α刺激_1.-肾上腺素能受体通过PPAR改善血管舒缩以外的多器官细胞功能δ

摘要

细胞可以在糖酵解和氧化磷酸化之间转换代谢，以对外部信号做出反应，从而制定细胞命运计划。广泛分布α_1.-肾上腺素能受体(ARs)在运动过程中受到生理刺激，据报道与激活的能量AMPK途径有关，并预期具有超出其血流动力学影响的生物学效应。探讨AR刺激对全身生理的影响及其机制在体外和体内实验使用AR激动剂米多君，2-氨基N-[2-（2,5-二甲氧基苯基）-2-羟乙基]-乙酰胺。通过westernblotting、逆转录聚合酶链反应、耗氧率、酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光染色和油红O染色，对几种细胞系中与ATP产生有关的各种生物标记物的表达进行了评估（骨骼肌、心肌、肝脏、巨噬细胞、血管内皮细胞和脂肪细胞）.在自发性高血压大鼠中，通过Western blot分析、免疫组织化学、ELISA和超声心动图测量血压、血液分析、器官特异性生物标记物和与ATP生成相关的一般生物分子α_1.-C2C12骨骼肌细胞中的肾上腺素能受体通过增加分解代谢分子（包括PPAR）的表达，促进线粒体氧化磷酸化和ATP生成δ、AMPK和PGC-1α，通过胞质钙信号和GLUT4表达增加，如运动中所见。它还激活了这些能量分子和线粒体与心肌细胞、内皮细胞、脂肪细胞、巨噬细胞和肝细胞的氧化磷酸化，并影响其相关的细胞特异性生物学功能。所有这些效应发生在米多君治疗后3小时左右(6小时达到顶峰)。自发性高血压大鼠中，α_1.-肾上腺素能受体刺激通过激活PPAR影响线粒体氧化磷酸化和ATP生成δ、AMPK和PGC-1α以及多个器官的相关生物学功能，表明器官相互作用。该治疗降低了血压、脂肪和体重、胆固醇水平和炎症活动；增加了骨骼肌的ATP含量和胰岛素敏感性；增加了心脏收缩功能，而无需运动训练。这些结果表明激活α_1.肾上腺素能受体通过PPAR刺激能量重编程δ这增加了线粒体氧化磷酸化，在包括骨骼肌在内的多个器官中具有健康和器官特异性的生物学效应，而不仅仅是其血管运动效应α_1.-肾上腺素能受体可能主要通过PPAR发挥作用δ.

1.导言

在生物的生命中，细胞的生物能量需求是通过细胞质中相互关联的糖酵解、线粒体中的三羧酸循环和氧化磷酸化来提供的。在糖酵解的顺序反应中，葡萄糖代谢为丙酮酸，在细胞质中释放丙酮酸、三磷酸腺苷(ATP)和NADH。在常氧条件下，丙酮酸进入线粒体并被氧化成CO_2.和H_2.O通过TCA循环生成NADH，NADH被氧化磷酸化反应氧化生成大量ATP和NAD⁺在线粒体中。在大分子合成中，葡萄糖可以作为RNA和DNA合成的戊糖磷酸途径，以及脂肪酸合成的NADPH途径。糖酵解的上调是增加合成大分子流量的关键步骤。TCA循环还为类异戊二烯、胆固醇、黄原酸的合成提供底物组蛋白和蛋白质的翻译后乙酰化[1.]这些生物合成反应需要从糖酵解和TCA循环中不断提取中间产物，从而维持这些基本代谢途径[2.]．糖酵解是通过增加糖酵解途径的代谢通量来维持的，但为了补充三羧酸循环，需要使用两种不促性反应分子，草酰乙酸和谷氨酸。在产生生物量的活化细胞中，葡萄糖和谷氨酰胺都没有被完全氧化生成ATP [3.]，因为回补通量必须大于复补通量，以补充TCA循环的中间产物。因此，通过这些途径的过量通量通过将丙酮酸还原为乳酸来维持，从而产生必要的NAD⁺即使在有氧条件下，也需要维持糖酵解和TCA循环。因此，糖酵解对需要大分子的细胞功能（如炎症和细胞增殖）至关重要[4.]．

最近的研究表明，在运动和免疫反应期间，细胞如何产生能量对细胞和器官的功能有着至关重要的影响。细胞可以在糖酵解和氧化磷酸化之间转换代谢，以对外部信号作出反应，制定功能性命运程序。例如，经典激活的M1型巨噬细胞优先依赖糖酵解，而交替激活的M2型巨噬细胞优先依赖氧化代谢[4.]类似于快收缩(II型)和慢收缩(I型)骨骼肌纤维的燃料偏好[5.]．在心脏和组织特异性干细胞中，氧化代谢和糖酵解之间的代谢转换分别控制心脏功能和造血干细胞激活[6.,7.]．

在临床情况下，ATP产生的线粒体功能受年龄、性别、营养状况和运动表现等因素的影响，我们建议这些因素将生物能量代谢编程为糖酵解或氧化磷酸化，从而改变全身多个器官的代谢功能n肥胖和缺乏运动，这通常与线粒体功能障碍有关[10，加速糖酵解有望与线粒体氧化磷酸化功能障碍的程度相匹配，从而影响全身器官的功能。这一病理生理学可以解释为什么代谢综合征包括一组代谢条件，如高甘油三酯血症、超低密度脂蛋白(LDL)胆固醇、低密度脂蛋白(HDL)胆固醇、胰岛素抵抗、糖耐量异常、高血压、血管炎症、动脉粥样硬化和肾脏，肝脏和心脏疾病[11]在这种情况下，运动是调节ATP产生代谢途径的一种方式，通过激活分解代谢分子（如PPAR）具有健康效应δ、AMPK和PGC-1α，刺激线粒体氧化磷酸化[8.来改变骨骼肌的可塑性。

