文摘

外源表达Oct4、Sox2 Klf4, cMyc部队哺乳动物体细胞采用分子和胚胎干细胞的表型特征,开始lineage-associated需要抑制的基因(例如,Thy1在鼠标)。虽然省略cMyc重组鸡尾酒最小化风险的不受控制的增殖,其排斥导致褶皱减少重组效率。因此,替代的可行性cMyc转基因与(non-integrative)“pTAT-mcMyc”重组蛋白质交付评估,在不影响重编程效率或多能表型。净化和交付semisoluble /微粒pTAT-mcMyc Oct4-GFP维护⁺集落形成(即。,reprogramming efficiency) whilst supporting pluripotency by various criteria. Differential repression of Thy1 by pTAT-mcMyc ± Oct4, Sox2, and Klf4 (OSK) suggested differential (and non-additive) mechanisms of repression. Extending these findings, attempts to enhance reprogramming efficiency through a staggered approach (prerepression of Thy1) failed to improve reprogramming efficiency. We consider protein delivery a useful tool to decipher temporal/molecular events characterizing somatic cell reprogramming.

1。介绍

被迫表达四个关键转录监管机构、Oct4 Sox2, Klf4, cMyc,哺乳动物体细胞转化成“诱导多能干细胞”(万能),满足所有多能胚胎干细胞(ES)细胞的标准(1- - - - - -3]。成纤维细胞发生顺序的改变,开始与必要的抑制lineage-associated基因(4,5];Thy1(CD90)是一个glycosylphosphatidylinositol-anchored质膜糖蛋白表达小鼠成纤维细胞和常用的血统基因标记重组文献[5- - - - - -7]。虽然所需内生血统基因抑制(8],外生cMyc表达式是可有可无的诱导多能性,及其遗漏的重组鸡尾酒有利鉴于其链接到肿瘤形成。然而,fold-reductions重组效率通常结果(可能由于维护内胚层监管者和未能激活microRNA基因集群有利于重组;(9- - - - - -11])。因此,应用nonintegrative cMyc概念上绕过了肿瘤形成的风险,同时利用有利影响关于血统基因抑制。

融合蛋白的应用整合(i)阳离子polyarginine标记(用于等离子体跨膜转导)和(2)cMyc序列,结合其他重组蛋白质,靶细胞在体外成功地重组小鼠和人类细胞多能性(12,13]。这些研究从细菌纯化变性蛋白包涵体在重折叠和应用目标细胞(微摩尔的浓度)12),或者应用未知浓度的蛋白质提取物诱导人体细胞没有净化(13]。最初试图净化重组蛋白结合(我)重编程因子域融合(ii)类似arginine-rich基本域(⁴⁹R乐RR问存款准备金率⁵⁷)的HIV transactivating转录激活因子(乙)从细菌包涵体蛋白变性条件下遇到的问题与限制核内体在靶细胞转导(14]。答的转导域绑定到等离子体膜结合硫酸乙酰肝素蛋白聚糖发起转导通过caveolar(“脂质筏”)内吞作用;核间很快之前通过一个输入蛋白α易位,蛋白质机制(15- - - - - -20.]。但是,后来的研究展示了胞质释放积极的重组蛋白(21]。

在这里,我们实现了一个类似的策略分析的早期分子机制iPSC派生,即每个重编程因子的贡献在小鼠成纤维细胞的抑制血统基因Thy1特征重组转基因小鼠胚胎成纤维细胞(Oct4-GFP) iPSC [22),利用蛋白质的易于操纵交付试图最大化重组效率通过交错的方法重组因子表达式/曝光。从概念上讲,优势与利用蛋白质交付相关解剖重编程的分子机制包括其可逆性,允许瞬态处理已知的和/或丸数量的蛋白质,并且能够规避固有的延迟在转录和翻译本构和诱导前病毒的策略。我们进一步描述另一个(融合)蛋白质纯化方法,净化和集中可溶性(nondenatured) pTAT-mcMyc蛋白质诱导细菌细胞,并交付微粒/ semisoluble已知浓度的蛋白质。

2。材料和方法

2.1。材料

所有试剂都是购自Sigma-Aldrich(城堡山、新南威尔士、澳大利亚),除非另有说明。所有测序进行Gandel测序设施,澳大利亚莫纳什大学医学研究所。

2.2。方法

2.2.1。老鼠和动物伦理

莫纳什大学批准的实验动物伦理委员会和满足澳大利亚国家卫生和医学研究委员会(NH&MRC)动物实验指南。MEF是从13.5 dpc OG2×OG2老鼠窝藏GFP记者表示从Oct4近端和远端增强剂和Oct4发起人适当的(23]。所有实验使用MEF通道3。

