真正滋养层干细胞转录特征的来源及其胚胎持久性分析

摘要

滋养层干细胞(TSCs)代表多能祖细胞，产生胎盘胚胎部分的不同细胞。在这里，我们分析了关键的TSC转录因子的表达Cdx2,加工,Elf5在小鼠胚胎早期发育的胎盘和培养的TSCs中显示出惊人的蛋白质水平异质性。我们分析了早期胎盘中TSCs的持久性，发现TSCs在E9.5之前一直存在于绒毛膜铰链中，随后不久就消失了。为了确定真正的TSCs的转录特征，我们使用了可诱导的功能增益和功能缺失等位基因加工或Cdx2,，操作和监测TSC的核心维持因子，然后进行全基因组表达谱分析。通过对产生的表达谱进行组合分析，可以定义新的TSC标记基因，这些基因可能在功能上有助于维持TSC状态。通过qRT PCR和原位杂交验证了新的TSC和绒毛膜特异性标记基因，如Bok/Mtd, Cldn26, Duox2, Duoxa2, Nr0b1,Sox21．因此，这些表达数据为善意和早期分化的TSCs的转录特征提供了有价值的资源，并可能有助于增加对维持和/或建立TSCs干性的转录电路的理解。

1.介绍

滋养外胚层(TE)和内细胞团(ICM)是在小鼠发育的胚胎第3天(E3.0)左右的16- 32细胞(桑葚胚)阶段指定的第一个细胞谱系。1.,2.])。两个关键转录因子的相互负反馈抑制Cdx2和Oct4建立血统Cdx2-表达TE和Oct4-阳性ICM细胞[3.–6.］．多种信号，包括细胞极性、细胞间接触、位置信息和Hippo信号，汇聚在yes相关蛋白(YAP)的磷酸化状态上。YAP与TEAD4形成转录复合物激活Cdx2早期胚胎外周细胞的转录，从而启动TE程序[4.–13］．额外的规则层确保血统受到限制Cdx2和Oct4如notch - signaling，与TEAD4协同直接调控Cdx2表达式[14］．同样的，转录因子AP2γ促进Cdx2表达和下调河马信号[15］．GATA3与CDX2和TEAD4下游平行作用，在滋养细胞谱系中诱导一组目标基因重叠[16］．在极地TE,这被定义为它附近的ICM (E3.5)胚泡阶段,人口的滋养层干细胞(tsc)是建立和维护由ICM-derived Fgf Nodal-signals,生成的主要细胞来源形成的胚胎部分胎盘(13,17–20.］．按照最初的规格TE命运由Cdx2-功能，额外的转录调控因子，包括加工［4.),Elf5［21]，在TE谱系中开始表达或变得特别局限于TE细胞，如AP2γ［22,23].在E4.5左右植入后，极性TE产生胚外外胚层（ExE），其中包含TSC和外胎盘锥（EPC），介导胚胎侵入蜕膜壁，然后将胚胎连接到母体子宫。TSC仅在极性TE和ExE中保留其干细胞特征，即自我更新能力和多能性，而壁性TE的细胞缺乏来自ICM的支持信号，因此分化为原代滋养层st巨细胞（TGCs）[17］．TSC的维持是由转录通路控制的Elf5［24,25]，Ets2［26),而AP2γ［23,27，以正前馈循环的方式进行维护Cdx2和/或加工表达式。E7.5之后，TSC标记基因的核心集合，包括Cdx2,加工,Elf5,Esrrβ，除其他胚胎和胚胎外表达域外，仍在绒毛膜中表达[24,28–30］．

在规定的条件下，可以从E3.5囊胚和E6.5 ExE外植体常规分离和培养TSCs [17］．评估潜在的分离细胞,TSC字符E6.5之外,Uy和他的同事们已经表明,频率获得TSC克隆增加直到4-somite两阶段(~ E8.0 E8.25)然后迅速下降,不能孤立的TSC 11-somite后两阶段围绕E8.5 E8.75 (31］．T-box转录因子加工以前用于标记TSC在不同发育阶段和表达加工：：绿色荧光蛋白直到E14.5，小鼠胎盘外周均检测到BAC转基因[32］．迄今为止，直到具有TSC特征的胚胎期细胞维持在TSC生态位(功能上由高水平的Fgf和Tgf定义)时，才被清楚地显示出来β信号(17,33］．除了加工［34),Cdx2［35，其他转录因子在TSC的自我更新和多能性等方面也有共同的重要功能Elf5［24]，Esrrβ［29]，Ets2［26]，AP2γ［23,27,36),而Sox2［37］．最近的一份报告显示组蛋白去甲基化酶功能缺失Lsd1导致TSCs过早地从其生态位迁移，表明对TSCs的繁殖需要适当的表观遗传调控[38,39］．

