SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi 10.1155 / 2018/5965727 5965727 研究文章 建立和识别CiPSC血统重新编程的FSP-tdTomato小鼠胚胎成纤维细胞(mef) http://orcid.org/0000 - 0002 - 2854 - 3555 陈 Ruiping 1 2 http://orcid.org/0000 - 0001 - 5532 - 6575 谢 绣 3 4 5 蔡 Baomei 3 4 秦 悦 3 4 5 吴 Chuman 3 4 5 周 Wenyi 6 http://orcid.org/0000 - 0002 - 6763 - 4214 周 Chunhua 3 4 5 http://orcid.org/0000 - 0002 - 2695 - 3040 余 Shengyong 3 4 5 http://orcid.org/0000 - 0003 - 2681 - 7580 旷 琪 3 4 5 http://orcid.org/0000 - 0003 - 1776 - 0703 杨 本 2 http://orcid.org/0000 - 0002 - 2884 - 0736 赵 Mingyi 1 http://orcid.org/0000 - 0002 - 4276 - 9593 朱 平 1 张 Sicai 1 广东省心血管病研究所 广东综合医院 广东省医学科学院 广州 广东510080年 中国 gdghospital.org.cn 2 医学院的 华南理工大学 广州 广东510006年 中国 scut.edu.cn 3 再生生物学的中科院重点实验室 华南干细胞生物学和再生医学研究所 广州生物医药与健康研究院 中国科学院 广州510530 中国 cas.cn 4 广东省重点实验室的干细胞和再生医学 华南干细胞生物学和再生医学研究所 广州生物医药与健康研究院 中国科学院 广州510530 中国 cas.cn 5 中国科学院大学 北京100049年 中国 ucas.ac.cn 6 广州心血管疾病研究所 第二附属医院 广州医科大学 广州 广东510260年 中国 gzhmc.edu.cn 2018年 25 12 2018年 2018年 20. 08年 2018年 27 09年 2018年 25 12 2018年 2018年 版权©2018 Ruiping陈等。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

安全问题相关的转录因子或病毒可能避免使用化学诱导多能干细胞(CiPSCs),从而促进其临床应用。以前,我们已经成功地开发和标准化的一个感应方法使用小分子化合物,操作简单、统一的诱导条件下,和明确的成分。为了验证CiPSCs确实是重组从小鼠胚胎成纤维细胞(mef),并进一步探索其内在机制,FSP-tdTomato老鼠用于构造mef荧光蛋白追踪系统,为揭示CiPSC重组的过程。CiPSCs被确定通过形态分析、mRNA和蛋白表达的多能性基因,以及畸胎瘤形成实验。结果表明,40天治疗后与小分子化合物,tdTomato-MEFs细胞提供杰出的核仁,core-to-cytoplasmic比率高,圆形,集团和大众的安排,多能性基因的高表达。这些细胞可以分化成三胚层组织体内。如上所示的结果,tdTomato-MEFs可以重组成CiPSCs,类似于鼠标的血统,具有多能性胚胎干细胞(制),使用小分子化合物。CiPSC血统,追踪的荧光蛋白,将有利于进一步研究探索其潜在机制。连续表达荧光蛋白在细胞分化过程中,细胞谱系可能被用于跟踪CiPSC移植和分化成功能性细胞。

 中南大学 JY201524 广东大学生科技创新培训特别项目 pdjh2018a0041 广东省自然科学基金 2017年a030312007 中国国家自然科学基金 81500231 81570279 81720108004 科学技术部的中华人民共和国 2018年yfa0108700 2017年yfa0105602 1。介绍