2.2.2。答表达载体建设

PCR产品放大(高保真PCR协议;罗氏公司、澳大利亚)pMXs质粒模板编码cDNA鼠标cMyc (mcMyc;美国Addgene)。引物了限制性内切酶消化与相邻站点链接器DNA和停止向PCR产物序列(如适用)(补充图1 c列出的辅料网上doi: 10.1155 / 2012/541014)。放大PCR产品和pTAT表达载体(斯蒂芬·f·寒酸的博士提供的慷慨,加州大学/霍华德•休斯医学研究所,美国经历了一夜之间用限制性内切酶消化(4°C)EcoR1和Xho1(生物学实验室、澳大利亚)琼脂糖凝胶净化和隔离(澳大利亚试剂盒)。消化PCR产品和pTAT质粒与T4的结扎DNA连接酶(Promega、澳大利亚)通过制造商的条件(一夜之间,4°C),之前electro-transformation DH10B主管细胞(BioRAD、澳大利亚)。转换准备工作就绪蔓延至50岁以下的琼脂板μg / mL卡那霉素筛选和克隆成功的结扎测序筛查(T7测序引物)。

2.2.3。表达、纯化和浓度的6 xhis-tagged pTAT-mcMyc融合蛋白

结扎pTAT-mcMyc质粒,本机pTAT质粒(控制)electro-transformed BL21 (DE3)主管细胞(美国Stratagene)和传播在琼脂卡那霉素的选择。克隆扩大在磅肉汤(房子造)含有卡那霉素筛选和测序。蛋白表达是由0.1毫米异丙基β-D-thiogalactosidase——(IPTG)诱导蛋白表达(230 rpm风潮在一夜之间,37°C)。起初,我们纯化可溶性和不可溶性(需要净化的变性蛋白)分数pTAT-mcMyc和控制pTAT蛋白质免疫印迹分析(纯化Ni-NTA列;试剂盒、澳大利亚)。我们确认pTAT-mcMyc蛋白主要存在于可溶性部分通过免疫印迹(下面)。

净化可溶性pTAT-mcMyc和pTAT控制蛋白质、细菌细胞溶解(1% Triton x - 100, 0.1毫克/毫升在50 mM不溶菌酶₂阿宝₄咪唑,300毫米氯化钠,10毫米,pH值8.0)和孵化37°C 1小时,和冰30分钟。核糖核酸酶(5μg / mL;英杰公司、澳大利亚),DNase(2单位/毫升;1毫米MgCl Promega、澳大利亚)₂和氟化phenylmethylsulfonyl(1毫米)被添加在声波降解法冰。细胞进一步通过23-gauge均质针前离心(9000 xg, 30分钟,4°C)。的上层清液收集净化/洗脱通过Ni-NTA列通过制造商的指示。

集中蛋白质制剂,四冰冷的丙酮加入一部分纯化蛋白(v / v)和孵化−20°C 30 - 45分钟。在6800 xg离心后10分钟(4°C),蛋白质颗粒resuspended 50μL无菌H₂O或PBS。摩尔浓度计算蛋白质与已知蛋白与比色BioRAD标准^D_C蛋白质测定(pTAT控制蛋白质;BioRAD、澳大利亚),或通过蛋白质分光光度法(pTAT-mcMyc)。

2.2.4。免疫印迹

减少和变性pTAT-mcMyc控制pTAT蛋白质electrophorated (90 V ~ 2小时4°C)通过12 - 15%变性polyacrilymide凝胶,要么(a)固定在前10%甲醇/ 7%醋酸染色SYPRO Ruby蛋白质染色(BioRAD、澳大利亚)和可视化紫外线照射下,或(b)涂抹PVDF膜(微孔、澳大利亚)。涂抹湿膜阻止了奥德赛阻断缓冲区(奥德赛、澳大利亚)和探测anti-6xHis-tag主要抗体(1:2500;蓝宝石/ Abcam、澳大利亚)或anti-mcMyc(目标序列CSTSSLYLQDLSAAASEC)主要抗体(1:50,蓝宝石/ Abcam,澳大利亚)。主要抗体检测与anti-mouse Alexa萤石- 680二级抗体(分子探针;英杰公司、澳大利亚)在室温下1 h。测试和消极控制膜(仅二次抗体)在一个可视化奥德赛红外成像仪(美国东北LI-COR生物科学,林肯;强度:3 - 10、质量:中等分辨率:169)。可视化蛋白质乐队比较与EXpasy预测每个蛋白质分子量计算软件(http://web.expasy.org/compute_pi/)。

