胰腺导管瀑样反应喀斯特依赖的肿瘤抑制的障碍

文摘

胰腺导管腺癌(PDAC)仍然是现代肿瘤学的阿喀琉斯之踵,伴随着持续发病率越来越高的死亡率。PDAC的发展过程被认为是逐步通过前体病变和连续积累的突变。因此,当前测序研究概括这个遗传异质性PDAC并显示除了少数司机突变(喀斯特,TP53)大量旅客突变,允许定义亚型。然而,建模感兴趣的突变和他们的影响仍然是具有挑战性的。有趣的是,瀑样有可能概括在体外,在活的有机体内他们来自的组织特征。在这里,我们可以建立和发展工具让我们分离,文化和基因修改导管鼠标瀑样。转移到效应器IPMN-PDAC序列,我们可以揭示显著增加增殖和自我更新能力PTEN和RNF43缺乏致癌喀斯特的上下文中^G12D在小鼠胰腺瀑样。总的来说,我们能够获得承诺数据中心导管瀑样PDAC未来研究的重点。

1。介绍

独立于迅速的肿瘤学领域稳步发展颠覆了我们新的治疗方法在几个实体,胰腺导管腺癌(PDAC)似乎不受影响。总体生存时间仅略有改进在过去的几十年,将排名PDAC是癌症死亡的第二大原因在未来十年内(1]。这一趋势的原因是多方面的从流行病学与生物特异性诊断和结束(2,3]。到目前为止,我们所知道的三种不同类型的PDAC前体病变:胰腺上皮内瘤(PanIN),粘液性囊性肿瘤(m cn)和导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN),对每个后独立的遗传途径PDAC [4]。不同的突变谱的一些关键驱动突变(例如,喀斯特,TP53,CDKN2A)加入了大量的旅客突变导致内部特点和intertumoral异质性的PDAC [5,6]。具体来说,致癌喀斯特是终极PanIN-PDAC项目的推动力量,而损失的TP53可以激活一个去分化和EMT项目(7]。亦然,玲娜加强IPMN-PDAC突变序列(8,9]。其他突变已被证明显示上下文相关的影响取决于他们在胰腺细胞特定类型的损失。这样,PTEN培养一个IPMN-PDAC序列一起删除时,有选择地进入致癌喀斯特从导管10),腺泡的损耗加速替代PanIN-PDAC程序(11]。RNF43经常突变在导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)和粘液性囊性肿瘤(12PDAC[]和授予WNT-dependent增长12]。因此,PTEN和RNF43 IPMN发展高度相关,可能喀斯特依赖,从而可以促进对PDAC替代路线。总之,这不是考虑今天的PDAC护理标准忽视了这个异质性利用传统化疗(13,14),从而远离个性化(3]。更详细和促进建模PDAC生物学尊重亚型的突变谱将有助于更好地理解和开发新的治疗治疗(15]。但共同的标准模型用于胰腺癌研究面临不同的问题。事实上,2 d癌症细胞系文化缺乏肿瘤异质性和倾向于随着时间的推移积累突变。转基因小鼠模型可以克服这些问题,基本在PDAC破解相关的生物过程,但有限由于非人背景(16]。更密切patient-derived肿瘤异种移植(PDX),在刚切除PDAC碎片直接移植到小鼠免疫功能不全的,因此可以反映在活的有机体内局势的看法肿瘤异质性(17,18]。总之,我们有几个行之有效的模型可以概括人类PDAC演化的各个方面。然而,大多数的模型是高度劳动密集型的设立、时间和能力,并不总是适合高通量药物筛选。一个有前途的模型来克服这些明显的问题是胰腺瀑样。一般来说,瀑样三维(3 d)模型系统,高度精确的反映在活的有机体内某些组织的架构和multilineage分化(19]。瀑样是基于多功能或瀑特异性干细胞处理和选择性条件下生长在基底膜基质19]。在这里,我们从小鼠胰腺导管瀑样生成20.,21]。基因工程是可行的和瀑样的外观的影响。总之,我们的数据突显出潜在的瀑样的不同路线的楷模PDAC进化,像IPMN派生。