代的诱导多能干细胞是由日本科学家首次报道山中,高桥他们被授予诺贝尔奖。2006年,高桥和山中( 1)首次引入四个转录因子( Oct4, Sox2, Klf4, 和c - Myc)体细胞使用病毒载体,成功地诱导体细胞的变换成诱导多能干细胞(万能)。万能,获得重组后,类似于胚胎干细胞(ESCs)对形态、基因和蛋白质表达,表观遗传修饰,细胞倍增和增殖能力,身体和畸胎瘤胚状体形成能力,分化能力,和许多更多。在第二年,人类则是由高桥等人同时产生和Yu et al。 2, 3]。十多年来,则显示更好的前景在基础研究以及新的治疗方法。使用不同的转录因子,可以重组成神经细胞(成纤维细胞 4- - - - - - 7),肝细胞( 8- - - - - - 10),心肌细胞( 8- - - - - - 10),和造血细胞 11),临床上更有价值比传统的同种异体干细胞移植治疗,因此全球再生医学研究已经进入了一个新时代的里程碑( 12, 13]。然而,外源基因整合到宿主细胞基因组的病毒载体,也可能造成的安全隐患,如外源基因的超表达,从而限制了其临床应用( 14]。

研究人员试图取代实验因素与小分子化合物或促进重组过程。例如,维生素C可以促进小鼠和人类体细胞重编程( 15), RepSox可以替代 Sox2山中,其中一个因素( 16), BMP4可以替代 KLF4因素mesenchymal-epithelial过渡(遇到)过程重组并完成fibroblast-to-epithelial细胞转换( 17]。2013年,侯et al。 18)所取代 Oct4小分子化合物forskolin,首次成功地重组化学诱导多能干细胞(CiPSCs)从体细胞使用小分子化合物。集成的小分子化合物为DNA可以改变染色质的结构,从而改变基因表达,明显不同于发生在传统的方法。安全隐患和应用程序的挑战由于病毒和转录因子可以避免使用这种新方法。进行了进一步的研究利用小分子化合物直接重新编程体细胞到神经元,神经祖细胞( 19- - - - - - 21),心肌细胞( 22),和许多更多。

然而,有两个明显的限制,传统的化学诱导的方法,包括重组诱导的低效率和血清的使用可能影响潜在机制的进一步研究。化学诱导重编程的方法,由美国早些时候报道,不仅提高了感应效率显著但也不需要血清,因此证实它是一种很有前途的方法,诱导多能干细胞( 23]。

提出的Cre / loxP复合系统,斯特恩伯格和汉密尔顿[ 24),是指技术条件基因打靶技术的核心,诱导基因打靶,和spatiotemporal-specific基因打靶策略,广泛应用于新型基因打靶( 25]。由于其效率高、简单,Cre / loxP本地化和复合系统有效利用删除的特定基因,基因的识别功能,整合外源基因,基因捕获和染色体工程。

Fibroblast-specific蛋白1 ( Fsp1),也称为S100钙结合蛋白A4 ( S100A4),是目前发现的最具体的分子标记在成纤维细胞( 26]。成纤维细胞可能是转基因的Cre / loxP系统使用启动子Fsp1和跟踪的特异性荧光蛋白,为了和跟踪识别reprogram-initiating细胞重编程过程。他们可以帮助理解最初的逐渐丧失在重编程体细胞特征,逐步收购重组端点的多能干细胞,在获得洞察限制重编程效率的关键因素,包括基因表达调控和表观遗传修饰的转换。

在这项研究中,我们成功地建立了一个CiPSC血统重组从荧光蛋白追踪FSP-tdTomato mef,与小分子化合物,确保reprogram-initiating细胞的准确性和真实性。获得CiPSCs是识别和分析的形态特征、自我更新、增殖和分化潜能。

 2。材料和方法 2.1。老鼠

FSP1-Cre老鼠和老鼠Rosa26-tdTomato,纯黑色,从C57B / 6 j生成背景和来自上海药物学研究所。所有动物实验的动物保护指南广州生物医药与健康研究院、广州,中国。

 2.2。细胞培养

High-glucose DMEM (Hyclone),补充了10%的边后卫(NTC), 1×NEAA (Gibco),和1×Gluta马克斯(Gibco),用于MEF文化。