2.2.5。免疫细胞化学

确认易位pTAT-mcMyc和pTAT控制蛋白质的核间的细胞治疗,我们根据标准方法进行荧光免疫细胞化学。MEF镀前盖玻片100海里pTAT-mcMyc或pTAT控制蛋白质应用和孵化37°C 1小时(24]。细胞被广泛在PBS洗,固定在4%多聚甲醛(内部准备的)和屏蔽2.5%脱脂牛奶/ 2.5%山羊血清/ PBS标签之前6 xhis (1: 1500;蓝宝石/ Abcam、澳大利亚)。确认的表达多能性标记,则被贴上SSEA1(稀释1:100;澳大利亚Chemicon /微孔)。绑定主要抗体检测用Alexa萤石488或555 (1:1500;分子探针/表达载体,维多利亚,澳大利亚)。细胞核被检测到1毫克/毫升Bisbenzimide赫斯特33342年。采用共焦显微镜图像与FluorView软件(版本1.5或4.5)。

2.2.6款。诱导多能性的MEF商船±pTAT-cMyc蛋白质治疗

通过建立协议,则来自OG2 MEF使用pMXs逆转录病毒载体(1,22]。简单地说,MEF (12-well板块)感染逆转录病毒感染mOct4 mSox2, mKlf4(表示立即商船)±mcMyc打包在Platinum-E细胞(25]。平行感染的MEF GFP-reporter转基因证实感染效率≥80%。一部《外交政策》媒体(10% (v / v)胎牛血清(的边后卫;JRH、澳大利亚),0.5% (v / v)青霉素和链霉素DMEM)取代mcMyc逆转录病毒适用的地方。24小时孵化后,病毒包含媒体取代标准的ES细胞培养基(指定0天,见图2(一个);15%的边后卫,1% (v / v)非必需氨基酸(表达载体、澳大利亚),1% (v / v) glutamax (Gibco、澳大利亚),0.1% (v / v)β巯基乙醇(Gibco、澳大利亚),和鼠标生活(微孔/ Chemicon,澳大利亚)。ES媒体改变了每天12天。在12天,每个条件的合适的克隆选择和扩展未来分析。

为了避免pH-related蛋白质变性事件,媒体ES是平衡在37°C / 5%的股份有限公司₂≥1小时前100海里semisoluble pTAT-cMyc或控制蛋白质添加到适用的条件。天5、7、9、12 (PI)感染后,Oct4-GFP⁺菌落数或细胞收集的流式细胞术(下面)。

2.2.7。碱性磷酸酶表达分析

碱性磷酸酶表达被确认在4%多聚甲醛固定细胞则通过标准协议殖民地(微孔、澳大利亚)。

2.2.8。畸胎瘤的形成分析:后腿注入

约万能(克隆TATc1)注入2 x SCID小鼠的后腿。畸胎瘤是收获6 - 8周后注入和分段haemotoxylin /伊红染色(组织学设施,MIMR)和可视化。

2.2.9。流式细胞术

分离细胞被封锁在阻断缓冲区(1 - 2%牛血清白蛋白/ PBS)在室温下15分钟前主要抗体(4.8添加了μg / mL Thy1-PE;eBioscience、澳大利亚)。孵化后30 - 45分钟,细胞被洗3次阻断缓冲区和resuspended PBS(没有Ca^{2 +}/毫克^{2 +})。流式细胞术分析BDCanto正欲进行二流式细胞分析仪(正、澳大利亚)。

2.2.10。胚胎聚合

受精卵(0.5 dpc)被孤立的壶腹交配雌性F₁老鼠和培养核自组织映射聚类媒体的水滴(Chemicon /微孔、澳大利亚),直到他们开发了在2.5 dpc压实桑椹胚阶段。带pellucidae从短孵化的胚胎消化酸Tyrodes溶液pH值(2.5)在聚合的10 - 15 TATc1 iPSC的萧条,在培养皿中形成织补针(26]。胚胎/细胞聚集培养到囊胚阶段(4.5 dpc)和评估GFP的贡献⁺细胞内细胞聚合胚胎的质量。

. 2.2.11。支原体检测

培养基补充了100 nM pTAT-mcMyc pTAT-control和孵化24小时37°C。媒体收集和检测支原体的存在。支原体测试执行与MycoAlert支原体检测设备(Lonza罗克兰Inc .,我美国)MIMR组织学核心设施。

2.2.12。统计分析

OSKM的方差和其他治疗组足够不同(图基的测试),单向方差分析进行对数转换数据。实验重复意味着重复的井的商船和商船+ pTAT-mcMyc(图2 (d))表示天的变化。单向方差分析进行原始数据(等于方差)或(不平等的方差)规范化Thy1对数转换数据⁺每个治疗组的细胞(http://faculty.vassar.edu/lowry/t_ind_stats.html)。

