主要小鼠胰腺癌细胞系生成如前所述[ 7]。简单地说,从喀斯特PDAC肿瘤切除^{wt / LSL-G12D};Trp53^{loxP / loxP};Ptf1a^{wt / Cre};LSL-tdRFP^{KI /吻};Slug-YFP (KPCRS)小鼠表达一个致癌Kras突变( 11),有条件的损失Trp53 [ 12),一个R26-LSL-tdRFP [ 13]Cre重组酶的控制下Ptf1a启动子( 14系统[],Slug-YFP记者 10]。Slug-YFP老鼠慷慨提供的罗伯特·温伯格怀特黑德生物医学研究所,Cambridge, MA。为 在活的有机体内治疗,动物收到refametinib (bay86 - 9766)发布之前( 15]。原发性肿瘤被剁碎,用胶原酶消化(干细胞技术,07902)。纤维母细胞去除后,附着胰腺癌细胞扩张和培养如前所述 9]。PD0325901 0.5 μ米(5493细胞)或5 μM(8926和9228个细胞),trametinib 0.035 μ0.175米(5493)或 μ米(8926和9228细胞)除非另有说明。TGF β在10纳米。

球被培养为前面描述的( 5在DMEM-F12(热费希尔科学,10565018)补充B-27(热费舍尔,17504044)和基本成纤维细胞生长因子(Novoprotein CO46)。后三天的PD0325901治疗,每毫升10000个细胞被播种在超低附件板(康宁,3473)。经过7天的孵化, 球体 > 40 μ 米 > 120 μm是量化使用卡西TT(泛光灯生命科学,5651697)。

5000单个细胞从老鼠主要贴壁细胞培养25 μ肾小球滤过率(GFR) l培养基混合等量的基底膜基质(生长因子减少,康宁公司)。的培养基被描述 16]。MEK抑制剂进行治疗第一天连续3天或4天。每天媒介改变了。新陈代谢活跃细胞测定CellTiter-Glo发光细胞生存能力分析(Promega G9681)根据制造商的指示。

细胞生长confluency然后serum-starved 24小时之前使用无菌10抓伤了 μl吸管小费。随后,细胞培养介质包含车辆或PD0325901 24小时。图像被抓获后24小时,量化使用ImageJ(1.49版本, https://imagej.nih.gov/ij/)。

迁移进行了分析使用插入和8 μ米孔隙大小PET膜(康宁,353097)。 5 × 10 4 细胞在无血清培养基添加到插入。在底部,媒体包含10%的边后卫补充道。24小时后,入侵细胞被固定为4% PFA和DAPI染色(默克公司,10236276001)。10个随机大功率领域选择和拍摄,照片是使用ImageJ量化。

流式细胞术分析使用LSR II (BD)。使用DAPI死细胞被排除在外。膜联蛋白V染色进行使用BD膜联蛋白V APC装备根据制造商的指示(BD, 550474)。识别和量化的循环肿瘤细胞在小鼠的血液,算珠(热费希尔科学、C36950)被添加到全血从右心室吸气。红细胞裂解后,样本染色EpCAM-APC抗体(热费希尔)或一个适当的控制(BD)同形像。细胞和珠子的数量在最后的样本记录,和原样品细胞的总量进行了计算。数据分析使用FlowJo v10(亚什兰或)。

细胞细胞溶解在冰冷的里帕缓冲区(细胞信号,9806年代)补充PhosSTOp™(默克公司,4906845001)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(默克公司,11836170001)。对于每一个样本,等量的蛋白质SDS-polyacrylamide凝胶应用于12%和免疫印迹到PVDF膜(通用电气医疗集团,10600021)。膜被封锁了2小时在1 x TBST 5% BSA,探测和显示主要抗体(钙粘蛋白、波形蛋白、phospho-ERK ERK,鼻涕虫,和Gapdh)一夜之间在4°C,用1 x TBST洗净、孵化和一只山羊anti-rabbit IgG-HRP二级抗体(向量实验室、ba - 1000)为2小时。化学发光检测执行根据制造商的指示(默克,WBKLS0500)。