交感神经系统是一个完整的网络，可同时对身体所有器官产生各种影响，以在不断变化的环境中保持体内平衡。其生理和代谢反应通过内源性儿茶酚胺、去甲肾上腺素和肾上腺素对肾上腺素能受体的作用介导α_1.肾上腺素能受体(ARβ-AR在运动过程中被激活，并且α_1.-AR对运动过程中的血流动力学支持有重要作用。不像β基于“增大化现实”技术,α_1.据报道，即使长期受到ar刺激，也会对健康产生有益的影响。它对心脏收缩功能有保护作用[12–14不同于。的复杂影响β-AR[15]．此外，它通过激活AMPK与骨骼肌代谢中的能量消耗有关[16].有趣的是，α_1.-AR不仅分布在肌肉的血管中，而且广泛分布于大多数器官，包括骨骼肌纤维[16,17，心脏[18，脂肪组织[19]，肝脏[20.]，及其他器官[21]，表明它通过交感神经网络分布到这些器官。因为α_1.-AR可在运动过程中受到生理刺激；与AMPK的激活有关[16，通过线粒体氧化磷酸化刺激ATP的产生[8.];并且分布在全身各处，我们假设α_1.-AR刺激可以控制所有细胞和器官的代谢功能变化α_1.-ARs通过将细胞的新陈代谢与功能变化结合起来，如运动中所见。

在这项研究中，我们进行了细胞实验来研究α_1.-AR刺激促进线粒体能量分子的表达和氧化磷酸化过程，以及是否影响骨骼肌细胞的相关生物学功能，如运动中所见。此外，确定α_1.-AR在来自多个器官的细胞中具有相同的代谢功能，我们用心肌细胞、内皮细胞、脂肪细胞、巨噬细胞和肝细胞进行了实验。我们还使用了一个没有运动训练的代谢综合征动物模型来研究是否具有药理作用α_1.-AR刺激促进线粒体氧化磷酸化基因的表达，并引起多个器官的生物学变化。

2.材料和方法

2．1．材料

L6大鼠骨骼肌、C2C12小鼠骨骼肌、HL1和H9C2心肌、HUVEC人脐静脉内皮细胞系、RAW 264.7巨噬细胞和3T3-L1小鼠前脂肪细胞购自韩国细胞系库（韩国首尔）。胎牛血清（FBS）、抗生素抗真菌（AA）溶液和培养基购自WELGENE Inc.（韩国大邱）。TRIzol®试剂购自Invitrogen（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。PRO-PREP™ 蛋白质提取液和预先染色的蛋白质大小标记购自iNtRON Biotechnologyα(α亚基总形式)和抗磷酸化ampkα（Thr172磷酸化）主要抗体购自Cell Signal Technology，Inc.（美国马萨诸塞州丹弗斯市）。抗PGC-1的主要抗体α, anti-PPARδ大鼠脂联素酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自Abcam公司(Cambridge, UK)。抗细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase subunit 4, COX4)、抗葡萄糖转运体4 (GLUT4)、抗兔二抗和抗小鼠二抗的一抗均来自Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)。Anti-alpha_1.-肾上腺素能受体1购自Novus（美国科罗拉多州利特尔顿市）。ATP、PPAR的ELISA试剂盒δ，AMPK，PGC-1α白介素- (IL-β，IL-6，肿瘤坏死因子α（TNF-α)和活性氧物种（ROS）购自MyBioSource（美国加利福尼亚州）™ Western ECL基质试剂盒购自Bio-Rad（美国加利福尼亚州大力士市）。X射线胶片购自Agfa（比利时莫塞尔，德国），显影剂和定影剂试剂购自柯达（美国纽约州罗切斯特市）.米多君、化合物C、琥珀酸钠、硝基蓝四氮唑、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、蛋白酶抑制剂混合物和油红O试剂购自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯市）。免疫组织化学试剂购自Vector Laboratories（美国加利福尼亚州伯林盖姆市）。

2.2.动物准备

24只雄性自发性高血压大鼠（SHR）（3周龄）在标准化条件下（21°C，41–62%湿度）维持正常昼夜（10/14） h） 循环和免费获得水和实验室饮食。所有动物实验均按照韩国大学动物科学规则和条例（KUIACUC-2012-100）进行.实验程序和居住条件已获得韩国大学动物实验委员会的批准。驯化1周后，我们将大鼠分为4组（每组6只），如下所示：基础对照组（4周龄处死），I组（米多君给药4周，从4周龄开始；在8周龄时处死）、第二组（阿替洛尔给药4周，从4周龄开始；在8周龄时处死）和第三组（仅饮用水对照组；在8周龄时处死）。基础对照组和第三组接受标准维持周粮（K-H4微丸，Ssniff；Soest，德国）不含任何药物；第一组接受与饮用水中米多君相同的饮食（0.3%） mg/kg/天）；第二组在饮用水中接受与阿替洛尔相同的饮食（1 使用BP-2000血压分析系统，每7天通过尾袖体积描记术测量一次血压（BP）™ （Visitech系统公司；美国北卡罗来纳州Apex）.这些动物没有进行任何运动训练。基础对照组的动物在4周龄时被安乐死，其他组的大鼠在8周龄时接受4周治疗后被安乐死。从下腔静脉采集血样，并对心脏、主动脉、肝脏、骨骼肌和内脏脂肪进行干净和完整的解剖称重。收获的器官储存在-80°C或10%的温度下( )福尔马林浸泡固定。