3所示。结果

3.1。个人和组合,重组iPSC因素表达下调Thy1不同程度

强调每个组合的重组的影响因素/ s Thy1镇压在12天,mef感染逆转录病毒窝藏之前的个人或组合重组因子评估转基因Thy1表达式的流式细胞术在12天()。不出所料,OSKM-expressing细胞几乎完全表达下调Thy1超过12天。所有单个重组因子,≤3的组合因素,抑制Thy1大约50至75%的MEF超过12天(图1),虽然无关紧要的不同。尽管OSKM表达式几乎完全扑灭Thy1表达式在12天,个人的能力Klf4或cMyc因素抑制Thy1没有明显增强这两个因素结合Oct4或Sox2时。同样,没有观察到添加剂Thy1镇压Oct4和Sox2因素相结合时,或者当cMyc和Klf4 MEF(图中表达相同1)。这表明,最大Thy1镇压只能实现在所有四个重组因子的存在,而不是≤3因素(图1)。

3.2。建设pTAT-mcMyc表达载体和后续的蛋白表达

控制表达水平以及时间的表达式,使用逆转录病毒的策略是有限的。因此,我们采取了一种重组蛋白策略解剖重编程的分子和颞机制。我们放大cDNA鼠标cMyc (mcMyc)在一个氨基端EcoRI限制性内切酶消化和一个c端XhoI站点(由一个鸟嘌呤与维持在坐标系mcMyc序列;引物补充图1中概述(C))。后直接限制消化PCR产品和后续的DNA结扎,测序证实成功,在坐标系结扎mcMyc cDNA插入的消化pET28b答质粒;立即表示pTAT-mcMyc(图2(一个))。pTAT-mcMyc和空向量(控制)质粒转化为BL21 (DE3)细胞IPTG-induced蛋白表达。我们最初纯化pTAT-mcMyc蛋白可溶性或不溶性(变性)的条件下,采用sds - page确认这部分重组蛋白(预测分子量)出现在(预测pTAT-mcMyc 53.05 kDa;EXpasy软件;http://web.expasy.org/compute_pi/)。蛋白质浓度被认为比色测定或分光光度法冻结整除的蛋白质。减少,蛋白质变性pTAT-mcMyc(两净化制剂)electroporated通过12 - 15% polyacrilymide凝胶和墨迹;探讨了抗体识别(i) 6 xhistidine领袖序列(图2 (b)和补充图1 (A)),或(ii)氨基酸186 - 203鼠标/人类mcMyc(图2 (b))。与先前的报道相反,我们发现主要的净化,histidine-tagged pTAT-mcMyc蛋白质接近预测分子量主要在可溶性部分使用抗体检测序列(图2 (b)),几乎没有可检测的蛋白质在变性条件下(补充图1 (A))。确认我们anti-Histidine抗体的特异性,西方的屁股被重复使用抗体针对鼠标/人类cMyc;再次,蛋白质被发现在同一兆瓦(图2 (b))。的表达控制预测蛋白质的分子量(6.099 kDa)证实了他的₆领袖序列检测(数据未显示)。这些结果表明成功建设、表达和纯化semisolubilized,微粒pTAT-mcMyc pTAT-control蛋白质接近预测分子量细菌表达系统。

初步实验证实文化媒体的pH值降低碱度接近中性在37°C /小时孵化后5%的股份有限公司₂。因此,为了避免重组蛋白的变性在应用酸性培养基,建立中立pTAT-mcMyc应用程序的应用程序之前1小时孵化有限公司在37°C / 5%₂。确定是否筛选了pTAT-mcMyc蛋白质(和pTAT控制蛋白质)可以转换的核心MEF, 100 nM pTAT-mcMyc(或100海里控制蛋白质)添加到文化MEF生长在盖玻片和孵化1小时。采用100纳米的浓度从先前的调查报告乙交付(融合蛋白27- - - - - -30.]。固定和permeabilized细胞被标记抗体识别6 xhistidine序列。pTAT-mcMyc和pTAT-control蛋白质检测主要局限于核间MEF治疗,(比较“核”和“6 xhis检测”面板;图2 (c))。最小的蛋白质在细胞质/胞质囊泡,也许反映重组答蛋白质在细胞质核内体或在运输过程中细胞核(红色箭头,图2 (c);(15])。检测抗体绑定在参与细胞最小,表明最小非特异性结合的抗体替代富含组氨酸蛋白(数据未显示)。这些结果证实(≤1小时)和快速有效转导pTAT-mcMyc(和控制pTAT蛋白质)核MEF的隔间。

