们在具备干细胞研究MEK抑制的影响,移民和循环肿瘤细胞。PD0325901-mediated MEK抑制在体外破坏细胞的生长和存活。这并不奇怪,因为MEK抑制已经描述了诱导内在凋亡通路在不同的上下文中(25- - - - - -28]。然而,在我们的研究中,细胞是可行的治疗后,显示细胞凋亡方面无显著差异。排除偏见由于扩散的劣势,我们进行后续迁移和球体形成实验匹配预处理后,细胞数量,从而确保平等的起点对于细胞的数量在每一个条件。

MEK抑制在体外PDAC细胞的入侵和迁移能力受损。从力学上看,我们表明,这些影响是通过抑制TGF介导β全身的EMT,在开发过程中起着至关重要的作用,调节在纤维化等病理条件和成人肿瘤恶化(了29日])。EMT也调节许多下游分子对细胞的生存至关重要,细胞周期进程和上皮完整性(30.- - - - - -32]。具体来说,损失的上皮和信息粘附分子钙粘蛋白被认为是EMT的标志,更容易入侵和转移(了33])。

MAPK通路已被证明开EMT-related转录因子的表达,特别是蜗牛总科的成员在开发过程中(34,35],纤维化[36),和癌症进展和迁移37]。此外,它与其他蛋白质的TGF合作β家庭,启动和维护EMT在不同的上下文中(了38])。重要的是,TGFβupregulation经常被报道在人类癌(了21]);然而,一个清晰的MEK活动和迁移和侵袭性表型之间的关系在PDAC没有描述到目前为止。在这里,我们表明,MAPK信号通路,通过MEK表演,赋予入侵特性的细胞通过调节转录因子蛞蝓。有趣的是,然而,MEK抑制不能克服TGF持续的影响β激活EMT,表明这两个途径,虽然能够合作,通过不同的下游效应器或者补偿反馈循环机制发挥相关作用。

重要的是,激活MAPK信号组件可以赋予具备干细胞特性细胞(7,39]。最新进展在理解PDAC进展导致了二者的鉴别我们(5)和其他(6]。这些细胞癌细胞的特性通常代表一个群与干细胞相关,如无限的自我更新。这些细胞还负责肿瘤进展和治疗抵抗,但最重要的是,通过二者迁移人口,他们为转移性传播(综述[是不可或缺的40])。对人类胰腺癌,不同标记或标记集的识别提出了二者(5,6,41]。同样,没有统一的标记设置为确定二者在老鼠身上已经发表至今,虽然几个候选人表面标记(或组合)提出了42- - - - - -44]。因此,二者需要确认操作,使球体形成和集落形成分析二者的识别有价值的工具。在这里,我们表明,MEK抑制功能抑制CSC的人群就是明证显著降低球体形成能力,代孕CSC活动的标志。因为我们不观察不具体的细胞毒性,该研究中的数据表明,二者更MEK-dependent比一般的细胞群。这是通过观察进一步证实,具备干细胞明显下调,pluripotency-associated标记在MEK抑制剂治疗。

治疗效果的调查主要瀑样文化是一个非常有前途的方法来确定治疗功效在更多的生理环境。这里,3 d的单层细胞,而不是治疗,治疗期间给信用信息交互和旁分泌信号。尽管这种方法已被证明预测治疗反应(23,45),确定影响其有效性CSC人口还没有被证明。我们在这里证明的能力主要PDAC肿瘤细胞形成球体和MEK抑制下瀑样被破坏,建议减少他们的肿瘤起源的潜力。我们也获得了类似的结果在治疗时已形成瀑样,进一步验证我们的在体外数据和这个设置为药物测试的有效性。

激活Kras突变促进增殖和生存通过英国皇家空军/ MEK / ERK和PIK3 / AKT通路。喀斯特^G12D突变,调查在我们的研究中,是最常见的突变在胰腺癌46),但由于Ras蛋白的固有性质,Ras抑制并没有导致相关的临床效益尽管盛行的Ras突变胰腺癌。因此,治疗方法设计开发了专门针对下游效应器(了47])。MEK抑制剂已经得到太多的关注,因为它们能够减少在动物模型肿瘤形成,尤其是在胰腺癌(15]。这里,我们首次展示MEK抑制也显著减少二者的数量,瀑样,循环肿瘤细胞(ctc)在活的有机体内。尽管CTC数据不一定直接与病人的转移负荷相关联,他们是一个强有力的预后指标(48]。从原发肿瘤大小显著降低refametinib治疗(先前发表在15]),观察到影响CTC号码(至少部分)也可能是由于减少肿瘤大小。然而,Slug-expressing细胞的显著减少在体外表明强烈的TGF抑制β全身的EMT MEK抑制,进而会导致ctc的废除。这提供了一个可能的机制MEK可以发挥它的功能促进生存,迁移,入侵,具备干细胞,CTC启动,导致PDAC MEK的相关性和MEK抑制剂的治疗选项。

到目前为止,使用几个MEK抑制剂的临床试验显示可怜的生物利用度,高毒性和/或抗肿瘤活性低,可能由于电阻的快速发展。正在进行的临床试验和新开发的MEK抑制剂单独或结合其他疗法已被证明是更有效(了49,50])。因此,MEK抑制连同其他相关途径,比如TGFβ,可能仍然是有前途的治疗PDAC,特别是结合化疗,应该进一步评估。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者没有利益冲突。

作者的贡献

Karolin沃尔特和Kanishka Tiwary贡献同样这项工作。

确认

我们感激地承认Pierre-Olivier Frappart瀑样的支持在一代文化,我们感谢Andrea Wiβmann优秀的技术支持。P.C.H.支持德国癌症的马克斯•埃德尔奖学金援助由赫克托(111746)和癌症研究基金会授予(M65.1)。P.C.H.和J.M.支持协作研究中心授予德国研究基金会(316249678 - 1279年sfb)。J.T.S.支持欧盟第七框架计划研究、技术开发和示范(FP7 / CAM-PaC之下)根据授权协议。602783年,德国癌症协会(DKTK)和德意志Forschungsgemeinschaft (DFG);KFO337 / SI 1549/3-1)。“狗屁”,Jr., was funded by a Rámon y Cajal Merit Award from the Ministerio de Economía y Competitividad, Spain, and a coordinated grant from the Fundación Asociación Española Contra el Cáncer (AECC, GC16173694BARB).

补充材料

增刊。信息:引物序列,利用抗体。补充图1:(A)在8926个细胞凋亡诱导MEK抑制剂治疗以膜联蛋白V染色和流式细胞术分析。(B) 5493年和8926年代表显微图抓伤口的细胞实验(0 h)和24小时后测量进行分析。(补充材料)

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