２．３．细胞培养

HL1细胞在含有去甲肾上腺素（100%）的Claycomb培养基中培养 μM)，并保持在37°C, 5% CO_2.孵化器。L6、C2C12、RAW 264.7、HL1和H9C2细胞在含10%胎牛血清和1% AA溶液的DMEM中培养，并在37℃、5% CO中维持_2.培养箱。每隔48–72天用新的DMEM或Claycomb培养基替换培养基 h、 细胞被镀上的密度为 96孔培养皿中每孔细胞数或 在含有10%FBS和1%抗生素抗真菌溶液的Claycomb或DMEM培养基中的六孔培养板中每孔培养细胞。细胞培养24-48小时 h，并保持在37°C，5%CO_2.然后，将培养基换成含1%胎牛血清的粘土或DMEM。然后用米多碱(1-100)处理细胞μM) 1-24小时。培养10 ~ 20代3T3-L1前脂肪细胞，密度为 在含有10%小牛血清和1%抗生素抗真菌溶液的DMEM中的24孔培养皿中，每孔细胞数。当3T3-L1细胞达到融合时，将分化培养基与米多君（30 μM)和GSK0660 (50μPPAR M)δ拮抗剂。分化培养基为0.0125 mM地塞米松、12.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10μg/mL胰岛素和10%胎牛血清。经过两天的分化期后，将培养基改为含有10%葡萄糖的培养基 μg/mL胰岛素和10%胎牛血清。在胰岛素培养基中孵育2天后，更换为含有10%胎牛血清的维持培养基。

2.4.心脏超声心动图检查

肌肉注射Zoletil®(8 mg/kg)和xylazine (2 mg/kg)麻醉大鼠后，每只大鼠左侧卧，获得m型回声图像。所有检查均使用Vivid 7 (GE医疗系统;Milwaukee, WI, USA)带有12mhz传感器。在获得左心室乳头肌水平的最佳二维短轴视图后，以100 mm/s的速度记录m型示踪，同时记录心电图。采用改良的美国超声心动图学会方法，从至少3个连续心动周期的m型追踪中测量心壁厚度、尺寸和质量[22]．

2．5．琥珀酸脱氢酶(SDH)活性测定

组织样本均置于含1% ( )蛋白酶抑制剂。匀浆提取物在13000下离心 转速和4°C持续5分钟 min，然后将上清液转移到新试管中。培养液由1 M磷酸盐缓冲液（25 μ琥珀酸钠(125μL)， 10mg /mL硝基蓝四唑(25μL), 235年μ每次反应1升蒸馏水，样品孵育20分钟 酶溶液（90℃）在37℃恒温箱中的最小温度 μL)加入预温的孵育液(410μL)，反应混合物在37℃恒温箱中孵育30 min。反应结束后，在550 nm处测定反应混合物的吸光度。酶活性计算公式如下:

2.6.测量血脂生化和ATP、ROS、IL-1水平β肿瘤坏死因子-α、脂联素、ROS、PPARδ、AMPK和PGC-1α（ELISA）

使用东芝TBA-2000FR (Toshiba Medical Systems Corporation, Tochigi, Japan)检测血清样本中胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇的总浓度，根据高丽大学、九老区医院检验医学系(诊断试验)的制造商说明，测定了该产品(东芝医疗系统公司，日本枥木)。韩国)。ATP, ROS, IL-1的水平β肿瘤坏死因子-α，脂联素，活性氧，PPARδ、AMPK和PGC-1α根据制造商的方法对血清、组织样本或细胞提取物进行评估。

2.7。海马XF分析仪协议

根据制造商的协议，使用Seahorse XFp系统(安捷伦，Santa Clara, CA, USA)完成C2C12和H9C2细胞的耗氧率(OCR)分析。C2C12细胞在 细胞每孔，H9C2细胞于 细胞每口井。细胞沉淀后，在培养基中加入米多碱，在37℃，5% CO中孵育24 h_2.孵化器。将装有校准剂的传感器墨盒+工具板在CO中培养过夜_2.37°C的免费培养箱。分析当天，制备与培养基相似的检测培养基(C2C12: 5.6 mM葡萄糖和4 mM谷氨酰胺;H9C2: 25 mM葡萄糖和4 mM谷氨酰胺)，pH调至7.4。XFp微型板用测定培养基洗涤两次，测定培养基(最终体积为180μ五十） 然后，将XFp微型板在CO中平衡_2.-37°C下60小时的免费培养箱 在分析开始前至少一分钟。将寡霉素、羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙和抗霉素A/鱼藤酮分别注射到传感器筒+实用板的每个药物端口中，并在_2.-免费孵化器10分钟 min，然后测量OCR。

