人体细胞的敲除TBX3跌幅重编程效率

抽象

TBX3是T-box转录因子家族成员，参与核心多能性网络。尽管它在多能性网络中扮演着重要的角色，但它在人类诱导多能性干细胞产生过程中的重新编程过程中所起的作用仍然难以捉摸。在这方面，我们进行了重新编程实验TBX3人成纤维细胞和角质形成细胞敲低。击倒的TBX3在两种体细胞类型都降低了重编程效率相比于控制细胞，但没有改变的重编程动力学。产生的诱导多能干细胞与对照细胞没有区别，表现正常体外由所有三个胚层比得上对照的产生细胞分化能力。

1.简介

多能胚胎干细胞（ESC）是从早期胚胎的内细胞团分离。多能性是由高和不定增殖潜能和能力分化成三种胚层的细胞，随后能够产生生物体的所有细胞类型和组织定义。培养和胚胎干细胞研究的可能性，导致了多能性网络有很好的理解，同时也参与细胞分化过程[多种信号通路1，2]。多能性网络由许多转录因子组成，通过调节反馈回路相互连接。基本上，它保持干细胞基因的表达活跃，并抑制参与分化的基因[3，4]。这些转录因子在细胞功能这样的主导作用是由几方面因素，过度表达是能够迫使体细胞回到全能状态。以这种方式，体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPS细胞）的过表达OCT4，SOX2，KLF4,或其它相关因素[五，6]。这种重编程技术的发现，不仅拓宽了多能性网络的理解，但也产生了疾病建模和今后的治疗策略[供者和患者特异性干细胞的重要工具7-12]。

在T-box转录因子家族参与各种过程，包括分化多能性和。在多能性的电路，TBX3已经显示出与芯多能性相互作用的因子NANOG，OCT4，SOX2和，以维持干细胞状态并抑制分化。TBX3线索枯竭分化的鼠多能干细胞[13]。此外，TBX3所维护多能性通过作为Wnt信号的下游活化剂和起着重编程过程通过直接结合和Oct4启动子的活化中起作用。在早期分化过程中，TBX3参与中内胚层分化，心脏发育，和四肢的形成[14]。此外，TBX3高度在定形内胚层祖细胞和与JMJD3一起表达和EOMES促进定形内胚层的形成[15]。在这方面，TBX3被列为中内胚层的多能性转录因子之一。

基于这些发现，我们采用的击倒TBX3在人体细胞研究TBX3在重编程过程中的作用。

2.材料和方法

2.1。角质形成细胞和成纤维细胞培养

脱毛后角质形成细胞的培养主要依据[16]。简言之，角质形成细胞上培养20 μ与HKGS补充物（均来自Gibco）的培养基的EpiLife克/毫升的胶原IV（Sigma-Aldrich公司）包被的培养皿直至它们达到〜70％汇合。

Human foreskin fibroblasts (HFFs) (System Biosciences) were cultivated in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and 1% Glutamax, 1% nonessential amino acids (NEAA), and 1% antibiotic-antimycotic (all from Life Technologies).

2.2。慢病毒制作，病毒感染，并选择

4×10⁶的Lenti-X 293T细胞（Clontech）中以8转染 μ质粒pRRL.PPT.SF.hOKSMco.idTom.pre FRT的克DNA [17]，或者TRIPZ人类TBX3的shRNA（V2THS_135043，GE Healthcare）上加上2 μ克pMD2.G和5.5 μpcr检测psPAX2载体DNA (Addgene 12259和12260 from Didier Trono)μ克/ mL的聚乙烯亚胺（PEI）。的Lenti-X浓缩试剂盒（Clontech）被用于浓缩后两天和四天收集的病毒上清。重悬在病毒的EpiLife粒或HKGS补充。Spinfection with 1000 g for 30 min was used to transduce TRIPZ TBX3 lentivirus into the cells on two consecutive days with a medium change after 4 h, respectively. Infected cells were selected by puromycin (1 μ克/毫升）处理2天。

2.3。饲养细胞，角质形成细胞和成纤维细胞的重编程

从14天胚胎鼠胚胎成纤维细胞（参考文献）根据先前所述的方案产生[18并在含有10%胎牛血清(FBS)、1%谷氨酰胺(Glutamax)、1% NEAA和1%抗生素-抗菌剂(均来自Life Technologies)的DMEM中培养。参考文献被处理为7.5μ克/毫升丝裂霉素C（Biomol公司）2.5小时有丝分裂失活。

如上所述超过两天，用5×10角质形成细胞和成纤维细胞被感染⁸慢病毒颗粒中含有8的适当的介质 μ克/ ml聚凝胺（Sigma-Aldrich公司）。1 μ克/毫升的强力霉素加入到根据从感染的第一天的条件角质形成细胞和成纤维细胞。

