SCI 干细胞国际 1687 - 9678 1687 - 966 x Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/6759343 6759343 研究文章 TBX3击倒人体细胞的重编程效率降低 http://orcid.org/0000 - 0002 - 1476 - 4939 Klingenstein 莫里茨 1 http://orcid.org/0000 - 0001 - 9682 - 0211 拉布 斯蒂芬妮 1 Achberger 凯文 1 Kleger 亚历山大 2 http://orcid.org/0000 - 0003 - 0721 - 8187 Liebau Stefan 1 http://orcid.org/0000 - 0002 - 5439 - 8101 Linta 里昂哈 1 张 苏淳 1 神经解剖学研究所 埃伯哈德卡尔图宾根大学 72074年图宾根 德国 uni-tuebingen.de 2 内科 乌尔姆大学 89081年乌尔姆 德国 uni-ulm.de 2016年 30. 11 2015年 2016年 24 04 2015年 02 07年 2015年 30. 11 2015年 2016年 版权©2016莫里茨Klingenstein et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

TBX3 T-box转录因子家族的成员,参与核心多能性网络。尽管这个角色在多能性网络,其贡献重组过程的生成人类诱导多能干细胞仍然遥遥无期。在这方面,我们进行了重组实验应用 TBX3可拆卸的人类成纤维细胞和角质细胞。击倒的 TBX3在体细胞类型比较来控制细胞的重编程效率下降但不变重组动力学。结果则是区别控制细胞和正常显示 在体外生成细胞分化能力的所有三个胚芽层与控制。

 1。介绍

ESCs多能胚胎干细胞()是孤立的早期胚胎内细胞团的。多能性被定义为高和无限增殖的潜力和能力分化成三个生殖细胞层,随后能够生成所有生物体的细胞和组织。ESCs的培养和调查的可能性导致多能性网络很好地理解,而且各种信号通路参与细胞分化事件( 1, 2]。多能性网络由许多转录因子,彼此相互联系的监管反馈循环。基本上,它使干细胞基因表达的活性和压制基因分化 3, 4]。这些转录因子等细胞功能的主导作用,超表达的几个因素能够迫使体细胞回到多能性状态。这样,体细胞重编程为诱导多能干细胞(万能)的过度 OCT4, SOX2, KLF4,或其他相关因素( 5, 6]。这种编程技术的发现不仅扩大了多能性网络的理解也是一个宝贵的工具来生成捐赠者和患者特定的干细胞疾病建模和未来的治疗策略( 7- - - - - - 12]。

T-box转录因子家族参与了各种各样的流程包括分化和多能性。多能性电路,TBX3已被证明与核心交互NANOG多能性因素,OCT4、SOX2,维持干细胞状态和抑制分化。Tbx3枯竭导致小鼠多能干细胞分化( 13]。此外,Tbx3奉行多能性作为下游活化剂的WNT信号和重编程过程中扮演了一个角色通过直接绑定和Oct4启动子的激活。在早期分化过程,Tbx3参与mesendodermal分化,心开发和肢体形成( 14]。此外,Tbx3定内胚层祖细胞中高度表达,加上Jmjd3和加工促进内胚层的形成( 15]。在这方面,Tbx3被分类为一个mesendoderm多能性转录因子。

基于这些发现,我们应用的可拆卸的 TBX3在人类体细胞调查TBX3重编程过程的作用。

 2。材料和方法 2.1。角化细胞和成纤维细胞培养

角化细胞的培养从摘头发主要是根据执行 16]。总之,角化细胞培养在20 μg / mL胶原IV (Sigma-Aldrich)涂覆盘子EpiLife介质与香港补充(来自Gibco),直到他们到达confluency ~ 70%。

人包皮成纤维细胞(高频电炉)(系统生物科学)被种植在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫和Glutamax 1%, 1%不重要的氨基酸(NEAA), 1% antibiotic-antimycotic(所有从生活技术)。