2.8。逆转录聚合酶链反应

根据制造商的说明，使用TRIzol®试剂提取总RNA。使用Power cDNA合成试剂盒从总RNA合成互补DNA，并对PPAR进行聚合酶链反应δ, AMPKα_1.甘露糖受体，和β-actin采用PCR PreMix试剂盒测定。将含有cDNA的反应混合物在95°C下预热5分钟，进行初始变性步骤。聚合酶链反应包括95°C变性20 s, 55°C退火10 s, 72°C延伸30 s, 72°C延伸5 min。采用以下小鼠引物进行qPCR: PPARδ感觉（5 -GGC AGA GTT GCT AGG GTT CC-3 )和反义（5） -CAA GGA ACA CCC CAA GAC CT-3 ),AMPKα_1.感觉（5 -CCT GCT TGA TGC ACA CAT GA-3 )和反义（5） -TCA TCA AAA GGG AGG GTT CC-3 ),甘露糖感受器(5 -CGG CAT GGG TTT TAC TGC TA-3 )和反义（5） -TAA法案GCA CCT GCT CGT CC-3 ）.实验采用三个独立的生物复制进行，基因表达标准化为mRNA表达水平β-肌动蛋白作为内源性对照，并计算处理和未处理对照样品之间表达的倍数变化。

2.9.蛋白质印迹分析

使用Bradford方法估算蛋白质含量。提取蛋白质（20-30 μg） 被加载到10%( )sds - page凝胶。免疫印迹分析使用抗α_1.基于“增大化现实”技术,AMPKα, p-AMPKα，PPARδ，PGC-1α、甘露糖受体和己糖激酶II。PPAR一抗的稀释比δ， p-AMPK (Thr172)， PGC-1α二抗稀释条件为:抗兔PPAR IgG抗体δ，AMPK，p-AMPK，PGC-1α，甘露糖受体1:5000，抗小鼠IgG抗体β-actin和己糖激酶II的比例为1:50 000。使用柯达GBX显影剂和固定试剂手动拍摄图像。

2.10.细胞内钙测量

Ca^2＋通过检测Ca发出的荧光，在共焦显微镜（LSM 510 Meta，蔡司；德国Oberkochen）下测量浓度^2＋-敏感指示器Fluo-3 AM用Fluo-3 AM处理细胞45分钟。在20倍物镜下观察培养板。荧光信号在488 nm的激发波长下检测。

2.11。葡萄糖吸收试验

C2C12心肌细胞的密度为 96孔培养板上每孔细胞数。当细胞生长到覆盖板孔表面80%以上时，将培养基改为含1%胎牛血清的分化培养基，培养4天，细胞分化为肌管。分化第三天，30μ米多君加入米多君处理组的培养基中，用PBS冲洗肌管两次，100分钟后饥饿 μL PBS，含2% ( )牛血清白蛋白40 用胰岛素治疗肌管（100分钟） μMol)和米多君(30μM） 二十 min，然后将2-脱氧葡萄糖添加到肌管中，将其培养20分钟 用PBS冲洗三次后，使用提取缓冲液提取肌管。提取物在500℃下离心 1-2的转速 然后，将上清液转移到新鲜试管中。将酶混合物、谷胱甘肽还原酶、底物和再循环混合物与分析缓冲液一起添加到稀释提取物中，并将反应混合物培养10分钟 在412处测量最小光密度 纳米。

2.12.油红O染色和肝甘油三酯含量测量

在24孔培养皿中，将细胞固定在冰冷的甲醇中15分钟 细胞在油红O溶液中染色1分钟，然后用PBS洗涤 h、 用40%异丙醇清洗30分钟后 s、 PBS洗涤两次，持续5小时 用光学显微镜观察细胞并拍照 向每个孔中添加100%异丙醇mL，并使用波长为530的ELISA阅读器估计洗脱的油红O试剂 按照制造商的荧光测定说明，使用TG定量试剂盒（Abcam）测量肝脏中的甘油三酯水平。

2.13.免疫组织化学

从冷冻切片制备骨骼肌组织切片，切片上的组织用4%多聚甲醛溶液固定20分钟 载玻片与0.3%H反应_2.O_2.溶液10分钟;冲洗后用正常血清液封闭1小时。玻片用一抗处理1 h，用PBS冲洗。二抗与载玻片反应30 min;PBS冲洗后，我们将vecastain ABC预混合试剂溶液与载玻片反应30分钟。PBS洗涤载玻片，与DAB底物溶液反应至变色。用自来水冲洗5分钟后，用苏木精对载玻片进行反染色。然后用自来水冲洗载玻片，在空气中晾干，然后安装。

2.14.线粒体染色

根据制造商关于活C2C12细胞线粒体染色的说明，使用细胞漆线粒体染色试剂盒（ab112143；Abcam）。简单地说，将细胞漆添加到活细胞中，并在固定前培养1小时。然后，通过荧光显微镜观察染色细胞。

2.15.统计分析

连续变量表示为 组间差异采用Mann-Whitney法进行评估测试。使用Kruskal-Wallis测试分析4组变量的总体差异。使用重复测量方差分析（ANOVA）比较4至8周龄三组SHR的血压记录。所有实验均采用至少三个独立重复进行。值<0.05被认为具有统计学意义。所有统计分析均使用SPSS（版本20.0，SPSS公司；美国伊利诺伊州芝加哥）进行。