3.3。添加pTAT-mcMyc蛋白质商船Provirus-Expressing细胞加速Oct4-GFP⁺集落形成超过12天(感染后)

延迟和减少效率iPSC集落形成是观察当cMyc省略了重编程因子鸡尾酒(9]。我们假设的pTAT-mcMyc重组蛋白质OSK-expressing MEF Oct4-GFP会导致显著增加⁺集落形成。在我们的手中,Oct4-GFP⁺iPSC殖民地形成OSKM前病毒表达MEF相当OSK-expressing细胞到12天,只有超越商船集落形成后12天(数据没有显示)。因此,我们与逆转录病毒感染Oct4-GFP转基因MEF窝藏转基因商船或mcMyc孤独和检查商船±pTAT-mcMyc超过12天。在四个独立的实验中,我们添加了100海里pTAT-mcMyc或pTAT控制蛋白质复制井OSK-expressing MEF每日12天,Oct4-GFP相比⁺菌落计数,OSK-expressing MEF天5,7,9岁和12岁后感染(;图2 (d))。的pTAT控制细胞蛋白质OSK-infected Oct4-GFP没有引起显著的改善⁺在任何时间点在OSK-infected集落形成细胞,表明乙和链接器蛋白质序列对Oct4-GFP几乎没有影响⁺集落形成(见绿线,图2 (d))。MEF治疗只与100 nM pTAT-mcMyc蛋白质(图2 (d))和mcMyc transgene-expressing MEF(数据未显示)未能生成殖民地在任何时间点。Oct4-GFP显著改善⁺集落形成观察感染后的第七天,9 (和、职责)OSK-expressing细胞治疗100海里pTAT-mcMyc蛋白质。这表明nuclear-localized pTAT-mcMyc蛋白质的生物功能和可以加速iPSC集落形成在商船MEF。

3.4。确认商船的多能性⁺pTAT-mcMyc-Treated细胞

我们扩大3×Oct4-GFP⁺克隆从实验中概述图2 (d)选择,其中一个细胞系增殖和形态特征进一步分析(表示TATc1立即;图3(B),我们评估了多能性标准TATc1细胞系的多能性标准。我们证实了殖民地表达碱性磷酸酶(图3(C))。我们确认这个克隆并不含有mcMyc转基因通过PCR使用基因组DNA模板(“T”基因”图3(D))和确认的表达内源性Oct4、Sox2, Klf4, cMyc Rex1, Nanog (“Endo”图3(D))。组织学检查畸胎瘤形成于内注射TATc1 SCID小鼠的后腿突出显示的区域分异特征的三个细胞谱系,软骨中胚层的特点,腺组织让人想起内胚层,和神经外胚层的花结特征(图3(E))。免疫细胞化学证实紧凑TATc1 (Oct4-GFP⁺)殖民地coexpress stage-specific胚胎antigen-1 SSEA1(图3(F))。TATc1细胞保留正常核型在重组期间(通道5日20/20计算40 xy;图3(G))和导致发展中囊胚的内细胞团当聚合与二倍体F₁(图4 - 8细胞胚胎3(H))。总的来说,这些结果证实商船+分享pTAT-mcMyc-treated细胞多能性的特点观察OSKM -和OSK-induced细胞(1,9]。

3.5。增加pTAT-mcMyc商船Provirus-Expressing Thy1的差别增加细胞对这些感染后12天

所有单个重组因子能抑制血统基因表达(即。,Thy1) over a 12 days period, with ≥5 days of initial cMyc expression required for efficient AP+ colony formation (Figure1)[8]。因此,我们采取了一种重组蛋白交付方法解剖颞和体细胞重编程的分子机制、主要镇压Thy1 [12,31日]。在一个独立的实验中,我们收集实验小组在5天,7、9岁和12岁()来评估细胞的百分比表达Thy1通过流式细胞术,结果正常化治疗MEF控件(在我们的手,意味着±扫描电镜;图4)。商船的观察Thy1差别逐渐对这些基因的表达细胞在感染后的12天(图4)。应用程序仅100海里pTAT-mcMyc蛋白质MEF引起的差别明显对这些Thy1在最初的5天治疗期间,维护,从(图5 - 12天4;)。改善(尽管不重要)Thy1镇压持续7天MEF表达商船和处理100海里pTAT-mcMyc蛋白质,与Thy1镇压保持在感染后12天(图4)。支原体检测protein-treated文化媒体证实Thy1镇压并不是由于污染支原体从蛋白质纯化(数据未显示)。

