从FSP-TDTOMATO小鼠胚胎成纤维细胞（MEFS）重编程的CIPSC谱系的建立和鉴定

抽象的

使用化学诱导的多能干细胞（CIPSC）可以避免与转录因子或病毒相关的安全问题，从而促进其临床应用。以前，我们已经成功开发和标准化了使用小分子化合物的诱导方法，具有简单的操作，均匀的诱导条件和清晰的成分。为了验证CIPSC确实是从小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）重编程，并进一步探索潜在的机制，使用FSP-TDTOMATO小鼠构建MEFS的荧光蛋白跟踪系统，用于揭示CIPSC重新编程的过程。通过形态学分析，mRNA和多能基因的蛋白质表达来鉴定CIPSC，以及畸胎形成实验。结果表明，在用小分子化合物治疗TDTOMATO-MEF的40天处理后，将细胞呈现出突出的核仁，核心对细胞质比，圆形，组和质量排列，以及多能性基因的高表达。这些细胞可以分化为体内的三种生殖层组织。如上证明结果所示，TDTOMATO-MEF可以重新编程为CIPSC，该谱系具有与小鼠胚胎干细胞（MESCS）类似的多能性，使用小分子化合物。由荧光蛋白跟踪的CIPSC谱系的建立将有利于探讨其潜在机制的进一步研究。通过在细胞分化期间连续表达荧光蛋白，该细胞谱系可用于跟踪CIPSC移植和分化为功能细胞。

1.介绍

日本科学家山中和高桥率先报道了诱导多能干细胞的产生，并因此获得了诺贝尔奖。2006年，高桥和山中[1]首次引入四种转录因子(10.那SOX2.那KLF4那和c-myc.）使用病毒载体的体细胞，成功地诱导体细胞的转化为诱导多能干细胞（IPSC）。在重编程后获得的IPSCs与胚胎干细胞（ESC）相对于形态，基因和蛋白质表达，表观遗传修饰，细胞倍增，繁殖能力，胚状体和畸胎形成能力，分化能力等等。在下一年中，Takahashi等人同时制作人体IPSC。和yu等人。[2那3.]。超过10年，IPSCS在基础研究以及新颖的疗法中表现出更好的前景。使用不同的转录因子，成纤维细胞可以重新编程为神经元细胞[4.-7.),肝细胞(8.-10.]，心肌细胞[8.-10.]和造血细胞[11.]，在临床上比传统的同种异体干细胞移植治疗更有价值，并因此进入了一个新的里程碑新的时代的全球再生医学研究[12.那13.]。然而，通过病毒载体将外源基因与宿主细胞基因组的整合也可能引起安全危害，例如外源基因的过度表达，从而限制其临床应用[14.]。

研究人员试图用小分子化合物更换山尾因子或促进重编程过程。例如，维生素C可以促进小鼠和人类重新编程的体细胞[15.]，RepSox可以替换SOX2.是山雀的一个因素之一[16.),BMP4可以替换KLF4在重编程期间间充质 - 上皮转换（MET）过程中的因素，并完成成纤维细胞对上皮细胞转化[17]。2013年，侯等人。[18]更换10.用小分子化合物进行斯科啉，并且首次使用小分子化合物成功地重新编程化学诱导的多能干细胞（CIPSC）。小分子化合物将小分子化合物与DNA的整合可以重塑染色质结构，从而改变基因表达，这与传统方法中发生的情况有显着不同。通过使用这种新方法，可以避免由于病毒和转录因子引起的安全危害和应用挑战。使用小分子化合物进行进一步的研究，直接重新编程体细胞进入神经元，神经祖细胞[19-21]，心肌细胞[22，以及更多。

然而，传统化学诱导方法存在两个明显的局限性，包括重新编程诱导的低效率和使用可能影响潜在机制的进一步研究的血清。通过预先报告的化学诱导的重编程方法，不仅显着提高了诱导效率，而且还不需要血清，因此确认其作为诱导多能干细胞的有希望的方法[23]。

CRE / LOXP重组系统，由Sternberg和Hamilton提出[24[指的是条件基因靶向，诱导基因靶向和时尚特异性基因靶向策略的技术核心，这些核心广泛用于新的基因靶向[25]。由于其高效率和简单性，CRE / LOXP定位和重组系统已经有效地利用了特定基因，鉴定基因函数，外源基因，基因捕获和染色体工程的鉴定。

成纤维细胞特异性蛋白1 (FSP1.），也称为S100钙结合蛋白A4（S100A4），是目前在成纤维细胞中发现的最具体的分子标记[26]。使用FSP1的启动子和通过荧光蛋白的特异性跟踪的CRE / LOXP系统可以遗传修饰成纤维细胞，以鉴定重新编程引发细胞并跟踪重编程过程。它们可以帮助了解在重编程端点的重编程和逐渐获取多能干细胞期间初始体细胞特征的逐步丧失，并在重新编程终点中获得有关限制重编程效率的关键因素的洞察，包括所涉及的基因表达调控的转变和表述改性。