3.结果

３．１．的影响α_1.-AR刺激对骨骼细胞和其他器官来源细胞线粒体能量分子表达、氧化磷酸化和生物学变化的影响

我们进行了细胞培养实验，以确定米多君是否非选择性α_1.-AR激动剂对PPAR有独立作用δ蛋白质和磷酸化AMPK（p-AMPK）表达，我们评估了骨骼肌细胞的线粒体氧化功能和ATP生成。我们发现，在仅用3%的剂量治疗后，C2C12心肌细胞的p-AMPK表达开始显著增加 μ米多德林δp-AMPK表达在给药3 h时增加，在给药约6 h时达到最大值(图)1（a）和1（b）)，尽管大家都知道米多君的血管收缩作用在几分钟内就开始显现[23]．为了了解其作用机制，我们观察了细胞内Ca的浓度^2＋在C2C12细胞、HL1细胞和HepG2细胞中，midodrine处理后其含量增加(图)1（c）).STO-609，Ca^2＋/钙调素依赖性蛋白激酶激酶抑制剂，用于抑制钙信号传导。p-AMPK和PPAR增加δ在C2C12和HL1细胞中，STO-609未见米多碱处理后表达(图)1 (d))这些结果表明钙参与米多君诱导AMPK磷酸化和PPARδ表达式。

使用细胞分裂素线粒体染色试剂盒测量的荧光度，米多君处理的C2C12细胞高于对照细胞（图1）1 (e))，提示米多君影响线粒体浓度。我们测试了线粒体SDH的活性，这是一种参与柠檬酸循环和电子传递链的线粒体氧化酶，结果发现，与对照组C2C12细胞相比，米多骏处理C2C12细胞的最大线粒体氧化磷酸化(使用Seahorse XFp分析仪估算的OCR测量)和细胞ATP含量均增加(图)1 (f)–1 (h)）.

目的：研究药物的生物学效应α_1.-AR在骨骼肌细胞上的表达，我们评估了米多骏处理的C2C12细胞中GLUT4的表达和细胞内2-脱氧葡萄糖的处理。与对照组相比，米多碱或胰岛素治疗组GLUT4表达水平较高( ;数字1(我)）.在C2C12细胞中加入米多德林或胰岛素也增加了2-脱氧葡萄糖的摄取( ;数字1 (j)）.因此，米多君改善了胰岛素的敏感性。

调查是否α_1.-AR刺激对非骨骼肌细胞具有相同的能量效应，我们用心肌细胞(HL1和H9C2细胞)和肝细胞(HepG2)进行了相同的实验，得到了相同的p-AMPK和PPARδ表达式的结果(数据1（a）–1 (d)）.在H9C2细胞中，米多骏增加了最大OCR(使用Seahorse XFp分析仪估计)和细胞ATP含量(图)1（k）和1（l））.

调查是否α_1.-AR刺激对非瘢痕肌细胞具有能量效应和细胞特异性生物学效应，我们对内皮细胞和脂肪细胞进行了相同的实验。米多君增加AMPK和eNOS（内皮型一氧化氮合酶）的磷酸化在用胆固醇和棕榈酸酯处理的培养的HUVEC中，添加PPAR GSK0660可降低磷酸化效应δ拮抗剂(图2(一个)）.这一结果表明，能量调节是由α_1.-AR刺激与内皮细胞eNOS表达的调节有关。此外，用化合物C抑制p-AMPK表达不会改变PPARδ表达式(图2 (b))。在分化的3T3-L1细胞中，米多君处理可降低细胞脂质含量，而添加GSK0660可消除这些降低（图2 (c)).与该结果相对应，PPAR的蛋白质水平δ，p-AMPK和PGC-1α米多君治疗后增加，这些增加也被GSK0660抵消（图2 (c)）.

为了检测炎症活性，我们研究了RAW 264.7巨噬细胞中甘露糖受体（抗炎M2巨噬细胞的生物标记物）的表达。甘露糖受体的mRNA和蛋白质水平在米多君治疗后最高（图2 (d)和2 (e)).此外，PPAR的mRNA表达δ和AMPKα_1.在使用50%的药物治疗后达到最大值 μM米多君（图2 (d))反过来，己糖激酶II（一种促炎性M1标记物）的蛋白质水平在50%葡萄糖治疗后达到最低水平 μM米多君（图2 (e)）.

因此，细胞实验的结果表明，药理作用α_1.-AR刺激通过PPAR通过线粒体氧化磷酸化直接促进ATP的产生δ-AMPK-PCG-1α途径，不仅在骨骼肌细胞，而且在心肌细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞和巨噬细胞。此外，它具有相关的细胞特异性生物学效应，提示α_1.-AR引起细胞代谢功能的改变。

3.2.长期服用米多君对自发性高血压大鼠骨骼肌线粒体能量分子表达和生化变化的影响

来确定在体外药理刺激作用α_1.-AR在不同的细胞中延伸到an体内本研究采用低剂量米多君治疗4周龄SHRs，连续4周不进行运动训练。我们选择SHRs作为人类代谢综合征的动物模型，5周龄是代谢的关键时期，此时血压和体重迅速增加。