感染两天后，角质形成细胞和使用的TrypLE快递（Life Technologies）中的成纤维细胞分离，并接种于1.5×10^五在iPSC培养基中(DMEM F12补充20%敲除血清替代，1%抗生素-抗菌剂，1% NEAA, 1%谷氨酰胺，100)无丝分裂的REF细胞μ中号β巯基乙醇，10 μM Y-27632，50 μg/mL ascorbic acid, and 10 ng/mL FGF2). Incubation conditions for reprogramming cells were 37°C, 5% CO₂和5％氧气₂。重编程的细胞在饲养细胞上进行培养，直到iPSC集落均清晰可见，然后机械地拾取，并转移到Matrigel包被（Corning）中的细胞培养皿为无饲养层培养。

2.4。人iPSC文化，胚层分化

的iPSC是根据[在FTDA介质无饲养条件下培养19]。用于进一步传代和胚层分化，的iPSC使用ReLeSR（干细胞技术）根据制造商的手册分离。形成胚状体，分离的细胞团块悬浮使用超低附着培养瓶（Corning）中培养7天。接种在基质胶包被的培养皿后，将胚状体培养贴壁另外两周。用于胚层分化的iPSC平台。

2.5。免疫细胞化学和碱性磷酸酶染色

4%多聚甲醛(PFA)和10%蔗糖固定细胞15分钟。多能性染色使用StemLight多能性抗体试剂盒，根据制造商推荐的条件(细胞信号)，使用Alexa二抗(均来自Abcam)。免疫细胞化学染色，固定细胞用0.2% Triton-X渗透5分钟，然后用5%牛血清白蛋白(BSA)阻断60分钟。使用的抗体如下:小鼠抗desmin (DAKO, 1:500)，山羊抗sox17 (R&D Systems, 1:500)，兔抗tubb3 (Covance, 1:2000)， Alexa二抗(均来自Abcam)。细胞用4 '，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI) (Life Technologies)的延长金抗褪色试剂固定。

碱性磷酸酶（AP）染色细胞固定在4％PFA两分钟。氮蓝四唑/ 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（NBT / BCIP）溶液根据制造商的方案（Sigma-Aldrich公司）制备的。将细胞用20分钟将底物溶液一起温育，将反应物用磷酸盐缓冲盐水（PBS）停止。照片是在人造光下拍摄一般的相机上相同的采集的设置和曝光时间特别谨慎。集落数进行人工计数或与由背景值的减法之后测量所述井区的总强度的ImageJ软件定量。

2.6。定量逆转录聚合酶链反应

总RNA使用RNeasy MINIKIT（Qiagen）进行细胞裂解物中分离。QuantiTect引子测定，用于补充材料提供的所有实验（QIAGEN，补充表1在线http://dx.doi.org/10.1155/2016/6759343）。

PCR在根据制造商的方案，使用QuantiFast的SYBR Green RT-PCR试剂盒（Qiagen）StepOne扩增仪（应用生物科学公司）进行。相对基因表达计算为靶基因浓度与持家基因hydroxymethylbilane合酶的比（HMBS） 浓度。

3.结果

3.1。人类TBX3敲除细胞的重编程

在我们的实验中，为了排除细胞类型的特异性影响，我们选择了来自不同胚层的体细胞:人包皮中胚层成纤维细胞(HFFs)和人毛囊外胚层角质形成细胞。首先，我们用含有嘌呤霉素抗性的慢病毒载体来感染这两种类型的细胞，以及针对多西环素(DOX)诱导的shRNATBX3（数字图1（a））。成功的嘌呤霉素选择后，将细胞或者用强力霉素处理的（+ DOX）或不治疗作为对照（-DOX）。随后，定义的所有细胞类型的数目被感染重编程慢病毒，含有OCT4，SOX2，KLF4,和C-我的C。两天后，被感染的细胞被转移到有丝分裂失活饲养细胞（大鼠胚胎成纤维细胞）。在指定时间点，收集RNA样品并进行碱性磷酸酶（AP）染色（图图1（b））。TBX3敲低效率在整个通过qRT-PCR重编程过程跟踪。对于HFFS，击倒为〜50％（图1 (c)），同时显示角质形成细胞的大约30％表示在增加后的时间点的初始击倒（图1 (d)）。然而，必须考虑到所有的测量细胞群包含相当量的大鼠饲养细胞的。由于在这两个物种中高度保守的序列，所述饲养细胞部分地向测定TBX3水平。因此，在细胞重编程效率击倒可能是相当高的。