2。材料和方法

2.1。道德声明

所有的动物保健和随后的过程和德国法律规定以前政府审查委员会批准巴登-符腾堡州的状态。后鼠标工作的各个方面进行了严格的指导方针,确保小心,一致,和伦理处理的老鼠。

2.2。鼠标菌株

野生型小鼠瀑样被隔绝C57BL6 / J小鼠从动物获得乌尔姆大学的设施。KC (LSL-KrasG12D / + Ptf1a-Cre + / -)鼠标被穿越LSL-KRAS获得^G12D(B6; 129 s4-krastm4tyj / J)Ptf1a-Cre(B6; 129 - ptf1atm1.1 (CRE)飞行联队)老鼠。

2.3。隔离和导管瀑样的文化

后立即隔离的小鼠胰腺组织碎成0.5 - 1毫米碎片和胶原酶消化/ dispase(罗氏,11097113001)为30分钟37°C,然后与accutase (Sigma-Aldrich A6964) 30分钟在37°C。细胞被过滤在40μM EASYstrainer(他一一bio-one),把文化基底膜基质生长因子减少(康宁)涂层板瀑样培养基含有生长因子减少5% (GFR)基底膜基质(发现实验室的器具,354230)。瀑样培养基(PDC)是一个由Reichert et al。21]。媒介改变了每一个第三天。

2.4。慢病毒生产和感染

慢病毒包含验证shRnf43(TRCN0000040790)和shPten从Sigma-Aldrich (TRCN0000322421)购买。这些慢病毒是利用裴(Polysciences 23966)转染质粒的psPAX2 (Addgene # 12260)和pMD2。G (Addgene # 12259), Lenti-X细胞(Clontech)。对于每一个感染,10.000单一细胞resuspended 1毫升PDC媒介。聚凝胺添加最后一个浓度的8μ克/毫升。细胞/聚凝胺/病毒混合在800转离心20分钟在沿颗粒resuspended于100年μl PDC介质含有5%人工基底膜和涂镀在Matrigel-GFR 96孔板。选择开始24小时孵化后37°C通过改变介质PDC基底膜基质中含有5%补充3μ克/毫升嘌呤霉素。

2.5。克隆的喀斯特g12d - plix - 403质粒

克隆的步骤包括切除一个包含喀斯特的插入^G12D从pBabe-KRAS(576个基点)^G12D质粒(Addgene # 58902)使用限制性内切酶BamHI高频(内)和Sal-I(内)。Subcloning之后到pBLSK II + / - (Stratagene,喀斯特^G12D-pBLSK)。网关喀斯特^G12D-pENTR1A质粒是由削减喀斯特^G12D从喀斯特插入^G12D使用限制性内切酶-pBLSK BamHI高频(内)和Xho-I(内)其次是subcloning pENTR1A(英杰公司# A10462)。最后,喀斯特的克隆^G12D插入plix - 403 (Addgene # 41395)进行了使用网关技术(表达载体)。