CiPSCs和制培养N2B27中包含1×N2 (Gibco), 2×B27 (Gibco), 1×NEAA (Gibco), 1×Gluta马克斯(Gibco), 1×丙酮酸钠(Gibco), 0.1毫米 β我(Gibco) 3 μM CHIR99021 (MCE), 1 μM PD0325901”(MCE)和1000单位/毫升的生活(微孔)。

CiPSCs第一阶段培养基(天0-day 22)包含iCD1, 5 μ0.05 M BrdU(σ) μM AM580(塞莱克)、10 ng / ml BMP4 (RD) 5 μM RepSox (ChemBest) 5 μM EPZ5676 (TargetMol) 10 μM Forsklin (ChemBest) 5 μM SGC0946 (TargetMol), 0.5毫米VPA (Selleck)和0.05 μM DZNep (Selleck)。

22天CiPSCs阶段培养基(天40)包含高葡萄糖、DMEM (Hyclone), 1×N2 (Gibco), 2×B27 (Gibco), 1×NEAA (Gibco), 1×Gluta马克斯(Gibco), 1×丙酮酸钠(Gibco), 0.1毫米 β我(Gibco) 3 μM CHIR99021 (MCE), 1 μM PD0325901”(MCE)和1000单位/毫升的生活(微孔)。

 2.3。隔离和胚胎成纤维细胞的文化

在笼子里交配后,怀孕FSP1-Cre和Rosa26-tdTomato老鼠牺牲麻醉下颈椎脱位E13.5和胚胎是收获的一天。头、尾、四肢和深色的内脏部分从胚胎中删除。剩余的部分是与DPBS清洗三次。组织是剁碎,0.15%胰蛋白酶补充道,在37°C和孵化15分钟消化。消化是终止与同等体积的培养基含有10%的边后卫。细胞被resuspended离心后培养基中含10%的边后卫,播种到60毫米培养皿。媒介是每天刷新,或通过低温贮藏细胞融合达到90%时进行。

 2.4。细胞重新编程

mef被播种到12-well板的密度50000 /。24小时后,培养基含有10%的边后卫取代了第一阶段CiPSC培养基和记录为0。媒介是刷新每天交替,取而代之的是阶段CiPSC培养基在22天。感应过程持续了12 - 18天。

 2.5。实时聚合酶链反应

试剂盒的细胞细胞溶解试剂在100万个细胞/毫升提取RNA。ReverTra Ace (Toyobo)和低聚糖(dT)(豆类)用于生产cDNA、和预混料Taq交货(豆类)作为模板用于实时PCR基因表达检测。qPCR执行与引物序列显示在表中 1。

的细节选择基因的引物用于存在分析用于PCR实验。

基因名字 引物序列 退火T (°C) 基因库加入数量
Oct4 F: 5 ′ -CATTGAGAACCGTGTGAG-3 ′ R: 5 ′ -TGAGTGATCTGCTGTAGG-3 ′ 60°C NM_013633.3
Sox2 F: 5 ′ -AGGGCTGGGAGAAAGAAGAG-3 ′ R: 5 ′ -CCGCGATTGTTGTGATTAGT-3 ′ 60°C NM_011443.4
Sall4 F: 5 ′ -CTAAGGAGGAAGAGGAGAG-3 ′ R: 5′-CAAGGCTATGGTCACAAG-3 ′ 60°C NM_175303.4
Nanog F: 5 ′ -CTCAAGTCCTGAGGCTGACA-3 ′ R: 5 ′ -TGAAACCTGTCCTTGAGTGC-3 ′ 60°C NM_028016.3
Rex1 F: 5 ′ -CAGCCAGACCACCATCTGTC-3 ′ R: 5 ′ -GTCTCCGATTTGCATATCTCCTG-3 ′ 60°C NM_009556.3
Dppa5a F: 5 ′ -CCGTGCGTGGTGGATAAG-3 ′ R: 5 ′ -GCGACTGGACCTGGAATAC-3 ′ 60°C NM_025274.3
2.6。免疫荧光