除了在TSC维护期间的功能重要性，Cdx2［3.,11]，加工［3.]，Elf5［25]，Tead4［11]，AP2γ［23),而Gata3［16[当过表达时，亦会引起小鼠胚胎干细胞向TE细胞系的转变(在[40])。而转录程序涉及Cdx2,加工,Elf5,AP2γ,Ets2是维持滋养层干性状态的关键，这些转录因子的基因缺失产生显著不同的胚胎表型。Cdx2-缺陷导致植入缺陷[41]，加工-缺陷胚胎显示早期的胚胎移植后[34，以及删除Elf5［24]，Ets2［26,42,43),或AP2γ［36会导致胃泌肠后的死亡。这种功能缺失表型的多样性可能表明这些因素对维持茎干调节回路的不同需求。或者，不同状态的TSCs可能存在不同的发育潜力和转录调节的不同需求，类似于不同的多能性状态，如naïve或启动多能干细胞中发现的[39,44］．

在目前的研究中，我们分析了关键茎干维持因子的内源性表达，Cdx2,加工,Elf5，通过重叠标记基因表达来表征TSCs。我们追踪加工并证明在起源于绒毛膜铰链的区域E9.5附近缺失。令人惊讶的是，TSC标记在晚期TSC生态位的不同区域一致显示异质性的部分非重叠表达，这可能表明胎盘发育过程中TSC的不同状态。对保持茎干条件下培养的TSCs的分析还发现了异质性的TSC标记表达在体外，强调了我们在绒毛膜胚胎分析中的发现。为了确定描述未分化、真实TSC的转录状态，并监测早期TSC分化过程中的转录变化，我们使用遗传工具进行操纵加工和Cdx2在TSC培养物中表达，然后进行全基因组转录谱分析。首先，我们生成了含有报告等位基因，从而标记善意的通过荧光激活细胞分选（FACS）富集TSC，并通过去除干细胞维持条件迫使其分化。第二，我们使用TSC，允许诱导性缺失加工第三，我们利用诱导表达关键的TSC转录调控因子Cdx2和加工在小鼠ES (mES)细胞中鉴定下游靶基因。由此产生的差异表达谱可以详细描述TSC特征和早期分化过程中的变化，这些变化可能直接或间接地受到Fgf-和Tgf联合调控β-信号传导和TSCs的关键调控因子，Cdx2,加工．我们使用得到的表达谱来鉴定新的候选TSC标记基因在茎干状态。为了验证这种方法，我们选择了一些差异表达的基因，并在真正的TSCs和早期分化期间通过qrt - pcr进行了检测。此外，新候选基因的表达在授精后胚胎的TSC室中进行了分析通过原位杂交分析。综上所述，本研究描述了胚胎和体外培养的TSCs的表达特征。

2.材料和方法

2．1．细胞培养

从动物E3.5囊胚中分离到基因修饰的TSCs［45]，［47),而［58]根据标准协议[17]在干细胞维持条件（SMC）中培养的TSC保存在70%的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）条件TSC培养基（MCM）中，并在MEF上添加hrFGF4和肝素（F4H）[17］．在分化条件(DC)中，将TSCs置于不含MCM和F4H的TSCs -培养基中，置于不含喂食细胞的糊化板上培养[17].Cre介导的条件性肿瘤切除术等位基因是通过注射1 μg/mL 4-羟基三苯氧胺（Sigma-Aldrich，H7904）加入培养基中最多3天。