2.6。半定量rt - pcr

总rna提取使用RNeasy迷你包(试剂盒)。第一链的互补使用250 ng的RNA和准备上标二世逆转录酶的随机引物(热费希尔科学)根据制造商的协议。定量PCR进行使用一个应用生物系统公司QuantStudio 3系统(退火温度60°C)和PowerUp SYBR绿色主人混合(热费希尔科学)。所有实时的值是平均和使用周期(CT)的阈值方法相比,在目标的RNA(2-ΔΔCT)是内源性表达的规范化18岁(18 s rrna)(ΔCT)。目标mRNA在控制细胞的数量设置为1.0的校准器。以下引物用于定量rt - pcr从Biomers购买,Sigma-Aldrich,或试剂盒:hmb(试剂盒,QT00494130);Gapdh(试剂盒,QT01658692);喀斯特(试剂盒QT00083622);Rnf43(Biomers向前5 - - - - - -gcgggtctggagaaagctac-3 ,反向5 - - - - - -agttgaccaccgagtcactg-3 );Pten(Biomers向前5 - - - - - -acagccatcatcaaagagatcgt-3 ,反向5 - - - - - -tgttcctgtatacaccttcaagtct-3 );淀粉酶(热费希尔科学,向前5 - - - - - -tggcgtcaaatcaggaacatg-3 ,反向5 - - - - - -aaagtggctgacaaagcccag-3 );Sox9(Sigma-Aldrich向前5 - - - - - -aggaagctggcagaccagta-3 ,反向5 - - - - - -tccacgaagggtctcttctc-3 );Ck19(Biomers向前5 - - - - - -agggccttgagattgagctg-3 ,反向5 - - - - - -tgggcttcaaaaccgctgat-3 );Muc2(Biomers向前5 - - - - - -gaagccagatcccgaaacca-3 ,反向5 - - - - - -gcttcaggtgcacagcaaat-3 );和Pdx1(Biomers向前5 - - - - - -ctccctttcccgtggatgaa-3 ,反向5 - - - - - -taggcagtacgggtcctctt-3 )。

2.7。疣状和抗体

免疫荧光的导管瀑样,10.000单个细胞被播种在8室幻灯片涂Matrigel-GFR (LAB-TEK, 0903 # 440263)。5天之后,瀑样与PBS洗两次1 x和2%多聚甲醛缓冲和固定在室温下20分钟。随后,瀑样洗3次与PBS 1 x然后permeabilized Triton 0.7%在RT,阻塞后1小时15分钟RT(正常山羊血清5% BSA 1%,特里同0.4%),一夜之间,主要的抗体被孵化在4°C。以下使用抗体:细胞角蛋白19 (TROMA-III DSHB), ki - 67 (ma5 - 14520,表达载体),SOX9 (AB5535,微孔),FOXA2 (Ab108422 Abcam)和PDX1 (AF2419、研发)。图像是一个Axioplan2显微镜(卡尔蔡司)配备一个AxioCamHR相机和AxioVision(从卡尔蔡司)软件4.8版本。给出的放大图的传说。

2.8。瀑样形成分析

瀑样被分离成单个细胞。5000年单个细胞被播种在Matrigel-GFR-coated 24-well板。照片拍摄后8天播种(12 40 x照片放大每)。数量和大小被ImageJ评估。所有细胞进行了可行性实验一式三份。

2.9。统计分析

统计分析,双尾学生的 - - - - - -测试使用。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。图给出了与平均数标准误差(SEM)。GraphPad棱镜7是用于统计分析和图形演示。

3所示。结果

3.1。Mouse-Developed胰腺瀑样反映导管分化和基因工程

适应和简化已经出版协议(20.- - - - - -22)允许我们隔离没有繁琐的步骤如DBA-positive细胞排序(22)成功传播导管胰腺瀑样从2个月大的老鼠。有趣的是,瀑样的增长能力显著降低小鼠的年龄(图1(一))。确认导管瀑样的起源,导管的最先进的免疫组织化学标记SOX9、CK19, FOXA2执行。CK19和FOXA2表达在绝大多数的瀑样细胞呈阳性,而SOX9表达更小比例的细胞(图1 (b))。免疫化学数据证实了RNA表达(图1 (c))。的确,CK19和一定程度上的SOX9瀑样中高度表达,而PDX1和淀粉酶和腺泡的胰岛细胞不表达(图1 (c))。此外,导管瀑样高度与大约50%的细胞增殖ki - 67阳性(数字1 (d)和1 (e))。