在这项研究中，我们成功地建立了一种从荧光蛋白跟踪FSP-TDTOMATO MEF的CIPSC谱系，具有小分子化合物，确保了重新编程引发细胞的准确性和真实性。在形态学特征，自我更新，增殖和分化势方面鉴定并分析所获得的CIPSC。

2。材料和方法

2.1。老鼠

FSP1-CRE小鼠和ROSA26-TDTOMATO小鼠，纯黑色是由C57B / 6J背景生成的，来自上海本科研究所。所有动物实验均根据广州生物医药和卫生研究院的动物保护指南进行，中国广州。

2.2。细胞培养

用于MEF培养的高葡萄糖DMEM（Hyclone），补充有10％FBS（NTC），1×NEAA（Gibco）和1×Gluta Max（Gibco）。

在含有1×N 2（Gibco）的N2B27培养基中培养CIPSC和MESCS，2×B27（Gibco），1×NeAA（Gibco），1×Gluta Max（Gibco），1×丙酮酸（Gibco），0.1mmβ我（Gibco），3 μ.M Chir99021（MCE），1 μ.M PD0325901（MCE）和1000单位/ ml LIF（Millipore）。

第1期CiPSCs培养液(第0天，第22天)含有iCD1, 5μ.M Brdu（Sigma），0.05 μ.M AM580（SELECK），10 NG / ML BMP4（RD），5 μ.M Repsox（Chembest），5 μ.M EPZ5676（Targetmol），10 μ.M forsklin（Chembest），5 μ.M SGC0946（Targetmol），0.5 mm VPA（SELECK）和0.05 μ.m dznep（selleck）。

用于CIPSC的第二阶段培养基（第22天40）含有高葡萄糖，DMEM（Hyclone），1×N 2（Gibco），2×B27（Gibco），1×NeAa（Gibco），1×Gluta Max（Gibco），1×丙酮酸钠（Gibco），0.1毫米β我（Gibco），3 μ.M Chir99021（MCE），1 μ.M PD0325901（MCE）和1000单位/ ml LIF（Millipore）。

2.3。胚胎成纤维细胞的分离与培养

在笼子中交配后，通过麻醉下的宫颈位错，在麻醉下，在白天E13.5收获胚胎中胚胎脱位处死怀孕的FSP1-CRE和ROSA26-TDTOMATO小鼠。从胚胎中取出头部，尾部，四肢和较暗的内脏零件。用DPBS洗涤残留部分。切碎组织，加入0.15％胰蛋白酶，并在37℃下在37℃下孵育15分钟以进行消化。用含有10％FBS的等体积的培养基终止消化。在离心后，将细胞重悬于含有10％FBS的培养基中并将其接种成60mM培养皿。每天刷新培养基，当细胞融合达到90％时，进行通道或冷冻保存。

2.4。细胞重新编程

将MEF播种到12孔板中，密度为50,000 /孔。在24小时后，通过第一阶段CIPSC培养基替代含有10％FBS的培养基，并记录为第0天。培养基每次再次刷新，并在第22天替换第二阶段CIPSC培养基。诱导过程是持续12-18天。

2.5。实时PCR

将细胞用Trizol试剂溶解在100万个细胞/ mL中以提取RNA。Revertra Ace（Toyobo）和寡核苷酸（DT）（DT）（Takara）用于产生cDNA，并且Premix Ex Taq（Takara）用作实时PCR中基因表达检测的模板。用表中显示的引物序列进行QPCR1。

2.6。免疫荧光

将细胞培养在覆盖有玻璃载玻片的24孔板中（涂覆0.1％明胶过夜）。将细胞在第3天用PBS洗涤，在室温（约15℃-25℃）下用4％多聚甲醛固定30分钟，并用PBS洗涤三次。BSA（3％）和Trizon X-100（0.2％）在1：1的细胞阻断和渗透率中混合。然后将细胞在室温下温育1小时并用PBS洗涤三次。在用一抗抗体孵育2小时后，用PBS洗涤细胞，与第二抗体在黑暗中孵育1小时，用PBS洗涤三氯，与1：5000稀释1分钟，最后用PBS洗涤三次在荧光显微镜下观察之前。用3％BSA稀释的抗体是抗-OTOT4（SC-5279,1：200），抗SOX2（SC-17320,1：100），抗纳米（贝乙基No.A300-397A，1：200），和抗SSEA1（RD，MAB2155,1：50）。