产生可诱导表达的mES细胞Cdx2或加工作为对强力霉素给药的回应，我们使用A2lox.cre mES细胞进行了诱导盒交换（ICE）[59和使用网关克隆的p2lox-V5载体系统(Invitrogen公司)[48］．1μg/mL强力霉素（Fargon，137087）加入由DMEM（Gibco，11960）、15%ES细胞合格FBS（Gibco，16141）组成的ES细胞培养基中，2 mM L-谷氨酰胺（Gibco，25030），50 U/mL青霉素/50 μg/mL链霉素(Gibco, 15070)， 0.1 mM非必需氨基酸(Gibco, 11140)， 1 mM丙酮酸钠(Gibco, 11360)， 0.1 mMβ-巯基乙醇(Sigma Aldrich, M7522)和1,000 U/mL白血病抑制因子(默克Millipore, ESG1107)。

2．2.流式细胞术

单细胞悬浮液SMC培养的TSCs经流式细胞术纯化细胞使用MoFlo Legacy细胞分类器(Beckman Coulter)。选择的细胞在无MEF喂养细胞的SMC中重新播种24小时，然后制备RNA。

2.3.E7.5–E14.5组织切片的免疫荧光染色

全蜕膜(e6.5 ~ e8.5)或胎盘(e10.5 ~ e14.5)将孕妇置于冰上，PBS洗涤，4% PFA在4°C下固定1 h (E6.5, E7.5)或3 h (E8.5-E14.5)。固定组织在PBS中冲洗，依次转移到15%和30%溶于PBS的蔗糖中，直到样品不再漂浮。组织随后在包埋培养基(7.5%鱼皮明胶，15%蔗糖)中37℃孵育1小时，并在液氮中快速冷冻。冷冻块在8点切割μm切片在低温恒温器(CM3050s，徕卡)，切片安装在SuperFrost Plus幻灯片(R. Langenbrinck, 03-0060)。按免疫荧光法对TSCs进行清洗、阻断、一、二抗孵育和DAPI染色。

2.4.TSCs的免疫荧光染色

TSC培养物在0.1%明胶包覆的盖玻片上生长，用PBS短暂冲洗，然后用4%的PFA在冰上固定30分钟。用含0.1%吐温-20 (PBS- t)的PBS清洗固定细胞，用含5%牛血清白蛋白(BSA-T)的PBS- t封闭1小时，并与一抗孵育(补充表S1可在以下网站获得)http://dx.doi.org/10.1155/2015/218518)， 5% BSA-T在4°C下过夜。洗掉一抗后，用5% BSA-T稀释的偶联二抗(补充表S1)在RT下孵育45分钟。用1:1000稀释的DAPI PBS对细胞进行RT反染10分钟，用Fluoromount-G固定。荧光图像是在Zeiss Axiovert 200 M上拍摄的，配备了一个20倍的平面消色差物镜。显示的图像最终被合并，并使用adobephotoshopcs5软件调整亮度。

2．5．微阵列和定量RT-PCR的RNA制备

使用RNeasy Mini Kit (QIAGEN, 74104)从TSC和ES细胞培养皿中纯化总RNA，使用350μ每6个RLT裂解缓冲液 cm培养皿。在柱上进行DNaseI消化，并在50℃下洗脱RNA μL - RNase游离水，产生浓度为179-1.686 ng/μL核糖核酸。

2.6。微阵列和微阵列数据分析

为了识别在TSCs中过度表达的基因，从微阵列获得的基因表达数据集中筛选出阴性率最高的(TSC分化和)或积极的(诱导的)加工或Cdx2表达式)褶皱的变化。由诱导得到的列表加工删除或诱导Cdx2或加工此外，与各自对照相比，对调控至少1.5倍的基因进行表达过滤。只有基因值≤0.05为进一步分析考虑。最后，计算每个基因在mES细胞和tsc实验亚群中的中位表达值。利用Manteia数据挖掘系统(http://manteia.igbmc.fr/）.

2.7。定量RT-PCR验证和统计学分析

反转录使用QIAGEN quantitative reverse transcription Kit(205311)，按协议输入1.0μg RNA /样本。采用Roche Light Cycler 480 (SN: 1126)检测系统和Light Cycler 480 DNA SYBR Green I Master kit (Roche, 04707516001)以及附录表S2中列出的引物，从3个独立实验中进行3个重复的定量PCR。36 b4和 β猫作为参照基因。相对于第0天(设置为1)，mRNA表达水平随时间的变化进行计算。使用双侧学生进行统计分析-检验和平均的标准误差计算的每个数据集组成的生物三联，每个技术三联。