3.2。Pten和Rnf43在野生型瀑样文化中损失支持导管特性

接下来,我们想挑战这些导管瀑样文化通过移除肿瘤发生的路障被授予囊性增长的背景下,导管起源特别PTEN和RNF4311,12]。建立条件允许基因改造导管瀑样,健壮的shRNA击倒Pten和Rnf43(无花果。1 a - b)。的可拆卸的Pten没有显示任何数值或形态学变化与WT瀑样(数据吗2(一个)- - - - - -2 (c))。相比之下,击倒Rnf43明显受损的自我更新( )反之亦然导致扩大瀑样( )(数据2(一个)- - - - - -2 (c))。导管标记CK19的表达水平和SOX9显著升高PTEN缺失,而RNF43调节CK19(数据损失2 (d)和2 (e))。令人惊讶的是,瀑样大小的增加Rnf43击倒并不影响扩散率表明增加的大小,而与结构相关的细胞结构修改和瀑样肿胀(图2 (f)和2 (g))。

3.3。Pten和Rnf43损失与喀斯特合作促进致癌导管瀑样的增长

显示在导管瀑样致癌喀斯特的净效果,我们生成一个doxycycline-inducible喀斯特^G12Doverexpressing线(数据3(一个)和3 (b))。没有数值之间的差异大小可以看到WT瀑样和喀斯特^G12D感应(图3 (c)和3 (d))。强力霉素治疗本身似乎也有轻微影响的增长WT瀑样,不过是明显低于喀斯特激活(增刊图的影响。1 c - d)。进一步将我们的结果与基因更好的定义系统中,我们从一个孤立的导管细胞喀斯特^{G12D / +}Ptf1a^{Cre / +}鼠标(KC)(数据3 (e)和3 (g))。KC瀑样出现WT瀑样相比稍大,更增生性ki - 67染色(图如图所示3 (f))。作为致癌喀斯特被称为IPMN-PDAC序列中的一件大事,我们进一步评估Pten和Rnf43损耗在既定的背景下中也是喀斯特^G12D(KC)(图3 (g))使用慢病毒击倒描述上述系统在KC导管瀑样。令我们吃惊的是,致癌喀斯特^G12D在音乐会戏剧性的改变了瀑样特征PTEN和RNF43损失。具体地说,这迫使显著增加KC-sh的自我更新Pten( )和KC-shRnf43( )瀑样相比,KC争夺控制数据3 (h)和3(我))。接下来,我们想知道是否胰腺导管囊性增长本身的瀑样改变的致癌基因。虽然没有致癌喀斯特仅仅RNF43损失增加囊肿大小,它的存在赋予RNF43和PTEN击倒瀑样囊性增长模式相比,争夺控制。最后,我们想知道是否前面所示的导管可以会使致癌喀斯特upregulation标志。的确,再次观察到CK19的表达显著差异( )指PTEN和RNF43-deficient ( )KC瀑样(图3 (j)和3 (k))。致癌PDAC增长与胚胎程序的激活和去分化表型(23]。因此,我们再次评估通常低表达各瀑样祖PDX1标志类型。事实上,喀斯特^G12D超表达结合RNF43或损失PTEN增加PDX1表达式(图3 (k))。这些结果表明,唯一的损耗的肿瘤抑制基因Rnf43和Pten不足以触发增殖和自我更新能力,但protooncogene额外的激活是必需的。

4所示。讨论

在本文中,我们可以建立和基因工程小鼠胰腺导管瀑样。隔离和培养条件的优化是通过结合和适应出版协议20.,21]。当前协议允许隔离在短时间内导管瀑样的成功率接近百分之一百。瀑样都能够通过三十倍而不丧失增殖能力和形态。导管起源可以清楚地验证了建立标记的表达SOX9, CK19和FOXA2一方面。另一方面,PDX1和腺泡的淀粉酶标记和胰岛细胞分化仍然几乎消极,从而突显出纯粹的导管表型。在成熟的胰腺,PDX1仅限于产生胰岛素的表达β肽(24),但也发现调节在胰腺癌25]。我们数据PDX1、SOX9, CK19表达符合胰腺瀑样模型从央行et al。19]。然而,冲突指Broutier等的显示更高的PDX1表达式(22]。差异可能是由于选择性隔离PDX1-negative细胞使用我们的协议或通过年龄,尽管PDX1越来越隔间的表达特定的胰腺中成熟。