与我们的细胞实验结果一致，米多胺处理(I组)大鼠骨骼肌中p-AMPK的表达显著高于阿替洛尔处理(II组)大鼠和对照组(III组)( ;数字3(一个)）.PPARδ和PGC-1α与对照组相比，I组动物骨骼肌的表达也升高( ;数字3(一个))细胞色素c氧化酶是线粒体内膜呼吸电子传递系统中氧化脂肪酸代谢的最后一种酶，在I组大鼠的骨骼肌中表达增加，但在II组和III组动物中表达减少（图3 (b)）.I组大鼠骨骼肌中SDH活性高于其他组( ;数字3 (c))值得注意的是，I组和II组大鼠骨骼肌中的ATP水平远高于III组对照大鼠( ;数字3 (c)).腹部脂肪量最大的III组SHR显示出最低水平的p-AMPK表达，尽管其骨骼肌中的ATP水平低于米多君治疗组和阿替洛尔治疗组动物。米多君治疗组大鼠的SDH活性远高于其他组，表明米多君治疗组大鼠的ATP含量与AMPK激活相关，而阿替洛尔治疗组大鼠的ATP含量与骨骼肌ATP消耗量的减少相关，而非增加。

解偶联蛋白3 (uncoupling protein 3, UCP3)在I组动物骨骼肌中的表达高于其他动物α_1.-与对照组相比，I组动物骨骼肌中AR的表达较低（图3(一个)）.与其他动物相比，I组大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白表达增加更多(图)3 (b)）.

总之,药理α_1.-AR刺激骨骼肌增加了通过PPAR产生的线粒体氧化磷酸化形式的ATPδ-AMPK-PCG-1α改变骨骼肌的相关生物学功能。

3.3.长期服用米多君对自发性高血压大鼠多器官线粒体能量分子表达和功能变化的影响

我们还探讨了是否有药理作用α_1.-AR单独刺激可激活能量分子的表达，改变骨骼肌以外器官的功能。米多胺处理I组动物p-AMPK、PPAR显著升高δ，和PGC-1α血管紧张素II的AT1受体(AT1R)在心脏中的表达和表达低于对照组(图)4（a）).由于心肌中ATP动力学的快速转换，我们无法测量心脏ATP含量。

在心功能方面，I组和II组大鼠的超声心动图左心室缩短分数和射血分数均高于III组大鼠( ）.米多君治疗组动物的计算左心室重量和收获的心脏重量均小于其他组（表1）1.）.

此前的几项研究报告称α_1.-AR刺激对心肌肥厚有复杂的影响，这些肥厚的结果大部分不是病理性的，而是生理性的，收缩功能保持或增强[24]．在一项研究中，转基因小鼠的心脏功能增加了170倍α_1.-ARs，心肌肥厚未发生，但肌力明显增强。α_1.-AR刺激显然将心力衰竭和肥大转变为胎儿基因程序，其中细胞能量更多地依赖于糖酵解，而较少依赖于线粒体氧化活性[25]．因此，ATP产生的能量特性可以解释为什么药理学刺激α_1.-AR-PPARδ-AMPK-PGC-1α途径可预防心力衰竭和病制性肥厚，我们的研究结果表明，米多德林增加心肌线粒体氧化能量过程可增加心脏收缩力，防止肥厚。这一发现支持了先前心肌细胞限制PPAR的研究结果δ缺失扰乱心肌脂肪酸氧化并导致心肌病[6.]。其他研究显示α_1.ar刺激对维持正常的心脏收缩功能至关重要α_1.-AR阻断或敲除加重心力衰竭，尽管降低后负荷[12–14]．

尽管血压立即升高α_1.-AR介导的血管收缩，米多君在给药1周后开始降低收缩压和舒张压，这些作用持续到研究结束( ,数字4（b）).I组和II组大鼠的收缩压、舒张压和平均血压均低于对照组动物( )之间的2^nd四,^th实验结束时，第二组大鼠的平均心率在各治疗组中最低。PPARδp-AMPK在I组大鼠主动脉表达增高(图)4 (c))内皮层磷酸化eNOS蛋白的表达在I组动物中高于III组对照组（图4 (d)）.I组和II组大鼠主动脉内壁AT1R蛋白表达均低于III组对照组大鼠(图)4 (d)).关于α_1.-AR刺激，我们的结果表明α_1.ar具有双重生物学功能:早期血管特异性收缩效应[23]以及血管细胞线粒体能量激活产生的晚期血管舒张作用，其最大水平约为6 h给药后（数字）1（a）和1（b））.这种晚期效应似乎改善了血压的升高，因为内皮层的eNOS磷酸化增加，而动脉内侧层的AT1R表达减少。这些发现支持了之前的研究结果α_1.-AR介导完整动脉eNOS磷酸化[26而AMPK的直接激活会刺激动脉内皮细胞中eNOS的表达[27]此外，据报道，AMPK激活和AT1R下调之间存在串扰[28]．

在我们的生化研究中，第一组和第二组动物的血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇低于基础组和第三组动物( ),但三酸甘油酯水平在各组之间没有差异(见表)2.）.在肝脏中，米多君增加了p-AMPK的表达，降低了HMG CoA还原酶蛋白的表达，并降低了血清LDL胆固醇水平和脂质含量的积累，但PPAR的表达δ和PGC-1α米多君治疗后没有变化(图5（a）和5 (b)）.

在腹部脂肪中，细胞色素c氧化酶、p-AMPK、PPAR的表达水平δ，和PGC-1α米多君治疗后水平升高( ;数字5 (c))。结合我们的细胞培养实验结果，这些发现表明白色脂肪组织可能转变为米色。米多君组I大鼠的平均体重和腹部脂肪在各组中最低，而阿替洛尔组II大鼠的体重在各组中最高在8周龄时，各组大鼠的腹部脂肪量在I组大鼠中也最低( ;数字5 (d)）.