2.8。验证通过原位杂交

将含有蜕膜的胚胎解剖并固定在4%的PFAin PBS中，通过乙醇系列脱水，并在8小时前包埋在石蜡中 μM切片在徕卡RM2165切片机上制备。原位石蜡切片杂交按标准方案进行[60)使用韩国元/公吨-，Cldn26-，Cyp26a1-，Duox2-，Duoxa2-，加工-，Nr0b1- - - - - -,Sox21-根据标准方案进行曙红复染[60］．

2.9。动物

根据机构指南和区域委员会的批准，所有小鼠均被安置在弗莱堡大学医学中心的无病原体屏障设施内。

3.结果

3.1.真正的TSC以以下共同表达为标志：加工,Cdx2,Elf5从E9.5周围的绒毛膜铰链处消失

为了研究胎盘发生过程中TSC的空间和时间分布，我们使用针对EOMES、CDX2和ELF5的特异性抗体，结合前面描述的方法，进行了详细的免疫荧光（IF）染色记者等位基因(45]在E6.5早期原肠胚形成期间，可在胚外外胚层（ExE）的TSC室、原始条纹（PS）和内脏内胚层（VE）中检测到EOMES蛋白和GFP报告基因（图1.（a） –1.（a′）[45］．一天后，在E7.5加工表达被细化到绒毛膜的一个亚区，我们称之为绒毛膜铰链（ChH），并且在绒毛膜的其余部分表达逐渐减少（图1）1.（b） ）。CDX2在E7.5处与绒毛膜内的EOMES共定位，但与EOMES不同，染色强度没有逐渐变化，并且在整个绒毛膜内是均匀的（图1.(b))。此外，在尿囊的胚外中胚层也发现CDX2(图1.(b))。最后，我们为表达染色Elf5的正向调控，在维持TSC干性的转录回路中起作用加工和Cdx2表达式[25］．最强的ELF5染色在ChH和外胎盘锥体(EPC)面向外胎盘腔的远端检测到，而在绒毛膜的其余部分和EPC近端检测到降低的水平(图)1.（c） ）。在E8.5，表达EOMES的细胞留在ChH的尖端，ChH与周围组织分离，而绒毛膜的中央部分已开始与尿囊和EPC融合（图1.(d) -1.（d′）。EOMES阳性细胞几乎完全从形成胎盘的E9.5周围丢失（图1.(e)和1.(e’))，从前ChH发出的区域只有少量EOMES染色(图1.（e′）。E10.5之后，除了最可能代表胎盘自然杀伤细胞的单个EOMES阳性细胞外，无法检测到胎盘EOMES染色（图1.(e)和1.（f） )[46］．综上所述，这些详细的标记分析表明eome阳性的TSCs在E9.5之前仍在绒毛膜铰链处作为TSCs的功能干细胞生态位，在之后的时间点未发现。

3.2.培养物中的TSC显示出干细胞因子的异质染色，并且可以通过高水平的记者表情

TSCs可在Fgf-和Tgf连续刺激的条件下培养β-长时间和多次传代的生长因子[17,33］．然而,tsc在体外在干细胞维持条件下，约5-10%的TSCs向滋养层巨细胞分化，早期表现为细胞核和总细胞大小的增加。因此，TSC培养物本质上在不同程度上含有不同类型的细胞。学习培养的TSC的异质性程度,我们首先研究了TSC的coexpression使用CDX2抗体标记,加工,和ELF5 TSC支线层上培养的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的存在MEF-conditioned TSC-medium (MCM),人类重组FGF4 (hrFGF4)和肝素(F4H)(数据2.（a） –2.(c))。EOMES和CDX2的双if染色显示了令人惊讶的相互染色程度。主要是集落外围细胞CDX2染色较强，EOMES信号较弱。与CDX2和EOMES双阳性细胞相比，这些CDX2阳性细胞的细胞核明显增大，提示它们可能是从正常的核小、胞体小的TSCs分化而来。eome和CDX2的标签(图1.(a))、EOMES和ELF5(图1.(b))， CDX2和ELF5(图1.(c))在小细胞中一致发现，可能代表真正的TSCs。在较大、分化程度较高的细胞中，CDX2信号仅与EOMES和ELF5部分重叠(图)1.（a） 及1.（c） ），而ELF5-和EOMES染色在所有细胞类型中主要重叠（图1.(b))。