因此,瀑样被慢病毒转基因成分传导损耗的肿瘤抑制基因Pten,Rnf43互补脱氧核糖核酸过度表现喀斯特^G12D。使用慢病毒允许一个简单的方法来验证瀑样的价值系统特征明显的基因在IPMN和PDAC形成。据我们所知,这是第一次尝试模型这些特定的突变小鼠胰腺瀑样。减少慢病毒推广的副作用,如随机或集成多个副本,或者,可以考虑使用CRISPR / Cas9系统为未来的研究。喀斯特的过度^G12D是持续或doxycycline-dependent的方式。强力霉素使用的陷阱是一个潜在的干扰已经显示在低剂量等高度敏感的细胞神经元(26]。事实上,我们的模型显示轻微损伤后强力霉素博览会。唯一的喀斯特^G12D在KC瀑样超表达培养增殖,但没有影响在体外瀑样的增长。

致癌喀斯特^G12D是PDAC发展和重大事件引发缓慢形成PanIN病变在活的有机体内(27),虽然进一步体细胞突变的积累TP53(28),TGFb受体2型(TGFBR2) [29日),或SMAD4(30.是保证加速PDAC形成。亦然,致癌的缺失喀斯特有限的PDAC的发展。评估我们的瀑样模型在这个场景中,我们评估了可拆卸的知名和相关PDAC肿瘤抑制基因,没有转移到鼠标导管瀑样了。因此,选择性地击倒Pten显示没有明显的影响扩散或导管瀑样的自我更新能力。致癌的上下文中喀斯特、自我更新和增殖能力明显增加。适当,PTEN / PI3K / AKT的协同功能描述和RAS /皇家空军/ MAPK通路在促进胰腺癌的起始和进展,部分的强烈激活NF-KB网络(11,31日]。的可拆卸的Rnf43自己已经影响了在我们的瀑样增殖和自我更新能力,进一步加速了致癌喀斯特^G12D。一般来说,在E3泛素连接酶Rnf43是一个负面的反馈调节器的Wnt信号退化的卷曲的被FZD5抗体(32,33]。与我们的研究结果一致,Rnf43失活出版促进胞质β连环蛋白,Wnt /β连环蛋白的信号,从而扩散(12]。此外,我们可以显示激活的致癌项目瀑样(KC-shPten和KC-shRnf43)出现与增加PDX1表达式作为恢复胚胎的代理程序和去分化。

上述有选择地应用突变在胰腺导管瀑样基本上复制影响出版在活的有机体内在文献中,从而实现了“概念验证”方法。

总之,给出的数据突显出潜在的瀑样作为榜样PDAC进化和形式的基础上,进一步应用高通量药物筛选。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

卢卡斯Perkhofer和梅勒妮断了同样的工作。亚历山大Kleger和Pierre-Olivier Frappart共同监督这项工作,同样起到了推波助澜的作用。

补充材料

补充图1:(A)的可拆卸的证据Rnf43和Pten由表达式褶皱变化WT瀑样。(B)瀑样文化WT争夺和击倒Pten和Rnf43显示没有文化的差异后6天。(40 x放大)。(C)瀑样自我更新WT瀑样的化验doxycyclin治疗显示参与之间无显著差异(阿霉素)和(+阿霉素)WT瀑样对待。(D) doxycyclin治疗损害WT瀑样增长( )。喀斯特激活显著减少瀑样增长相比WT瀑样独立于阿霉素治疗( )。统计分析,双尾学生的 - - - - - -测试使用。 被认为是具有统计学意义。误差线代表的标准错误的意思。(补充材料)

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