血清促炎细胞因子IL-6和IL-1水平βI组动物的死亡率低于其他组，但差异不显著（表1）3.).IL-1水平β在I组大鼠中比III对照组和II组大鼠低，但这种差异也没有达到显著性( ）.然而,肿瘤坏死因子-αI组的表达明显低于II组( ）.I组ROS水平低于II组和III组，但差异不显著。基础对照组的脂联素水平在各组中最高，在调整内脏脂肪重量后，I组大鼠的脂联素水平显著高于III组( ;桌子3.)有趣的是，免疫组化检测显示，与III组对照组相比，I组动物的甘露糖受体表达增加，尤其是在脾脏包膜下部分的细胞中( ;数字5 (e)).这种抗炎作用α_1.-AR-PPARδ-PPAR报告支持AMPK激活δ是替代激活巨噬细胞效应表型的充分表达所必需的[29]，以及一项报道，运动训练通过抑制巨噬细胞浸润和加速肥胖小鼠中M1巨噬细胞向M2巨噬细胞表型转变来抑制脂肪组织炎症[30.]．

总之,药理α_1.-AR刺激多个器官，包括骨骼肌，通过PPAR增加线粒体氧化磷酸化形式的ATP生产δ-AMPK-PCG-1α改变相关器官特异性生物学功能。

4.讨论

在这项研究中，我们已经证明α_1.-AR激活通过刺激线粒体能量分子(PPAR)促进线粒体氧化磷酸化途径的激活，从而产生ATPδ、AMPK和PGC-1α)在所有受试的代表性细胞和器官中，包括骨骼肌，并影响它们的细胞特异性生物学功能在体外和体内条件。此外，它的机理α_1.-AR激活刺激ATP的产生可能主要通过PPAR起作用δ，之前的一项研究报告称PPARδ作为AMPK的上调节因子[31].药理学α_1.ar刺激模拟了骨骼肌对运动的反应。令人惊讶的是,α_1.ar刺激不仅在骨骼肌中，而且在其他细胞和器官中重新编程了能量通路;因此，生理效应α_1.-AR并非特定于运动肌肉体内在测试中，骨骼肌以外的细胞和器官的生物功能发生了类似于运动对健康影响的变化，尽管这些动物没有进行运动训练，这表明它们的骨骼肌分布广泛α_1.-我们假设这种运动模拟效应与细胞促进代谢和功能变化之间的耦合有关，因为它只发生在药理作用下α_1.-AR刺激，无需运动或肌细胞因子治疗。

目前，骨骼肌的反复收缩和放松被认为是获得锻炼健康效果所必需的[8.]在代谢方面，耐力运动的基本反应是通过骨骼肌中燃料的线粒体氧化产生足够的ATP。ATP生产所需的营养消耗被认为是通过肌肉的变化影响全身代谢，肌肉消耗了身体全部能量代谢的40%-50%，这些变化足以对全身产生健康的运动效果。然而，在这项研究中，我们发现α_1.-AR激活骨骼肌细胞重新编程，通过增强线粒体氧化磷酸化过程来增加ATP的产生。此外，它通过钙信号在个体细胞水平上影响生物功能，如运动中所见。midodrine治疗时发生的AMPK磷酸化是PPAR的结果δ因为加入PPAR后，生物效应消失了δ拮抗剂,GSK0660(数字2(一个)和2 (c))， AMPK拮抗剂对PPAR无影响δ表达式(图2 (b)）.因为以往的研究报道了免疫细胞中通过能量代谢向线粒体氧化磷酸化途径的重编程来调节器官特异性生物功能的代谢功能变化[4.]，肿瘤细胞[32]，骨骼肌[8.,9,33]，心肌[6.]，以及造血干细胞[7.]，我们还使用了药理学α_1.在缺乏锻炼的情况下进行ar刺激，以研究细胞燃料代谢与功能变化的耦合是否在所有细胞和器官中都起作用，我们已经证明，该范式在我们测试的所有代表性细胞和器官中都起作用。

因此，由α_1.-AR的激活与耐力运动引起的几乎相同:同时通过线粒体氧化磷酸化增加细胞ATP产生途径，在多个器官中控制基于细胞的器官特异性生物功能。因此，我们建议适当α_1.-AR激活是一种简单的方法，可以让身体在运动或心力衰竭等压力条件下承受稳定的能量消耗过程。因此，运动效应的很大一部分与α_1.-AR激活独立于骨骼肌运动，运动效果归因于运动肌肉本身在以前的大多数运动研究中可能被高估。虽然运动对肌肉的影响似乎主要是由于运动本身，α_1.-其他器官中AR的激活被认为是全身运动效应的主要机制。然而，本研究的结果并未解决由运动肌肉产生的肌动蛋白引起的器官串扰现象[34]．在肌生长因子驱动的器官串扰中，肌肉运动是获得锻炼的健康效果的一个重要部分。然而，在这项研究中，只给予小剂量的an，就可以在多个器官中获得类似的健康效果α_1.肾上腺素。我们认为肌肉生长因子的机制和α_1.ar刺激在产生运动的健康效果方面是相辅相成的(图)6.)我们认为总的运动效应是由肌因子途径和PPAR-AMPK-PGC-1共同作用的结果α通路由α_1.-AR刺激，但我们还不知道每个通路对运动效应的确切比例。需要进一步的研究来澄清这个问题。PPAR-AMPK-PGC-1的顺序刺激α可以直接或间接地证明米多碱的途径，如图所示2.以及补充材料(可用)在这里)，我们先前发表的文章[31，以及其他报告[35,36]．