2.7。畸胎瘤检测

用0.05％胰蛋白酶消化CIPSC 3分钟，重新悬浮和离心后计数。大约5×10^5.将细胞重新悬浮于50 μ.l Matrigel并接种到Nod-Scid小鼠的皮下组织中。1-2个月后，检查注射部位用于肿瘤形成。如果形成肿瘤，则在解剖后用4％多聚甲醛固定，并送到广州生物医药研究院的病理实验室和石蜡切片和H＆E染色的健康。

2.8。嵌合小鼠检测

怀孕的ICR小鼠E3.5在麻醉下进行颈椎脱位，并获得胚泡。将胚泡转移到微操作室以进行进一步使用。选择光滑和圆形的CIPSC，并以每腹胚泡为15个细胞的剂量注射到胚泡中。在培养箱中培养2-3小时后，将胚泡移植到雌性ICR小鼠的子宫中，在Day E2.5时为假妊娠。每只小鼠用10-15个胚泡移植。切口用缝合线夹关闭，小鼠繁殖直至幼崽出生。

2.9。统计方法

使用SPSS22.0和PRISM Version 6进行统计分析和映射。所有定量数据表达为平均值±标准偏差，并且使用独立进行比较T.以及。 被认为具有统计学意义( ; ; ）.

结果

3．1．FSP-tdTomato MEFs的制备

如图所示1（a）当与ROSA26-TDTOMATO小鼠配合FSP1-CRE小鼠时，在胚胎中激活成纤维细胞FSP启动子，并且表达CRE重组酶以沿相同方向删除两种LOXP位点之间的止动序列，从而确保TDTOMATO的连续表达。在该方法中标记了MEF，以验证我们的重新编程引发细胞是否确实是成纤维细胞。因此，在MEF的细胞转变后，TDTOMATO将连续表达。

在E13.5分离的MEF是粘附细胞。在消化后2-3小时观察到细胞粘附和完全拉伸，呈现为梭形或多边形，具有全细胞质，强烈的立体效果，澄清核和Tdtomato红色荧光的部分表达（图2（a））.在培养的第二天，发现许多死细胞漂浮在培养基中。在显微镜下观察到剧烈增殖，许多新生，圆形和半透明细胞。通常，细胞在2-3天后完全融合，并且通过1：2-3的比例进行通道。在良好状态下的通道3-5的MEF用于用小分子化合物重编程（图1（b））.

3.2。FSP1-CRE的重新编程：R26R^TDTOMATO.MEFS进入具有小分子化合物的CIPSCS

用小分子化合物进行重编程，如图所示1（b）。我们发现TDTOMATO-MEFS经历了与野生型MEFS相同的形态变化，呈现典型的克隆生长。克隆是圆形的或椭圆形，透明边界和良好的折射。它们紧密安排，小尺寸，大核，核和细胞质的比例是质量（图2（a））.第40天，克隆数达到90-108个，其中11-20个CiPSC克隆由Fsp1-Cre:R26R重编^TDTOMATO.MEFS（图2（b））.选择CIPSC的单克隆克隆用于通过。在被传代到36的CIPSC中观察到稳定的形态特征，自我更新能力，稳定的增殖和通过^th几代人。

3.3。实时定量PCR（RT-QPCR）检测CIPSC中的多能基因表达

为了了解多能基因是否在转录水平上被激活，OCT4，SOX2，SALL4，NANOG，REX1，DPPA5a和其他基因被用作标记以评估干细胞的多能性;在分化的体细胞中未观察到这些基因的表达。在该研究中，实时定量PCR用于分析CIPSC相关基因的表达。如图所示3.，多能性基因几乎没有或很少在MEF中表达，而CIPSC多能性基因的特征高度表达。

3.4。用于多能性基因在CIPSC中的免疫测定

为了进一步验证多能性基因在蛋白水平上的表达，我们对CiPSCs进行了免疫荧光检测。结果显示，特异分子标记ESC、SOX2、OCT4、NANOG、SSEA1在CiPSCs中表达(图1)4.）.

3.5。畸胎瘤形成

为了验证CiPSCs是否具有致瘤性，他们被移植到NOD-SCID小鼠中。细胞移植后一个月形成直径为2cm的畸胎瘤。H&E染色进一步检测CiPSCs是否有能力在体内形成三个胚层。显微镜下观察畸胎瘤的外胚层皮肤组织、中胚层软骨组织和内胚层腺体组织，大部分分化组织以红色荧光表达(图)5.）.

