差异表达和预后前列腺癌生物标志物发展的当前挑战

摘要

介绍.在活组织检查时预测前列腺癌的侵袭性在做出治疗决定时是非常宝贵的。在本文中，我们回顾了通过微阵列分析确定为前列腺癌预后潜在有用标志物的基因和microRNA的差异表达，并讨论了与其发展相关的一些挑战。方法．通过Medline对文献进行了回顾。通过搜索“前列腺癌与差异表达”、“前列腺癌预后”和“前列腺癌与microRNAs”来识别文章。结果．尽管许多差异表达的基因和microrna被确定为可能的预后标志物，但这些基因的意义要么由于相互冲突的结果而存在争议，要么在其他研究人群中未得到验证。一些文章使用一组需要进一步验证的生物标志物构建了预测列线图。发展有用标志物的挑战包括不同的方法学、癌症异质性和抽样误差。这些问题可以通过将预后因素分类为特定的基因途径或用基于血液或尿液的生物标志物补充活检信息来克服。结论．虽然基于差异表达的生物标志物有可能改善前列腺癌的决策，但需要进一步验证其在活检水平上的实用性和准确性。

1.介绍

据估计，2012年美国有241740名男性被诊断为前列腺癌[1］．对于发达国家的男性来说，它是男性中诊断出的最常见的癌症，也是癌症特异性死亡的第二大常见原因[2］．在这些被诊断的男性中，大约90%的人前列腺癌处于局部的、有可能治愈的状态[3.］．自从PSA筛查被引入以来，前列腺癌的死亡率已经下降，部分原因是治疗方法的改进[4］．然而，一些大型的PSA筛查随机试验证明，前列腺癌在许多情况下被过度治疗，使患者的治疗发病率增加[5，6］．

为了降低无痛性癌症患者的治疗发病率，临床医生已经制定了主动监测方案，通过该方案可以监测低风险患者的进展情况。然而，由于前列腺活检的局限性导致采样错误，多达33%的患者被重新分类，其中大多数患者被重新分类发生在第一次重复活检时[7］．Gleason评分本身就提供了前列腺癌复发、进展和死亡的最佳预测临床特征。此外，预处理列线图如Kattan、CAPRA(前列腺癌风险评估)评分和Stephenson列线图有助于预测前列腺癌的侵袭性[8- - - - - -10］．随着先进分子生物学技术的出现，更多的信息可以更准确地选择从治疗中获益最多的患者。分子技术特别有用的一个领域是对惰性和侵袭性前列腺癌活检标本的特征描述。

在本文中，我们讨论了使用从前列腺癌组织中获得的差异mRNA和microRNA (miRNA)表达谱来改善前列腺癌预后。我们还将讨论这些技术的局限性，包括表达谱本身的再现性、前列腺癌的异质性以及前列腺活检引起的采样误差。

2.基因表达面板

有几个不同的基因已被报道与前列腺癌预后相关(表1)．通常这些基因在个别研究中被识别出来，可能有相互矛盾的结果或低敏感性或特异性。为了提高这些基因的预测能力，一些研究评估了一小组基因的表达。

２.１.小基因面板

使用一个包括PTEN、SMAD4、细胞周期蛋白D1和Spp 1的4基因组，Ding等人证明，当添加到PSA中时，与该组的关联性增强[20.］．作者首先验证结果在接受治疗的79名病人建立一组纪念斯隆凯特林,在c指数(一致性指数衡量的能力区分的结果,在0.5没有歧视和1.0是完美的歧视)从0.77提高到0.80,当添加基因面板格里森评分。在来自医师健康研究(PHS)的第二组人群中，当将4个基因面板添加到格里森评分时，c指数从0.716提高到0.816。使用RNA表达谱对这2个先前的队列进行了检测。第三项验证证实了这一改进，使用免疫组化染色的组织微阵列对405名接受小肾治疗的男性前列腺癌进行了检测。

在另一个模型中，TGFβ和IL-7被纳入44例前列腺癌标本的前列腺癌生存预测模型[15］．作为细胞因子，TGF通路改变β能刺激血管生成并抑制癌细胞的免疫浸润[36］．相反，IL-7活性的降低降低了淋巴细胞的淋巴细胞活性[37］．因此，在一个多元模型中(包括TGFβ如IL-7、PSA和Gleason评分)，两者均基于TGFβ和IL-7是前列腺癌生存的独立预测因子，其危险比分别为10.4和0.1 [15］．此外，与PSA和Gleason评分相比，这个四变量模型几乎使癌症生存预测能力提高了两倍。然而，这是否会在活检标本中重复还有待观察。

在102个激光捕获显微解剖标本中，通过微阵列分析检测差异表达，筛选出38个候选基因在Gleason 4和5模式与Gleason 3模式中差异表达[38］．在157例前列腺切除术后5年内发生转移或死亡的高危患者与没有进展的对照组中，使用这38个基因构建了一个模型，并匹配了Gleason评分、分期、边缘状态和PSA。通过单因素和多因素分析，构建了4变量模型，包括拓扑异构酶2a、cadherin 10、TMPRSS2与ETS家族转录因子融合状态和非整倍体，得出AUC为0.81，用于预测前列腺切除术后的进展。