细胞培养在24-well板覆盖着玻璃幻灯片(明胶一夜之间涂有0.1%)。细胞在第三天用PBS洗净,与4%多聚甲醛固定在室温下30分钟(大约15°C-25°C),并与PBS清洗三次。BSA(3%)和Trizon x - 100(0.2%)混合1:1的比例对细胞阻塞和渗透率。在室温下细胞被孵化与PBS 1 h和清洗三次。2 h后孵化与主要抗体,PBS的细胞被洗,第二抗体孵育1 h在黑暗中,清洗与PBS吊起,孵化与DAPI稀释1:5000 1分钟,最后洗了三次PBS在荧光显微镜下观察。与3% BSA抗体稀释anti-Oct4 (sc - 5279, 1: 200), anti-Sox2 (sc - 17320, 1: 100), anti-Nanog (BETHYL没有。a300 - 397 a, 1: 200),和anti-SSEA1 (RD MAB2155 1: 50)。

 2.7。畸胎瘤检测

CiPSCs与0.05%胰蛋白酶消化3分钟,再悬浮和离心后计算。大约5×105细胞被resuspended 50 μl人工基底膜和接种NOD-SCID小鼠的皮下组织。1 - 2个月后,注射部位检查肿瘤形成。如果肿瘤形成,与4%多聚甲醛固定后解剖病理学实验室并送往广州生物医药与健康研究院的石蜡切片和染色)。

 2.8。嵌合小鼠检测

怀孕ICR小鼠在天E3.5受到麻醉下颈椎脱位并获得胚泡。胚泡都被转移到微观操作余地进一步使用。光滑圆CiPSCs选择和注入剂量的胚泡15每胚泡细胞。在孵化器2 - 3 h文化后,胚泡移植到女性的子宫ICR小鼠E2.5假孕的一天。每个鼠标与10 - 15囊胚移植。关闭切口缝合剪辑和老鼠繁殖,直到幼崽出生。

 2.9。统计方法

进行了统计分析和映射使用SPSS22.0和棱镜版本6。定量数据都表示为均值±标准差和比较是用独立的 t以及。 P < 0.05 被认为是统计学意义( ∗ P < 0.05 ; ∗ ∗ P < 0.01 ; ∗ ∗ ∗ P < 0.001 )。

 3所示。结果 3.1。制备FSP-tdTomato mef

如图 1(一),当Fsp1-Cre老鼠Rosa26-tdTomato小鼠交配时,纤维母细胞FSP启动子表达在胚胎和Cre重组酶激活删除停止序列两loxP网站在同一方向,从而确保连续tdTomato的表情。mef标记在这个方法来验证我们的reprogram-initiating细胞确实是成纤维细胞。因此,tdTomato应当不断mef细胞转变后的表达。

建立CiPSCs源自FSP-tdTomato mef。(一)总结方案描述建立FSP-tdTomato mef。FSP: fibroblast-specific蛋白质。(b)原理图从mef CiPSCs感应的。

mef孤立在E13.5贴壁细胞。细胞粘附和完成拉伸观察2 - 3 h消化后,表现为梭形或多边形与完整的细胞质,强烈的立体效果,清晰的核,和部分的表达tdTomato红色荧光(图 2(一个))。第二天的文化,许多死细胞被发现漂浮在培养基。的扩散,许多新生的、圆和半透明的细胞在显微镜下观察。一般来说,细胞被完全融合后2 - 3天,和通过的比率进行1:2 - 3。mef在章节3 - 5,状况良好与小分子化合物(图用于重组 1 (b))。

一代的CiPSCs FSP-tdTomato mef。(一)阶段和荧光图像的FSP-tdTomato mef和CiPSCs。酒吧,100 μm。(b)量化产生的CIP tdTomato +殖民地FSP-tdTomato mef。实验:实验。数据平均±标准差; n = 2 。