3.2。TBX3击倒减少重编程效率

在重编程过程中，当大的iPS集落清晰可见的端部，进行AP染色并测定了染色的区域。在这两种细胞类型中，的水平降低TBX3导致细胞数量减少，HFF细胞减少23%(非常显著)，角质形成细胞减少91%(图)2(一个)和2 (b)）。值得注意的是，只有角质形成细胞的数量很少感染和重新编程（由于感染后缓慢增殖）导致的iPS克隆的高度数量减少相比，在重编程过程，持续和快速分裂HFFS。既不菌落大小也不菌落形态是在培养物敲低显着改变。减少的重编程效率通过qRT-PCR证实。的RNA水平OCT4，SOX2，和NANOG在这两个TBX3敲低细胞类型额外降低，最可能是由于重编程的细胞（图的下数2 (c)和图2（d））。在以后的通道iPSC中，RNA水平OCT4，SOX2，和NANOG水平是相当的控制文化。此外，在以后的通道敲低细胞中显示的生长相当的速度（未示出）和集落形态。一般测试击倒iPSC的完整多能容量，我们分析了后来通道HFF在多能性因子的表达和分化潜能方面衍生的iPSC的更多细节。的iPSC阳性转录因子OCT4，SOX2，NANOG和以及表面抗原TRA-1-60，TRA-1-81，和SSEA4在免疫荧光染色（图图3（a）），具有可比性的对照细胞。在体外分化实验中，产生阳性的细胞作为TUBB3外胚层标记物，结蛋白作为中胚层标记物，和SOX17作为内胚层标志物的iPSC拦截所示通过免疫荧光染色（图图3（b））。这种能力分化成所有三种胚层可以通过qRT-PCR加以强调（图图3（c））。对敲低细胞和对照细胞之间的不同分化标记可比表达水平表明，敲低不会导致改变的胚层偏好或减少的分化潜能。综合来看，TBX3击倒显著降低了重编程效率，但仍然产生iPS细胞则相当于控制iPSC的。

4。讨论

TBX3是转录因子的多能性网络，该网络保持胚胎干细胞和iPS细胞中的多能状态的芯构件。因此，我们如果击倒感兴趣TBX3表达会影响重编程过程或改变所得到的干细胞在它们的特性。对于这一点，我们使用两种人类细胞类型中，成纤维细胞和角质形成细胞，含有诱导的shRNA针对TBX3。这些细胞的重编程并没有表现出改变重编程的动力学，但是降低重编程效率比对照细胞。这个结果是两种测试的细胞类型相似。所产生的菌落数比对照AP染色显著小。的多能性因子RNA水平在重编程过程中也降低了，这表明较低的多能性的细胞数。后来通道的完全重编程的细胞，但是，并没有表现出多能性因素改变RNA水平。他们也堪比干细胞标志物免疫组化染色控制。分化诱导后，将它们在比得上对照细胞的比率表示三种胚层的标记物，而无需改变的胚层偏好。这停留在对比以前的研究表明TBX3抑制敲除神经花环形成[20]。然而，由于我们只研究RNA水平，而不是神经花环的外观，被干扰的莲座形态不能排除。有趣的是，我们发现，虽然击倒TBX3在整个重编程过程非常稳定，在后面的通道iPSC中是不可见的了。在这里，我们假设的shRNA没有任何进一步降低极低表达水平或iPS细胞可能能够历经数代沉默的shRNA表达。

在未来，研究可以调查是否降低重编程效率，与观察TBX3敲除细胞，也将存在于TBX3或者这些细胞甚至完全不能被重新编程。如果可以通过这种方式获得稳定的诱导多能干细胞，则需要对其分化行为进行详细研究，因为众所周知，TBX3在某些分化途径中也有重要作用。

利益冲突

作者宣称没有关于本文的发布利益冲突。

作者的贡献

Stefanie Raab和Moritz Klingenstein对本文同样有贡献。

致谢

笔者想感谢克拉拉密斯巴的技术援助。这项研究是由德意志研究联合会（斯特凡Liebau BO1718 / 4-1）时，Forschungskern SyStaR亚历山大Kleger，BIU（勃林格殷格翰乌尔姆亚历山大Kleger），以及否则，克朗 - 费森尤斯基金会（2011_A200，亚历山大Kleger资助和Stefan Liebau）。亚历山大Kleger欠下巴登 - 符腾堡州基金会由Eliteprogramme为博士后这一研究项目的资金支持。亚历山大Kleger也是一个else-克朗，费森尤斯纪念馆研究员。莱昂哈德林塔由医学Tübingen的学部（2248-0-0）的财富初级资助。

补充材料

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