 2.2。慢病毒生产,感染,和选择

4×106Lenti-X转染293 t细胞(Clontech) 8 μg的DNA质粒pRRL.PPT.SF.hOKSMco.idTom。pre FRT [ 17),或人类TBX3 TRIPZ成分(V2THS_135043,通用电气医疗集团)一起2 μg pMD2。G和5.5 μg psPAX2向量的DNA (Didier Trono Addgene 12259年和12260年)使用1 μg / mL表面(PEI)。Lenti-X集中器套件(Clontech)是用于病毒上清液集中收集后2 - 4天。病毒颗粒在EpiLife resuspended香港补充。与1000克Spinfection 30分钟用来转换TRIPZ TBX3慢病毒进入细胞后与媒介变化连续两天4 h,分别。感染细胞是由嘌呤霉素(1 μg / mL)治疗了两天。

 2.3。馈线细胞重编程的角化细胞和成纤维细胞

鼠胚胎成纤维细胞(参)从胚胎第14天生成根据描述的协议之前 18),在含10%胎牛血清的DMEM培养的边后卫,1% Glutamax NEAA 1%, 1% antibiotic-antimycotic(所有从生活技术)。参考文献7.5处理 μg / mL丝裂霉素C (Biomol)为有丝分裂失活2.5小时。

角化细胞和成纤维细胞被感染如前所述在两天5×108慢病毒颗粒在适当的介质包含8 μg / mL聚凝胺(Sigma-Aldrich)。1 μg / mL强力霉素是添加到角质细胞和成纤维细胞条件取决于感染的第一天。

感染后两天,角质细胞和纤维母细胞分离使用TrypLE表达(技术)和被播种在1.5×105细胞有丝分裂活动的裁判在iPSC介质(DMEM F12补充20%击倒血清替代品,antibiotic-antimycotic 1%, 1% NEAA Glutamax 1%, 100 μ米 β巯基乙醇,10 μy - 27632 M, 50 μg / mL抗坏血酸,和10 ng / mL FGF2)。孵化条件重新编程细胞37°C, 5%的公司2,5%的人啊2。对馈线细胞重编程细胞培养,直到iPSC殖民地清晰可见,然后被机械地选择和转移到Matrigel-coated(康宁)细胞培养菜feeder-free文化。

 2.4。人类iPSC文化,胚层分化

则在FTDA feeder-free条件下栽培介质根据( 19]。为进一步使胚层分化,细胞则被分离使用ReLeSR(干细胞的技术)根据制造商的手册。形成拟胚体,分离的细胞团在悬浮培养使用超低附件烧瓶(康宁)7天。播种后Matrigel-coated菜肴,拟胚体培养两个额外的周附着。iPSC介质用于胚层分化。

 2.5。免疫细胞化学和碱性磷酸酶染色

细胞与4%多聚甲醛固定15分钟(PFA)和10%蔗糖。多能性染色进行使用StemLight多能性抗体包根据制造商的推荐条件(细胞信号)和Alexa二级抗体从Abcam(所有)。胚层分化的免疫细胞化学染色、固定细胞permeabilized Triton-X 0.2% 5分钟,其次是阻止5%牛血清白蛋白(BSA)为60分钟。抗体是使用如下所述:鼠标anti-DESMIN (DAKO, 1: 500),山羊anti-SOX17(研发系统,1:500),兔子anti-TUBB3 (Covance, 1: 2000)和Alexa二级抗体从Abcam(所有)。细胞被安装与延长黄金不变色试剂4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(技术)。

细胞碱性磷酸酶(美联社)染色固定在4% PFA两分钟。氮蓝四唑/ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl磷酸(电视台/ BCIP)准备的解决方案是根据制造商的协议(Sigma-Aldrich)。细胞与基质溶液孵化20分钟和磷酸盐的反应是停止(PBS)。人造光源下拍摄照片和一个正常的相机特别谨慎收购在相同的设置和曝光时间。殖民地的人数清点手动或量化ImageJ软件通过测量的总强度区域减法后的背景值。

 2.6。定量逆转录聚合酶链反应

总RNA分离细胞溶解产物使用RNeasy MiniKit(试剂盒)。QuantiTect底漆化验是用于所有实验(试剂盒、补充表1在网上补充材料 http://dx.doi.org/10.1155/2016/6759343)。