为了分析携带茎干指示报告基因的TSCs，我们从携带该基因的E3.5囊胚中生成了TSCs敲入等位基因(45］．描述结果比较gfp报告基因的表达α-EOMES抗体染色。报告蛋白和EOMES蛋白表达广泛重叠，最高水平的EOMES蛋白染色反应最强的报告蛋白活性(图)2.(d))。例外的是，有丝分裂的细胞散核EOMES染色，而细胞质GFP表达仍可清晰检测。最高水平的gfp报告基因在形态学上符合真正的TSCs的小细胞群中被发现。综上所述，我们对培养的TSCs进行的标记分析表明，只有将多个茎干性标记结合在一起才能对真正的TSCs进行明确的鉴定。然而，产生的TSCs携带等位基因是分离未分化TSC纯群体的合适工具()其特点是高水平表达加工．

3．3.不同的实验设置描绘了真正的TSCs的转录特征

TSC允许浓缩细胞代表完全未分化，因此是真正的TSCs。这些应该作为一个合适的来源来描述TSC茎干的转录特征。加工维持TSCs处于未分化状态和基因缺失加工禁止TSC维持及诱导分化[34,41］．反过来，表示加工或Cdx2(和其他因素)在mES细胞中启动转录程序，诱导谱系向TSC谱系转变[3.］．目的确定TSCs在其真实茎干状态下游的转录特征加工和Cdx2，我们采用三个实验设置，然后进行全基因组表达分析(图3.).首先，我们丰富了贸易与供应链将干细胞培养条件下的细胞与通过停用MCM、F4H和mef而分化的细胞进行对比(通过基因表达谱分析，每隔三天进行一次)3.(a))。在第二种方法中，我们诱导cre介导的TSCs基因缺失加工条件等位基因与他莫昔芬- (Tx-)诱导的crea -雌激素受体融合(;） ［47，每隔24小时监测基因表达3天(图3.（b） ）。通过PCR监测重组效率（图3.(b’))和EOMES水平的Western blot结果显示，给药后24小时EOMES蛋白几乎缺失(图3.(b))。第三，识别被积极调节的基因加工或Cdx2，我们生成了可诱导过表达这两种转录因子的mES细胞。通过位点特异性引入包括n端融合到V5-tag的cdna，产生了可诱导表达的mES细胞[48转化为工程化的强力霉素诱导物Hprt利用可诱导盒交换（ICE）检测p2lox mES细胞的基因座[49］．由此产生的mES细胞允许暂时调节和中度过表达水平加工或Cdx2在通过Western blot监测的mES细胞中（图3.(c)和3.(c))。在强力霉素诱导前和诱导表达后24和48 h，检测mES细胞的表达谱，以鉴定早期诱导的下游基因加工或Cdx2启动mES细胞向TE谱系的转变。所有这三种实验设置随后被用于基于基因阵列的转录分析(见补充表S3)。

3．4．比较表达谱揭示了TSCs的转录特征

揭示构成和/或维持关键转录因子下游稳定TSC状态的转录信号加工和Cdx2，我们对我们的独立基因阵列数据集进行了综合分析，并确定了那些在多次实验中显示差异表达的基因(图4.所有实验干预均导致差异基因表达的总体变化，差异基因表达的变化由1.5倍以上的基因表达变化来定义在三个生物复制中的值低于0.05，并且基因表达的平均水平高于设定的背景阈值。为了在多个实验中确定表现出差异表达的基因，我们分析了（1）在富含FAC的细胞分化过程中300个最下调基因之间的基因交叉点(2) 189个基因在诱导后表达下调加工(3)与mES细胞相比，TSCs中相对表达量最高的300个基因(TSCs中中值表达量与mES细胞中中值表达量的比值);(4)498个基因在诱导反应中上调Cdx2表达，和（5）147个基因，这些基因在诱导的免疫应答中上调加工在mES细胞中的表达(图4.和补充表S4)。差异表达基因的交集用维恩图表示，相应的基因组列在表中(图4.(b) -4.(d)和补充表S4)。