如果染色,细胞培养在盖玻片(赫克特Assistent 41001115),然后用4%固定PFA(σ),用1 x PBST (PBS 0.3% Triton x - 100),在室温下和阻塞1 h与屏蔽解决方案(10%山羊血清和0.3% Triton x - 100在PBS)。anti-E-cadherin主要抗体(细胞信号)是稀释在屏蔽解决方案和孵化o在4°C / n,而二级抗体(Alexa萤石488山羊anti-rabbit,英杰公司)被稀释在阻止溶液在室温下和孵化2 h。都是用1 x PBST耐洗。最后洗后,盖玻片被安装与DAPI延长黄金不变色试剂(表达载体)和图像被使用BioRevo荧光显微镜(日本基恩士)。

1000个细胞被播种在96孔板和孵化24小时在37°C。后48 h PD0325901治疗,细胞培养3 h和5毫克/毫升MTT(默克,M2128)。最后,DMSO(罗斯,A994)补充道,与光密度测量在560 nm使用无限200 PRO板读者(Tecan、瑞士)。

RNAseq实验,主要短期培养细胞系来自PDAC Ptf1a^{wt / Cre},喀斯特^{wt / LSL-G12D};Trp53^{loxP / loxP}(CKP)动物 17)在标准培养细胞培养菜肴和对待各自的IC₅₀trametinib浓度(4细胞系,IC₅₀从8-25海里)。48小时后,利用麦克斯韦®RSC simplyRNA细胞分离出RNA工具包(Promega)根据制造商的指示。RNAseq是由CeGaT(德国图宾根)。图书馆准备与执行TruSeq滞留mRNA工具包(Illumina公司),和2 x 100 bp测序HiSeq 4000 (Illumina公司)。多路分解的执行顺序读取Illumina公司树薯粉(2.17)。适配器是修剪针(0.1.116版)(江et al . 2014年)。使用quasimapping RNAseq数据量化方法的鲑鱼 18]。TXImport [ 19]和DESeq2 [ 20.)被用来导入转录水平数和微分表达式进行分析。

总RNA制备使用RNeasy工具包和列基因组DNA消化后,制造商的指令(试剂盒)。第一链cDNA准备使用QuantiTect逆转录工具包(试剂盒)。反应进行的正序连赢SYBR绿色FastMix PCR试剂(量子)使用QuantStudio 3机(应用生物系统公司)。使用2的结果进行了分析^-ddCt方法相对于 YWHAZ表达式。反应进行了从至少三个独立的实验。引物序列提供了补充信息。

结果提出了连续变量 意味着 ± 扫描电镜 除非另有规定。使用Mann-Whitney治疗组进行比较 U 测试除非另有规定。 P 值< 0.05被认为是具有统计学意义。统计分析使用GraphPad Prism 5.0 (CA)圣地亚哥。

我们第一次评估的影响小分子MEK抑制剂以初级细胞系来源于PD0325901 KPCRS老鼠。MTT检测显示存在剂量依赖的相关性对MEK抑制利用的主要细胞,展示其依赖功能RAS-RAF-MEK-ERK通路。有趣的是,不同的细胞显示变量响应PD0325901(图 1(一))。进一步的实验与每个细胞株进行使用PD0325901浓度略高于相应的集成电路₅₀。我们能够证明在使用浓度下,没有明显的细胞凋亡和细胞死亡的变化被发现在两个细胞系(图72 h后治疗 1 (b)增刊,无花果。 1)。此外,我们发现ERK的磷酸化,MEK下游目标,要废除MEK抑制剂治疗后,确认化合物的有效性在我们的模型系统(图 1 (c))。

早期胰腺癌的特点是转移性传播通过增加细胞迁移特性。为了描绘MEK信号在细胞迁移的作用,我们进行了刮伤化验在三个主要的肿瘤细胞系。MEK抑制导致显著降低(即“伤口关闭”。在所有主要的细胞系,迁移能力)。减少的迁徙活动显然是存在剂量依赖的相关性(图 1 (d)代表两个细胞系增刊的照片。无花果。 1 b)。因为刮伤化验是容易出错的由于扩散的影响,我们使用更可靠Transwell迁移分析进一步调查MEK抑制对细胞迁移的影响。与PD0325901预处理后,显著减少移民观察(图 1 (e))。这些结果表明,MEK信号PDAC细胞的迁徙活动至关重要。