PCR进行StepOne工具(应用生物科学)使用QuantiFast SYBR绿色rt - PCR试剂盒(试剂盒)根据制造商的协议。计算相对基因表达作为一个目标基因浓度比管家基因hydroxymethylbilane合酶( hmb)浓度。

 3所示。结果 3.1。重组人类TBX3击倒的细胞

排除细胞类型特定的影响在我们的实验设置中,我们选择了体细胞来源于不同细菌层:中层人包皮成纤维细胞(高频电炉)和外胚层的人毛囊角化细胞。首先,我们用慢病毒载体感染两种细胞类型包含一个嘌呤霉素耐药性感染细胞的选择以及强力霉素诱导成分针对(阿霉素) TBX3(图 1(一))。嘌呤霉素选择成功之后,细胞接受强力霉素(+阿霉素)或不及时治疗作为对照(−强力霉素)。随后,所有细胞类型的定义数量是一个重组慢病毒感染,包含 OCT4, SOX2, KLF4,和C - MYC。两天之后,感染细胞转移到mitotically灭活馈线细胞(鼠胚胎成纤维细胞)。在表示时间点,RNA样本收集和碱性磷酸酶(美联社)染色进行(图 1 (b))。 TBX3可拆卸的效率被存在在整个重组过程中追踪。对于高频电炉,可拆卸的~ 50%(图 1 (c)),角化细胞显示大约30%的初始击倒在之后的时间点增加(图 1 (d))。然而,它必须考虑所有测量细胞群包含大量的老鼠馈线细胞。由于两种物种中高度保守序列,馈线细胞导致测量的部分原因 TBX3的水平。因此,可拆卸的重编程细胞的效率可能会相当高。

重组成纤维细胞和角质细胞 TBX3可拆卸的。(一)感染与TRIPZ人类成纤维细胞和角质细胞 TBX3shRNA慢病毒,通过强力霉素诱导。与成纤维细胞(b)重组时间计划(左)和角化细胞(右)以及细胞数量和实验时间点开始。(c) TBX3击倒在重组成纤维细胞在第0天(馈线上播种感染细胞层),第二天,第四天,17日到25天(最后一天馈线基底膜基质细胞在转移之前feeder-free系统)。控制不是用强力霉素治疗。(d) TBX3击倒在角化细胞重编程在第0天(馈线上播种感染细胞层),第二天,第五天,天22日(最后一天馈线基底膜基质细胞在转移之前feeder-free系统)。控制不是用强力霉素治疗。

 3.2。TBX3击倒减少重组效率

在重组过程的结束,当大iPS殖民地都清晰可见,美联社进行了染色和染色测量领域。在这两种类型的细胞,减少的水平 TBX3导致数量减少的殖民地,23%高频电炉在角化细胞(非常重要)和91%(数据 2(一个)和 2 (b))。值得注意的是,只有一个非常低的角化细胞被感染和重组(由于缓慢扩散感染后)导致一个高度减少数量的iPS殖民地不断分裂的高频电炉相比,快速在重组过程中。蚁群的规模和菌落形态明显改变在可拆卸的文化。证实了减少重组效率中存在。的RNA水平 OCT4, SOX2,和 NANOG另外两TBX3击倒细胞减少,很可能由于低数量的重新编程细胞(数据吗 2 (c)和 2 (d))。则在后面的通道,RNA水平 OCT4, SOX2,和 NANOG文化水平与控制。此外,可拆卸的细胞之后的段落显示类似的增长速度(图中未显示)和菌落形态。一般测试完整的多功能可拆卸的万能干细胞的能力,我们分析后通过高频电炉派生细胞则详细的多能性因子表达和分化潜能。转录因子OCT4则是积极的,SOX2, NANOG以及表面抗原TRA-1-60,交易- 1 - 81,SSEA4在免疫荧光染色(图 3(一个)),与控制细胞。在一个 在体外分化实验,可拆卸的万能生成细胞阳性TUBB3外胚层的标记,肌间线蛋白中胚层的标记,和SOX17内胚层的标记免疫荧光染色(图如图所示 3 (b))。这种能力分化成三个可以突显出胚芽层中存在(图 3 (c))。类似的表达水平不同击倒和控制细胞之间分化标记表明,击倒不会导致胚层偏好的改变或减少分化的潜能。综上所述, TBX3击倒显著降低重编程效率,但仍然引起细胞则是与控制万能。