3.6。五天的预处理的OG2 MEF pTAT-mcMyc±外生mKlf4表达式后续mOct4 / mSox2-Mediated重组

血统基因镇压在重编程是多能性基因激活的先决条件在重编程(4,5]。cMyc从最初的5天的可分配重组建议在血统基因镇压这个重编程因子(8]。自重大Thy1压迫的结果pTAT-mcMyc重组蛋白应用程序(Klf4表达式的存在与否;图4),我们提出了一个交错的方法来启动重组;发布了一个为期五天的预处理(因此“prerepression”Thy1)的MEF纳米pTAT-mcMyc重组蛋白可以促进随后的加速Oct4 + Sox2-mediated重组(评估,差别Thy1对这些人物5(一个);Oct4-GFP集落形成,图5 (b))。因此,我们与逆转录病毒感染OG2 MEF窝藏Klf4转基因在孵化前100海里的存在与否pTAT-mcMyc 5预处理天(指定:5天;图5(一个))。另外,MEF仍未感染和未经处理的预处理。±5天后Klf4表达重组蛋白治疗(一天0),治疗组和未经处理的mef (i)收集和分析流式细胞仪Thy1的比例⁺第二个感染细胞和(2)山肩mOct4和mSox2的逆转录病毒。控制,参与MEF镀了感染逆转录病毒(i) mOct4和Sox2, (ii) mOct4 mSox2和mKlf4,或(3)mOct4 mSox2 mKlf4, mcMyc(图5)。流式细胞仪分析Thy1⁺细胞进行天0 7和14后mOct4 / mSox2感染Thy1百分比⁺在每个治疗组细胞规范化治疗控制MEF。Oct4-GFP菌落计数也在同一时间点计算评估前/后处理对报告基因的影响⁺集落形成(图5 (b))。

突出显示,如图5五天,预处理/表达外源Klf4 (i)和(ii)外源性Klf4 + 100 nM pTAT-mcMyc导致镇压Thy1 MEF 20 - 70%,(一天0,图5(一个))。应用100海里pTAT-mcMyc显著增强Thy1镇压Klf4-expressing MEF (;图5(一个))。未经处理的MEF感染了操作系统、商船或OSKM(粉色,橙色和绿色线,分别地。)和预防MEF感染操作系统,与pTAT-mcMyc预处理继续进行预处理MEF(红线)。

7天的表情后,Thy1镇压在OS -和OSK-infected(只)MEF温和MEF (35 - 40%)。Thy1表达式几乎完全废除感染OSKM MEF(即。在0天,不是prereated)。持续100 nM pTAT-mcMyc治疗Klf4 preinfected / Oct4 Sox2 postinfected MEF引起继续Thy1镇压第七天MEF无关紧要的不同表达水平四个重组因子。有趣的是,与Klf4 preinfection(因此prerepressing Thy1),后续Oct4 / Sox2感染,也同样有效地抑制Thy1比并发感染细胞与商船(14天比较蓝色和橙色线;图5(一个))。

并发OSKM(重要)和并发商船(无关紧要的)感染仍然取得了殖民地比上面的交错方法采用(图5 (b))。事实上,一些Oct4-GFP⁺殖民地被观察到的纳米pTAT-mcMyc预处理/ Oct4 + Sox2 postinfected组。这些结果表明,尽管增加Thy1镇压是通过预处理nM pTAT-mcMyc,并发感染所有四个重组因子仍然收益率最有效的报告基因⁺在第14天殖民地。在14天,预处理与外生MEF Klf4 + 100 nM pTAT-mcMyc Oct4 /感染Sox2在第0天之前,明显比细胞感染Oct4 /压抑Thy1 Sox2孤单。然而,这种效应并不反映在GFP⁺在第14天菌落计数。

4所示。讨论

突出的贡献/重组因子的组合,并可能抑制抑制Thy1每个能力的影响,我们与个体感染MEF重组因子或组合因素和评估Thy1在12天之后感染(图1)。Twelve-day每个有效重组因子的表达会使Thy1(图1)。我们没有观察到的累加效应表达Oct4和Sox2与单独表达因素相比,或表达cMyc和Klf4而不是表达的因素。Oct4的能力或Sox2单独表达下调时没有显著增强Thy1 (i)同时表示,或(ii) cMyc和Klf4也表示在同一MEF(图1)。

我们采用了一种重组蛋白交付方法解剖体细胞重编程的分子机制。我们描述一个方法生成semisoluble,微粒mcMyc重组蛋白质的氨基端链接11-amino-acid, arginine-rich主题(⁴⁹R乐RR问存款准备金率⁵⁷)transactivating转录激活因子(乙)的艾滋病毒(图2(一个))[21,32]。答和mcMyc功能域耦合通过肽序列链接器,减少这些领域之间的干扰14]。检测pTAT-mcMyc蛋白质的抗体识别6 xhistidine领袖序列或cMyc蛋白质免疫印迹分析证实在坐标系重组蛋白质的表达和纯化的预测分子量(图2 (b))。初步实验显示pTAT-mcMyc蛋白质主要是可溶性和微粒后,resuspended丙酮沉淀(数据未显示)。绑定答域的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的细胞在体外快速启动(分钟)的顺序重组蛋白核间的易位(图2 (c))[15- - - - - -20.,33]。