3.6。嵌合小鼠可以源自CIPSC

嵌合小鼠中每个器官的细胞组织可能来自于受体胚泡(白色)或CiPSCs(黑色)。当一个器官的一些细胞来自胚泡，而另一些细胞来自CiPSCs时，嵌合体就可能形成。例如，如果皮肤的某些细胞来自囊胚(白色)，而其他细胞来自CiPSCs(黑色)，嵌合小鼠的头发将同时是黑色和白色。然而，基因组的交叉并不发生在任何单个细胞内。嵌合小鼠携带有两种不同来源的细胞，每种细胞包含两组不同的基因组。但从头发颜色来看，头发越深，CiPSCs的贡献越大，嵌合效率越高。除了皮肤颜色外，我们还可以观察到小鼠眼睛的颜色。例如，cipsc来源小鼠的眼睛应该是黑色的，而囊胚来源小鼠的眼睛应该是红色的。如图所示6.，黑眼睛和嵌合小鼠的头发表明了来自cipscs的斜切性。

4。讨论

CiPSC呈现出胚胎干细胞的两个主要特征，即自我更新能力和分化为所有类型的细胞的多能性。此外，CIPSC不仅克服了胚胎干细胞挑战的道德问题，还可以避免与病毒和转录因子相关的安全问题，并具有毒理学，药物筛查，疾病模型和再生医学的广泛应用前景[27那28]。转录因子重新编程的最早方法是逆转录病毒和慢病毒载体，仍被广泛使用。尽管与其他方法相比，这些方法的重编程效率相当高，但它们倾向于稳定和随机地将其整合到染色体中，这可能增加肿瘤发生的风险。通过生化试验和高通量筛选，转录因子的影响可以逐渐被小分子化合物和生长因子所取代。妨碍CIPSC在临床实践中应用的主要限制是效率和安全，解决这些问题的关键在于躯体细胞重新编程的机制研究。

一个剩下的问题是CIPSC的起源。估计，仅使用小分子化合物重编程系统表达多能基因的小百分比细胞成为CIPSC。因此，在成纤维细胞培养中共存的稀有组织茎/祖细胞可能是CIPSC增加的原因。事实上，研究人员已成功获得来自皮肤的多能干细胞[29-31]。这些研究还证明，约0.067％的小鼠皮肤细胞是干细胞。由小分子化合物诱导的组织干细胞的转化可以作为CIPSC衍生的低频率的可能解释。在目前的研究中，我们构建了来自FSP-Tdtomato小鼠的荧光蛋白标记的MEF报告系统，以跟踪CIPSC引发细胞并用一种使用小分子化合物的简单有效的方法将它们重新编程为CIPSC。提出典型的MESC形态，CIPSCS仍然可以稳定增殖，在36中仍然持续存在^th生成，表达多能性基因，在体内形成畸胎瘤，后来分为三种生殖细胞。我们的结果表明，重新编程启动细胞准确且真实。重编程的CIPSC，具有潜在的增殖和分化和自我复制和更新能力的能力，使它们能够形成具有持续荧光蛋白表达的高度分化的功能细胞。

此外，我们的cipc谱系将促进干细胞研究，因为明亮的tdtomato荧光将使细胞可视化的时间长体内和体外;实例包括追踪源自CIPSC的特异性细胞谱系，并评估CIPSC的形态的变化。我们的新CIPSC谱系也可以是由于细胞和组织的可追溯性改善的可追溯性而成为器官移植研究的理想工具[32-34]。此外，来自CIPSCs的任何TDTOMATO标记的细胞将在宿主组织中可追溯，从而能够可视化移植的细胞/组织的行为和与主体相互作用。

然而，小分子化合物的重编程方法被认为是耗时的临床应用。CiPSC克隆形成大约需要40天，而山中因子介导的重编程只需要7天[35]。在最近的一项研究中，Zhao等人。[36可以将小分子化合物的重编程时间减少至16-22天。从理论上讲，CIPSC重新编程应该像Yamanaka因子介导的重编程一样快;可以通过分析和鉴定在小分子化合物的重编程期间的独特屏障来解决差异。

结论

我们通过CRE / LOXP系统成功地从荧光蛋白标记的小鼠成纤维细胞中建立了一种红色免疫荧光标记的CIPSC谱系。如本文所述，血清无血清替代条件下的CIPSC重编程方法应该非常有用，用于研究小分子化合物诱导的重编程的潜在机制，可以用作途径中屏障的筛选平台。未来，我们希望通过小分子化合物建立一种重新编程的方法，作为古典山买的典型Yamanaka方法有效和方便。将在未来的研究中尝试用小分子化合物进行人体细胞的重新编程，从而促进CIPSC的临床转化。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包括在文章中。

利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

致谢

国家重点研发计划项目(no . 2017YFA0105602, no . 2018YFA0108700);国家自然科学基金项目(no . 81720108004, no . 81570279, no . 81500231);广东省自然科学基金科研团队项目(2017A030312007);“攀爬”计划-广东省大学生科技创新训练专项(pdjh2018a0041);中南大学湘雅第三医院新湘雅人才项目(JY201524)。

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