TBX3击倒在成纤维细胞和角质细胞重组导致减少重组效率。(a)碱性磷酸酶(美联社)染色纤维母细胞重编程的17天有高度显著减少(23%)的iPSC殖民地。(b)碱性磷酸酶(美联社)染色在22天的角化细胞重组减少(91%)的iPSC殖民地。(c)相对的表达 OCT4, SOX2,和 NANOG在纤维母细胞重新编程。(d)相对的表达 OCT4、SOX2和 NANOG在角化细胞重编程。

重组成纤维细胞在 TBX3可拆卸的作为控制万能干细胞属性相同。(一)多能性染色成纤维细胞产生的细胞则是正的多能性标记OCT4、SOX2, NANOG以及表面标记TRA-1-60,交易- 1 - 81、SSEA4。(b)的免疫细胞化学胚层分化显示阳性染色为外胚层(TUBB3),中胚层(肌间线蛋白)和内胚层(SOX17) TBX3分别击倒和控制。(c)外胚层的基因的表达( TUBB3, PAX6)、中胚层的基因( T, MYH6)和内胚层的基因( 据法新社,FOXA2)在胚层分化多能分化潜力的控制和生成的万能 TBX3可拆卸的细胞。酒吧规模:100 μm。

 4所示。讨论

TBX3核心成员保持ESCs的多能性的转录因子网络和万能干细胞多能性状态。因此,我们感兴趣的如果击倒 TBX3表达重组过程会影响或改变产生的干细胞特性。为此,我们使用了两种人类细胞,成纤维细胞和角质细胞,含有一个诱导成分针对 TBX3。重新编程的细胞没有显示重组动力学改变但降低控制细胞重编程效率相比。这两个测试的结果是相似类型的细胞。殖民地的数量产生显著小于控制AP染色。RNA水平的多能性因素也减少了在重组过程中,表明较低的多能细胞数量。完全重新编程的细胞之后的段落,然而,并没有表现出改变RNA水平的多能性因素。他们也与控制干细胞标记免疫荧光染色。诱导分化后,他们表示标记的三个胚芽层比例与控制细胞,没有改变胚层偏好。这与先前的一项研究表明 TBX3可拆卸的抑制神经形成莲座丛( 20.]。然而,由于我们只研究了RNA水平而不是神经圆花饰的外观,干扰玫瑰形态不能被排除在外。有趣的是,我们发现尽管击倒 TBX3非常恒定在重组过程中,在后面的通道则是不可见的。在这里,我们假设shRNA并不减少进一步表达水平很低或万能可以沉默shRNA表达式后几个段落。

未来的研究可以探讨如果重编程效率的降低,与观测到的 TBX3可拆卸的细胞,也会出现在 TBX3耗尽细胞或如果这些细胞甚至无法被重新编程。如果可以获得稳定的细胞则通过这种方式,他们的分化行为应该详细研究因为TBX3是众所周知的,在某些分化途径也有重要贡献。

 利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

 作者的贡献

斯蒂芬妮拉布和莫里茨Klingenstein同样对本文亦有贡献。

 确认

作者要感谢克拉拉Misbah技术援助。这项研究是由德国Forschungsgemeinschaft (Stefan Liebau BO1718/4-1),该Forschungskern SyStaR亚历山大Kleger,乌尔姆(Bohringer殷格翰集团亚历山大Kleger),国际和Else-Kroner-Fresenius-Stiftung (2011 _a200亚历山大Kleger和Stefan Liebau)。亚历山大Kleger亏欠的巴登-符腾堡州Stiftung Eliteprogramme金融支持的研究项目的博士后。亚历山大Kleger也是一个Else-Kroner-Fresenius纪念的。里昂哈Linta支持财富初级格兰特医学院的图宾根(2248-0-0)。

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