显著的差异蛋白质纯化和浓度区分从目前的研究报道,一般以重组蛋白纯化的细菌包涵体之前重折叠(13,14]。金等。12),表达蛋白转染人类细胞和应用未知数量的unpurified重组因子在整个蛋白质提取目标细胞,无论是研究集中重组蛋白质分数/准备。净化的可溶性,un-denatured蛋白质在当下研究绕过了潜在的问题与重组蛋白的错误折叠的众多选择和潜在的活性构象,与丙酮浓度去除非蛋白细菌污染物(14,34,35]。以前曾试图利用变性Tat-fusion蛋白质的重组人成纤维细胞在受到限制的蛋白质内部囊泡(14]。治疗的靶细胞在无血清条件下也可能限制细胞质膜泡释放。semisoluble净化,微粒pTAT-mcMyc重组蛋白,和/或平衡文化媒体的重组蛋白应用程序之前,可能导致逃避和/或逃避我们的Tat-fusion蛋白质等内部囊泡(14]。

我们应用100 nM pTAT-mcMyc蛋白质MEF无毒性或OSK-expressing MEF每天12天Oct4-GFP和监控⁺集落形成(图2 (d))[32,36,37]。与先前的报道证明毒性80海里TAT-DsRED-Klf4应用MEF (14),我们未能观察到不良反应在100 nM pTAT-mcMyc MEF培养。这可能是由于细胞毒性观察到的红色荧光蛋白(RFP)变异,或不明原因在这些浓度Klf4蛋白质本身的毒性。然而,在感染后第五天,精原Oct4-GFP⁺殖民地没有任何治疗组(图中观察到2 (d))[9]。大大加速Oct4-GFP⁺OSK-expressing细胞集落形成观察治疗pTAT-mcMyc 7和9在感染后在天。克隆Tatc1 (Oct4)表达绿色荧光蛋白和碱性磷酸酶,所有胚分化层畸胎瘤、表达多能性标记(如评估通过rt - pcr和免疫细胞化学),维护正常核型和有能力导致聚合嵌合体胚胎内细胞团(数字3(一)-3(H))。这证实了转换的商船+ pTAT-mcMyc重组protein-treated MEF完全改变表型。

我们结合转基因表达±pTAT-mcMyc血统基因的重组蛋白交付突出机制镇压。Thy1 (CD90) glycosylphosphatidylinositol-anchored质膜糖蛋白表达在不同的细胞类型(包括成纤维细胞数量)与细胞增殖和细胞凋亡,细胞骨架组织,信息/矩阵附着力,和大量的胞质信号级联(6,7,38]。组成型表达以来OSKM转基因压制Thy1大多数小鼠成纤维细胞,我们利用能力应用控制蛋白质的浓度,在定义的时间内突出Thy1压迫机制(5]。五天的100 nM pTAT-mcMyc重组蛋白治疗(±商船表达式)启动相当压抑的Thy1表达式(图4;通过流式细胞术评估)。商船转基因表达的差别也抒发对这些Thy1,但在效率明显下降。令人惊讶的是,结合商船表达式和pTAT-mcMyc交付未能引起添加剂Thy1镇压商船。这个结果表明mcMyc主要介导Thy1镇压< 5天在商船的存在与否,最重要的“饱和”适度OSK-mediated镇压或利用优先当“表达”位于相同的单元中,因此建议Thy1镇压在初始阶段的重组率限制。也许OSK-mediated Thy1镇压是默认早期重编程的机制,当足够浓度的mcMyc缺席。目前尚不清楚,但可能cMyc直接或间接促进组蛋白methyltranferase / s的招聘Thy1启动子启动转录镇压,或破坏细胞骨架肌动蛋白束允许细胞形态学变化,采用多功能表型(38- - - - - -40]。从Thy1过渡⁺一个Thy1⁻表型在鼻咽粘膜是致癌的一个特色,从而表明Thy1代表候选人作为一个肿瘤抑制(41]。鉴于基因档案相似性在胚胎干细胞和肿瘤干细胞之间,就不足为奇了镇压tumour-repressor基因的功能/不朽显著提高体细胞重编程的效率(42- - - - - -44]。肺成纤维细胞数量缺乏Thy1已经大大减少甲基转移酶水平确定实时PCR, Thy1化学诱导脱甲基作用⁻成纤维细胞再次启动Thy1表达式(39]。