转化生长因子β(TGF β)促进肿瘤进展的晚期癌症诱导肿瘤的生长阶段,但最重要的是通过激活EMT诱导转移,导致增加入侵和转移( 21)通过upregulation转录因子如锌指蛋白蜗牛和蛞蝓( 22]。我们在这项研究中使用的细胞系是原发肿瘤细胞来源于鼠标模型自发发展转移PDAC和报告胰腺和pancreas-derived细胞通过Ptf1a-mediated RFP表达式和报告蛞蝓活动通过YFP表达式。鉴于TGF的重要作用 β在EMT感应和随后的转移,我们怀疑MEK抑制可能废除一个活跃的EMT计划,由TGF β。因此我们对待TGF的细胞 β3 - 6天(实验概述图 2(一个))。PD0325901添加后3天的预处理。

然后我们衡量治疗效果蛞蝓和波形蛋白免疫印迹,TGF后强烈的调节 β治疗。事实上,随后MEK抑制大大减少鼻涕虫蛋白质水平(图 2 (b))。有趣的是,MEK抑制无法克服连续TGF的影响 β刺激。此外,我们利用了Slug-YFP记者系统在我们的细胞:TGF β治疗导致显著诱导EMT就是明证健壮Slug-YFP表达式,即。,高RFP的增加⁺YFP⁺细胞(图3天,6天之后 2 (c))。有趣的是,MEK抑制与这个RFP PD0325901显著减少⁺YFP⁺经过3天的TGF人口的近50% β治疗;然而,通过匹配观察在西方墨点法,MEK抑制无法废除连续TGF的影响 β治疗。

与前面的实验,免疫荧光染色上皮TGF时显示 β治疗抑制钙治疗PD0325901导致reexpression钙表明诱导上皮细胞表型(图 2(d))。

总之,上面的 在体外结果表明,药物抑制MEK抑制TGF β全身的EMT和迁移 在体外。

增加迁移和入侵被EMT关键功能提升,这反过来,具备干细胞已被证明也赋予属性( 10]。因此,我们调查与多能性相关基因的表达和具备干细胞治疗。事实上,我们观察到在差别明显对这些 Sox9, Sox2, CD44, Sca1贴壁细胞培养(图 3(一个))。球文化丰富的癌症干细胞,即。,tumor cells with stem cell-like features, which show unlimited self-renewal and are resistant to chemotherapeutics [ 5]。即使在3 d球体文化,我们观察到类似的,尽管不那么明显的影响PD0325901 stemness-associated基因在单层文化(图 3 (b)) 。治疗与临床相关的MEK抑制剂trametinib stemness-associated的差别也导致重大对这些基因(图 3 (c))。为了推广我们的方法更主要的细胞系,我们4日RNAseq执行额外trametinib——与vehicle-treated KPC-derived主要鼠标细胞系。后续的差别分析显示对这些 Nanog, Sox9, Klf4(图 3 (d)),匹配中存在的数据集。

为了阐明功能性MEK抑制对二者的影响,我们进行了球体形成72 h后化验与PD0325901预处理。球体形成的数量显著降低MEK抑制后,和治疗后形成的球体的大小被发现特别是vehicle-treated控制(数据相比较小 3 (e)和 3 (f))。

3 d瀑样文化是一种生理细胞培养模型比二维单层文化和更好地反映 在活的有机体内通过保持细胞间信号条件。因此,瀑样更好的概括原始肿瘤和更好的预测治疗反应比单层文化( 23]。因此,我们从我们的主要文化生成的3 d瀑样细胞系和瀑样执行形成和治疗实验 在体外(图 4(一))。正如预期的那样,我们观察到显著降低瀑样形成和MEK抑制治疗。这适用于瀑样的形成与PD0325901或trametinib(图接受治疗 4(一)),以及治疗已经建立了瀑样(图 4 (b))。

作为一个功能 在活的有机体内读出MEK抑制剂的功效PDAC细胞迁移,我们量化ctc KPC小鼠接受另一个clinical-grade MEK抑制剂,refametinib。Refametinib是一个强有力的MEK1/2抑制剂有益治疗胰腺癌患者( 24]。为此,我们提取的血液从右心室的CKP小鼠与refametinib或车辆控制(详细的实验设置中,肿瘤的生长数据和成像的原发肿瘤已经被发表在 15])。在协议 在体外数据,我们观察到显著减少血液的ctc这些老鼠refametinib治疗后(图 4 (c))。