在第一次比较分析中，我们调查了(1)在分化中下调的基因的交集TSCs，（2）在TSCs中诱导缺失加工(3)与mES细胞相比，TSCs中相对表达量较高(图3)4.(b))。16个基因(G组)符合这些标准，因此被认为是候选基因加工靶基因，这些基因在TSCs分化过程中丢失。在这组中有已知的特异性TSC标记，Elf5,和加工本身。此外，这组基因包含以前在TSCs中没有描述过的新基因，例如Duox2和Duoxa2或Cldn26。Cdx2不包括在交集里，自删了加工只造成了轻微的减少Cdx2在实验的短时间间隔内。

接下来，我们比较了(1)在分化过程中下调的基因(4)正调控Cdx2(3) tsc特异性(图3)4.(c))。包括由此产生的15个基因加工,Elf5,Cdx2本身。

比较由Cdx2或加工启动mES细胞向tscs样细胞的转化，我们分析了交叉的tscs特异性基因(3)，这些基因在两天后上调Cdx2(4)或加工(5)归纳(图4.(d))。令人惊讶的是,除了加工，两者均未显著上调已知TSC因子Cdx2和加工经过两天的诱导表达。然而，这可能反映了之前的观察加工在mES细胞转化为TSCs过程中，与Cdx2．而Cdx2表达在48小时内启动TSC特异性基因表达，包括表达上调加工和Elf5，Eomes尽管已发表的表达呈正调控，但在2天的间隔时间内未能有效诱导tsc特异性基因的表达加工目标,如Fgf5，Mesp2，和Mixl1［50,51］．

为了验证差异表达基因的基因阵列数据，我们对已建立的TSC标记基因和选择的差异调控基因交点的基因进行了多次实验的定量rt - pcr。为了验证其在真实TSCs中的特异性表达，我们比较了富流式细胞术的表达水平通过去除维持茎干的条件强迫分化的TSCs水平(图5.）.所有测试的已知和新的TSC标记基因在未分化的TSC中表达最高，诱导分化后表达水平显著降低，表达变化至少有两个量级(图)5.）.

3．5．新的标记基因标记早期胎盘发育中的TSCs

为了验证该方法是否在胚胎发育过程中发现了新的TSCs标记，我们进一步分析了候选基因原位利用E7.5胚胎的组织学切片进行杂交。我们重点研究了在小鼠TE中具有未知功能的基因，例如韩国元/公吨,Duox2,Duoxa2,Nr0b1,Sox21．据我们所知，到目前为止，还没有发现针对TSCs的特异性表面标记物，这些标记物可用于抗体介导的流式细胞术分类。因此，我们进一步分析了跨膜蛋白编码基因的表达Cldn26(Tmem114）.为Sox21结果表明，它参与了肠道和多能干细胞的调节，并由Sox2，是me细胞和TSCs中重要的干细胞因子[52,53］．因此,Sox21也包括在以下分析中。的表达Cyp26a1在滋养外胚层中，以前曾描述过加工作为绒毛膜表达的阳性对照。在7个被检测的新标记基因中，有6个在整个绒毛膜中表达(博克,Cldn26,Sox21)或更具体地局限于绒毛膜铰链(Nr0b1,Duox2,Duoxa2)(图6.）.

总之,原位杂交分析表明，培养过程中TSCs的多模态表达谱为鉴定新的TSC标记基因提供了有价值的资源在体外，也适用于发育中胎盘的TSC。

4.讨论

在本报告中，我们描述了一个资源的转录签名的TSCs。我们利用转基因的TSCs和mES细胞实验干扰下游的TSCs维持干性调节加工和Cdx2，然后是对转录变化的评估。通过对表达数据的综合分析，得到了一份完整的候选TSC标记基因列表，其中少数基因在培养的未分化的TSC和原肠胚绒毛膜中进行了检测和积极验证，其特异性表达。因此，本文提供的表达数据将为进一步研究干细胞干性维持调控回路提供有价值的资源。