 3.2。重组Fsp1-Cre: R26R <一口> tdTomato < /一口> mef CiPSCs与小分子化合物

进行重组与小分子化合物,如图 1 (b)。我们发现tdTomato-MEFs经历相同的形态变化野生型mef,呈现典型的克隆生长。克隆是圆形或椭圆与清晰的界限和良好的折射。他们紧密排列,体积小,大核和细胞核和细胞质的比例是质量(图 2(一个))。克隆的数量达到了90 - 108年在40天,11日至20日CiPSC克隆是从Fsp1-Cre重组:R26RtdTomatomef(图 2 (b))。CiPSCs的单克隆克隆选择通道。稳定的形态特征,自我更新能力,稳定的扩散,通过观察在CiPSCs已经通过36th一代又一代。

 3.3。多能性基因表达的检测CiPSCs通过实时定量PCR (RT-qPCR)

理解是否多能性基因被激活在转录水平,Oct4、Sox2, Sall4, Nanog, Rex1, Dppa5a,和其他基因作为标记评价干细胞的多能性;这些基因的表达没有分化的体细胞中观察到。在这项研究中,实时定量PCR用于分析CiPSC-related基因的表达。如图 3多能性基因几乎没有或很少在mef表示,虽然CiPSC多能性基因高表达了公司的特色。

多能性的表达标记mef、制和三个独立CiPSC行来源于mef存在。数据平均±标准差, n = 3 独立的实验。 P < 0.05 被认为是统计学意义( ∗ P < 0.05 ; ∗ ∗ P < 0.01 ; ∗ ∗ ∗ P < 0.001 )。

 3.4。免疫测定CiPSCs多能性基因表达

为了进一步验证在CiPSCs多能性基因蛋白的表达水平,我们在CiPSCs表现免疫荧光测定。结果表明,特定的分子标记,包括ESC, SOX2, OCT4, NANOG,和SSEA1表示CiPSCs(图 4)。

SOX2, OCT4、NANOG在MNF-derived SSEA1 CiPSC殖民地,免疫荧光探测到。酒吧,100 μm。

 3.5。畸胎瘤的形成

来验证是否CiPSCs是肿瘤发生的,他们被移植到NOD-SCID老鼠。一个畸胎瘤2厘米直径形成细胞移植后的一个月。)染色法被用来进一步检测CiPSCs是否有能力形成三个胚芽层体内。外胚层的皮肤组织,中胚层的软骨组织,内胚层的腺体组织在显微镜下观察到的畸胎瘤,与大部分的分化组织表达红色荧光(图 5)。

阶段(a - c)和荧光图像(d-f)畸胎瘤和圆)染色FSP-tdTomato MEF-derived CiPSCs。

 3.6。嵌合小鼠可能来自CiPSCs

各器官的细胞组织在嵌合小鼠可能来自接收者囊胚(白色)或CiPSCs(黑色)。当一些细胞的器官来自胚泡而另一些来自CiPSCs,嵌合体可能形式。例如,如果某些皮肤细胞起源于胚泡(白色)而另一些来自CiPSCs(黑色),嵌合小鼠会两个黑色和白色的头发。然而,十字路口的基因组不发生在任何单一的细胞。嵌合小鼠携带与两个不同的起源细胞,每个包含两个不同的基因组。然而,从头发的颜色,深色的头发,CiPSCs的贡献越大,表明嵌合效率更高。除了肤色外,我们还可以观察老鼠的眼睛的颜色。例如,CiPSC-derived老鼠的眼睛应该是黑色的,而那些blastocyst-derived老鼠应该是红色的。如图 6,黑眼睛和头发在嵌合小鼠表示从CiPSCs嵌合现象。