在我们的研究中，我们没有进行PPARδ-、AMPK-或PGC-1α-激动剂刺激线粒体氧化磷酸化。只有一个α_1.-使用了AR兴奋剂，有趣的是，所有这些高能分子的表达增加了α_1.基于“增大化现实”技术的激活。尽管有几项研究表明，一些与运动相关的肌肉效应是通过直接刺激PPAR获得的δ、AMPK或PGC-1α在美国，没有一项研究报道了锻炼对全身健康的影响。此外，以往的报告亦列出癌症的发展[37]增加心脏病风险[38PPAR的副作用之一δ、AMPK和PGC-1α因此，一种安全有效的药物可以通过直接刺激PPAR来模拟健康运动效应δ、AMPK或PGC-1α目前还不能用于临床。

什么时候α_1.-AR在临床上是由米多君激活的，安全，副作用很少[39]．关于米多君产生代谢作用所需的剂量，我们发现p-AMPK、PPAR显著增加δ，和PGC-1α在C2C12心肌细胞中表达μ米多君。在动物研究中，我们给药约0.3 mg/kg/d (1.2μM/kg/d)的米多君，相当于约0.05 mg/kg/d的人类临床实践。我们给患者每日服用浓度为10.0的米多君μM计算大鼠每日饮水量，计算米多君在大鼠血清中的峰值浓度约为3.38μM在以前的药代动力学研究中[40]．这种治疗足以刺激器官和动脉中充满活力的分子和生物效应。因此，很可能是代谢作用α_1.-在动物实验中，当米多君的浓度甚至低于我们细胞实验中的最低有效浓度时，可以获得AR激活。

尽管选择性α_1.-AR激动剂将在研究其差异方面发挥关键作用α_1.-AR亚型分布在不同的器官，以及它们如何影响细胞特异性效应，我们使用米多骏，非选择性α_1.-AR激动剂α_1.A-,，α_1.B-，和α_1.D-AR[41在这项研究中。我们认为它适合研究综合健康运动的效果，因为它刺激了所有的亚型α_1.-AR，根据生理需要在全身分配。

我们的研究结果表明α_1.ar通过两种可能的信号转导途径发挥作用。到目前为止,α_1.-ARs被理解为通过G发出信号αq/11导致磷脂酶C的激活，磷脂酶C导致磷酸肌醇（IP）和甘油二酯的增加，而磷酸肌醇（IP）和甘油二酯又分别导致IP敏感库中钙的释放和蛋白激酶C的激活^2＋频道和Na⁺- h⁺还有Na⁺-Ca^2＋交换并激活或抑制K⁺渠道(42].此外，α_1.-AR激活可导致早期和晚期反应基因的转录激活[17]．在大多数细胞中，主要的功能反应是对所有细胞的激活α_1.-AR亚型是细胞内钙的增加^2＋，包括早期反应，如血管收缩[17]以及通过PPAR的晚期代谢反应δ-AMPK-PGC-1α激活血管和其他器官(图2.–5.）.血管特异性血管收缩效应在米多君摄入1小时内出现，血压持续升高2 - 3小时[43]，但PPAR的影响δp-AMPK表达在3小时内增加 h、 达到最高水平约6 h在本研究中药物治疗后（图1（a）–1（c）).这两种功能的开始和持续时间的差异可能表明α_1.-AR的激活与特定基因表达模式的存在或缺失有关。

5.结论

总之,药理α_1.-AR刺激主要通过PPAR重组细胞能量代谢δ以线粒体氧化磷酸化形式产生ATP，从而调节生物细胞功能，模拟运动的健康效应；全身分布α_1.-ARs与全身多个器官的效应有关。

数据可用性

当其他研究人员提出请求时，我们可以提供数据。数据请求的电子邮件地址如下：mdhsseo@unitel.co.kr和lyj2333@hanmail.net.

披露

资助方无法控制任何研究数据的收集、分析或解释，也无法控制文章的写作或提交出版手稿的决定。

利益冲突

所有作者均声明没有利益冲突。

作者的贡献

Hong Seog Seo撰写了主要的手稿文本，构思和设计了研究，收集和解释了数据，并进行了文献检索。Lee Yong Jik参与了所有实验，撰写了手稿文本，收集和解释了数据，并进行了文献检索。金贤洙、金玉娜、游娜珍、尹美涵和金贤民修改了手稿；分析、收集和解释数据；并准备了图表。所有作者都审阅了手稿并批准了最终版本。

致谢

这项研究得到了高丽大学医疗中心和高丽大学九老医院的资助(O1801781)。资金来源在研究设计中没有作用。

补充材料

补充图1:PPAR的ELISA结果δ(A)， AMPK (B)， PGC-1α（C） 在分化的3T3-L1细胞中，30 μ米多德林和150 nM GSK0660。补充图2：油红O染色导致用30%葡萄糖处理的分化3T3-L1细胞 μ米多德林和150 nM GSK0660。(补充材料)

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