使用包含以下内容的TSC：报告等位基因允许纯化在形态和转录特征上，TSCs很可能与真正的TSCs相似，但不会污染TSC培养中通常发现的早期分化TSCs。对应的表达式数据因此，TSC类似于真正的TSC的实际特征，通过我们在其分化过程中发现的基因表达的快速、总体和早期变化来强调。通过去除MCM和F4H或通过对TSC调节因子的遗传干扰，TSC在保持干细胞状态和诱导分化过程中的表达谱latory电路，以前有报道，并显示部分重叠的基因列表[53–55］．然而，从我们的比较表达分析中验证候选基因，发现了几个额外的和新的TSC标记基因。其中包括转录因子Sox21在E7.5胚胎绒毛膜中强烈表达，并在培养的TSCs分化过程中下调。有趣的是，之前已经证明Sox21是由Sox2,不像Sox2［53]，Sox21负调控Cdx2和结肠癌细胞[52］．这种在mES细胞和TSCs中表达的明显差异使Sox21一个有趣的候选人，就像Sox2［53，可能在TSC和mES干性因子的回路中起不同的作用。的功能Sox21和其他在TSC生物学和TE发展的新候选人将在正在进行的研究中解决。

的重要性Cdx2作为谱系决定转录因子，当mES细胞过表达时，可以将mES细胞转化为TSCs [3.]，尽管最近的研究表明，这种谱系转换可能在表型、转录和表观遗传水平上不完全[56］．加工同样具有诱发TSC命运的能力;然而,加工似乎没有那么强大，可能导致更不完整的血统转换[3.］．我们的数据集强调了这一概念，显示了更深刻的转录反应Cdx2相比于加工当从相同的强力霉素诱导位点诱导时的表达。这种差异可能，至少部分地，来自于减少归纳Elf5在里面加工-表达mES细胞，称为核心TSC电路正向前馈调节的中心成分[25］．

虽然CDX2和EOMES以前都被用作TSCs的标记物，但共免疫荧光染色培养的TSCs显示了标记的显著异质性。只有通过小细胞和细胞核大小在形态学上区分的TSCs子集始终显示CDX2和EOMES以及ELF5的共同标记。我们怀疑这些细胞类似于真正的TSCs。这将需要进一步的命运分析来揭示单个关键TSC因子的存在是否预示着未来命运的决定，类似于在胚胎发育和分化me细胞过程中指定关键多能性因子的作用[50,57］．值得注意的是，在壁层滋养层巨细胞(pTGC)中也检测到EOMES(图)1.(e))，因此我们很容易推测，EOMES可能促进了向滋养层巨细胞系的分化。

免疫检测原肠形成晚期绒毛膜中EOMES、CDX2和ELF5，发现剩余绒毛膜中E9.0-E9.5之前存在TSCs，晚期未见EOMES阳性细胞。这些发现与Uy等人的研究一致，他们的研究表明TSCs的存在可以被分离培养到11-体阶段，但不能在之后[31］．另一份使用Eomes::GFP bac -转基因报告基因的报告[32]检测到E14.5胎盘边缘有GFP阳性细胞。然而，这些细胞的性质并没有被详细定义。eome抗体染色无法检测到类似的细胞。因此，我们得出结论，TSCs确实只在绒毛膜剩余部分维持到E9.5，如前所报道的[31］．

总之，这项研究有助于描述胎盘发生早期的TSC和培养中的TSC。我们证明TSC在关键TSC转录因子的蛋白质水平方面表现出显著的异质性。TSC在绒毛膜中的干细胞生态位E9.5左右丢失。我们使用complem利用培养的TSC和ES细胞的遗传工具确定TSC在其完全未分化和早期分化状态下的转录谱。比较分析发现了几种新的TSC标记基因。所提供的数据可作为TSC和相应转录调节因子未来研究的宝贵资源y网络。

利益冲突

作者声明不存在商业利益冲突。

作者的贡献

Sebastian J. Arnold构思了这项研究，Georg Kuales和Sebastian J. Arnold进行了实验并分析了数据。Matthias Weiss和Oliver Sedelmeier协助并指导了一些实验。Dietmar Pfeifer进行了微阵列实验和数据分析。格奥尔格·库亚尔斯把这些数字凑在一起。Georg Kuales和Sebastian J. Arnold是这篇文章的作者和编辑。

致谢

作者感谢Klaus Geiger的FACSMichael Kyba for A2lox ES cells, Hynek Wichterle for P2lox gateway cloning vector, Gerd Walz for Gerd Walz for thoughtful discussion and generous support。这项工作得到了Boehringer Ingelheim基金会给Sebastian J. Arnold的探索拨款、850合作研究中心(SFB 850)的项目拨款(A03)和德国研究基金会(DFG)给Sebastian J. Arnold的Emmy Noether计划(AR732/1-1)的支持。

补充材料

参考文献

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