嵌合小鼠产生tdTomato-MEF-derived CiPSCs:(一)第三天的嵌合小鼠和(b) 2周的嵌合体小鼠。

 4所示。讨论

CiPSCs提出了与胚胎干细胞的两个主要特点,即自我更新能力和分化成各种类型的细胞的多能性。此外,CiPSCs不仅克服了胚胎干细胞的伦理问题挑战但也能避免与病毒相关的安全性问题和转录因子在毒理学中有着广阔的应用前景,药物筛选,疾病模型和再生医学 27, 28]。转录因子重组的最早的方法是通过逆转录病毒和慢病毒载体,它仍然广泛使用。虽然这些方法相当的重编程效率高与其他方法相比,他们更倾向于稳定和随机整合到染色体,这可能会增加肿瘤发生的风险。通过生化试验和大规模筛选,转录因子的影响会逐渐取代了小分子化合物和生长因子。主要的限制阻碍了CiPSCs在临床实践中的应用效率和安全性,而解决这些问题的关键在于机械研究潜在的体细胞重编程。

剩下的一个问题是CiPSCs的起源。据估计,只有一小部分细胞多能性基因表达成为CiPSCs使用小分子化合物重组系统。由此可见,罕见的组织干细胞/祖细胞纤维母细胞共存的文化可能CiPSCs的增加的原因。事实上,研究人员已经成功地获得多功能干细胞从皮肤 29日- - - - - - 31日]。这些研究也证明了大约0.067%的小鼠皮肤细胞是干细胞。组织干细胞的变换引起的小分子化合物可以作为一个可能的解释的低频CiPSC推导。在当前的研究中,我们构建了一个荧光protein-tagged MEF记者从FSP-tdTomato老鼠系统跟踪CiPSC-initiating细胞和重组成CiPSCs使用小分子化合物的一种简单而有效的方法。呈现典型的公司形态,CiPSCs仍然可以稳定增殖,保持未分化的36th一代,表达多能性基因,形成畸胎瘤体内,后来分化成三个生殖细胞。我们的研究结果表明,reprogram-initiating细胞准确和真实的。重新编程CiPSCs提供增殖和分化的潜力和能力自我复制和更新,使他们形成高度分化的功能细胞持续荧光蛋白表达。

此外,我们CiPSC血统将促进干细胞的研究,因为明亮的tdtomato荧光将使细胞长时间的可视化 在活的有机体内和 体外;例子包括跟踪特定的细胞谱系源自CiPSCs和评估CiPSCs形态学的变化。和我们的新CiPSC血统也可能由于器官移植研究的理想工具改进的可追溯性的细胞和组织 32- - - - - - 34]。此外,任何从CiPSCs tdtomato-labeled细胞起源于在宿主组织,使可视化移植细胞/组织的工作方式,并与主机交互。

然而,重组与小分子化合物的方法被认为是费时,不适合临床应用。大约需要40天CiPSC克隆形成,而山中factor-mediated重新编程只需要7天( 35]。在最近的一项研究中,赵et al。 36)可以降低小分子化合物的重组时间16 - 22天。从理论上讲,山中factor-mediated CiPSC重组应该尽快重新编程;差异可能会解决通过分析和识别独特的障碍在小分子化合物的重组。

 5。结论

我们成功地建立了一个红色immunofluorescence-labeled CiPSC血统从荧光protein-tagged小鼠成纤维细胞与Cre / loxP系统。CiPSC重组方法在无血清和nonserum替代情况下,这里报道,应该非常有用的研究小分子的潜在机制compound-induced重组和可以作为筛选平台壁垒的途径。在未来,我们希望建立一个重组的方法,由小分子化合物,尽可能有效和方便的经典实验方法。人类体细胞重编程与小分子化合物将试图在未来的研究中,从而促进临床CiPSCs转型。

 数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

 的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

 确认

这项工作由科技部支持中华人民共和国的中国,国家重点研究和发展项目(2017 yfa0105602 2018 yfa0108700),中国国家自然科学基金(81720108004,81720108004,81720108004),该研究小组中国广东省自然科学基金项目(2017 a030312007),“爬”Program-Guangdong大学生科技创新培训特别项目(pdjh2018a0041)和新湘雅人才项目从第三中南大学湘雅医院(JY201524)。

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