循序渐进的趋势(尽管统计微不足道)中观察到的差别Thy1对这些商船表达细胞(图5 - 12天4)。相比之下,独自pTAT-mcMyc蛋白质未能调解同期差别显著改善Thy1对这些并不是显著改善OSK-mediated Thy1抑制。然而,除了100海里pTAT-mcMyc蛋白质商船provirus-expressing MEF进一步促进Thy1抑制感染后7天,改善单靠商船接近统计学意义(;图4)。合作或添加剂机制和100海里pTAT-mcMyc之间可能会加速Thy1镇压从5到7天。

重组蛋白的可逆性交付,以及控制时间和浓度的能力方面的应用程序,允许操作的iPS重组方法,以提高重编程效率。cMyc需要初始的日子只重编程(美联社⁺在重组(殖民地),但Oct4是必需的8]。因为血统基因镇压是早期重组的先决条件,我们假设一个交错的方法,即prerepressing Thy1通过应用Klf4±pTAT-mcMyc后续Oct4的前病毒的表达和Sox2,可以提高重编程效率,根据Oct4-GFP评估⁺集落形成。这也会减少所需的时间与重组因素暴露目标细胞,特别是Oct4 Sox2。虽然5天的应用Klf4±pTAT-mcMyc显著压抑Thy1 Oct4 / Sox2应用程序时(0),总Thy1镇压与连续4-factor表达式(图14天5(一个))。重要的是,pre-repression Thy1没有改善Oct4-GFP⁺集落形成(图5 (b))。尽管Thy1表达式是压抑与平等的有效性在7和14天(i)连续OSKM表达式或(ii)交错表达Klf4 / pTAT-mcMyc和Oct4 / Sox2(图5(一个)),它不翻译Oct4-GFP⁺集落形成(图在任何时间点5 (b))。事实上,Oct4-GFP⁺集落形成也推迟了在预防MEF(图5 (b))。这些结果表明尽管Thy1镇压是后续pre-requiste多能性基因激活和成功的重组,与cMyc Klf4主要负责调停早期事件(数字4和5)[4,5,8),早期coexpression Oct4 Sox2仍然需要及时和有效的报告基因⁺集落形成后在重新编程(即。14天)。

最后,我们利用的内部属性答转导肽快速运输关键转录因子核Oct4-GFP MEF。这里列出实验结果表明mcMyc调节初始(< 5天)抑制MEF Thy1,紧随其后的是一个合作机制由mcMyc / Klf4感染(图5 - 9天后4)。蛋白质交付可转导mitotically活跃或不活跃的细胞,或与互补dna细胞很难感染(如间充质干细胞),没有永久破坏宿主基因组,可以暂时性的应用推动重组和快速可逆的。因此,我们建议应用程序的额外答融合结构在不同浓度和时间将进一步突出的事件描述体细胞重编程。随着硫酸乙酰肝素蛋白聚糖显示相当大的哺乳动物物种之间的序列同源性和广泛表达在许多细胞类型,相同的答融合结构可能被用在许多细胞类型在哺乳动物物种内和被用来产生protein-iPS细胞以一种受控制的方式。我们期待更多的研究致力于不同浓度的重组蛋白突出重组因子的阈值水平最大化体细胞重编程。

利益冲突

作者报告没有利益冲突。

作者的贡献

c·霍夫曼的贡献在执行实验,知识输入,和写作的手稿,h .苏美尔参加知识输入,写作本文,l . Malaver贡献在执行实验,和p . j . Verma参与知识输入,写作,和资金。

确认

本研究支持的维多利亚时代的政府运营基础设施支持计划。作者感谢斯蒂芬·f·寒酸的博士(美国加州大学/霍华德休斯医学研究所)提供的pTAT表达载体和Oct4-GFP转基因老鼠MEF隔离。他们感激地承认以下蒙纳士学院的医学研究组织和人员;尼基·德·Weerd博士和重组蛋白组,薇薇安在Gandel Vasic测序,测序设施MIMR组织学设施为畸胎瘤切片和染色,詹姆斯同时和戴尔鲍姆提供有帮助的流式细胞术建议。他们感谢客座教授基督教施罗德(应用科学大学Lausitz;Senftenberg,德国)对论文的评价至关重要。c·霍夫曼欣然承认澳大利亚国家卫生和医学研究理事会对研究生资助。本研究支持的维多利亚时代的政府运营的基础设施支持项目和由澳大利亚干细胞中心“诱导多能性”项目资助。个人提供的研究生资助c·霍夫曼是国家(澳大利亚)卫生和医学研究委员会(NH&MRC)。

补充材料