2．2.较大的表达谱

与只使用少量基因的面板不同，微阵列技术允许研究人员识别多个基因之间的差异，从而产生包含10多个基因的更大表达谱。除了使用少量差异表达基因来评估前列腺癌预后的预测模型外，其他研究也显示了更大的表达谱也可以用于预测。在一项71例根治性前列腺切除术患者的研究中，Bibikova等人使用福尔马林固定、石蜡包埋的前列腺癌样本分析了512个基因的表达谱[39］．共有11个基因与Gleason评分呈正相关，5个基因与Gleason评分呈负相关。使用这个16基因面板(GEX)，证明了GEX比Gleason评分(AUC = 0.65)更能预测前列腺癌复发(AUC = 0.73)。GEX对患者最有预测性，Gleason评分为7分。

在Markert等人的类似分析中，一大组基因的表达谱被用来描述肿瘤为茎样、中间或分化的。该小组结合TMPRSS2-ERG融合和PTEN状态预测前列腺癌的致死率[40］．特别重要的是，该表达面板是在来自瑞典Watchful Waiting试验的281例前列腺癌中开发的，验证了该模型在治疗前预测患者预后的使用。干细胞样前列腺癌表现为干细胞样前列腺癌，PTEN和p53失活，预后最差。ERG融合癌和炎症特征癌的预后均为中等，而分化组预后最好。这种表达谱的聚类与格里森评分、复发、进展和致死率相关。该模型的一个局限性是，它是在通过TURP标本诊断更高率的患者队列中开发的。为了在一组主要通过活检诊断的男性(150名在纪念斯隆凯特琳癌症中心接受根治性前列腺切除术的男性)中证实这一点，markt等人证实了这组标志物与Gleason评分、复发、进展和致死率之间的关联。

3.微

自2002年首次被描述与癌症有关以来[41]， microRNA (miRNA)的领域已经迅速扩展为潜在的生物标志物和治疗靶点。microrna是一种小而有功能的RNA，它可以通过影响mRNA的翻译或降解来调节mRNA的表达。人们认为人类基因组中有1000个mirna。miRNA靶点的识别是困难的，因为通常只有一小部分miRNA(6-8个碱基)与靶mRNA调控区域完美匹配[42］．

由于它们的体积较小，mirna在福尔马林固定的组织中非常稳定[43］．这种稳定性使它们更容易在前列腺活检、血清或其他液体中被检测到。为了支持这种稳定性，Xi等人比较了40份存档的结肠癌样本作为新鲜冷冻样本收集与那些使用福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本收集的表达谱[44］．利用锁定核酸芯片分析，观察到很强的相关性(=0.89）。此外，使用定量实时PCR，他们注意到，尽管使用了10年前的样本，但miRNA的表达随着时间的推移保持稳定。除了在固定过程中保持稳定外，从活检标本中获得的miRNA的分析必须能够从活检标本中获得的少量RNA中进行。Mattie等人.使用线性扩增技术成功地将固定前列腺活检标本中的miRNA表达与癌前和正常前列腺标本中的miRNA表达区分开来，该技术允许从少量RNA中检测这种差异表达[45］．最后，Nonn等人在固定的前列腺活检与匹配的新鲜冷冻根治性前列腺切除术标本中发现了类似的miRNA和mRNA表达[46］．

一些mirna与前列腺癌的开始、进展和转移有关(见表)2).据报道，超过150个miRNA在前列腺癌中上调或下调[43］．其中一些研究的结果需要验证，因为它们对特定的miRNA是上调还是下调产生了相互矛盾的结果，这可能取决于样本收集或研究设计。然而，一些研究已经报道，并提供了潜在的预后标志物，特别是那些涉及进展和转移。

３．１．参与进展的潜在标记物

MiR-21已被发现在几种癌症中过表达，包括前列腺癌[63］．在一项前列腺癌细胞的凋亡和侵袭性研究中，miR-21在DU-145和PC3(两种雄激素依赖性较低、侵袭性较强的细胞株)中过表达，而在LNCaP细胞株(雄激素依赖性较强、侵袭性较弱的细胞株)中不表达。miR-21在侵袭性细胞系中的激活使其更容易凋亡，并降低细胞的运动性和侵袭性[50］．在这些细胞系中，研究表明miR-21下调了参与膜-肌动蛋白相互作用的PDCD4、TPM1和MARCKS。此外，在169例根治性前列腺切除术样本中，miR-21表达与不良临床结果相关[51］．其表达与分期、Gleason评分、生化复发、淋巴结转移有关。在一个包括PSA、年龄、Gleason评分、手术切缘、淋巴结转移和病理分期的多变量模型中，miR-21与生化无复发生存显著相关(33.9% vs . 44.5%)。然而，在包含这些变量的预测模型中加入miR-21仅产生了AUC的适度改善(0.701至0.714)。MiR-21也可能是PTEN的抑制因子，其抑制可能导致迁移或侵袭[52］．

MiR-145已被证实在多种肿瘤类型中下调，并与肿瘤大小、分级和预后相关[64- - - - - -66］．Chen等人发现凋亡诱导因子基因的抑制因子BNIP3蛋白是miR-145的靶点[67］．使用134例FFPE前列腺活检标本，他们发现miR-145在进展的前列腺癌中表达阳性的比例为14%，在进展的前列腺癌中表达阳性的比例为46%，而在其靶向BNIP3中表达阳性的比例为76.6%，在未进展的前列腺癌中表达阳性的比例为57.1%。Kaplan-Meier分析显示，MiR-145与疾病特异性和无进展生存显著相关。一项纳入Gleason评分、PSA和肿瘤分期的多因素分析显示，miR-145是无进展生存期的独立有利预后因素(HR = 0.404, CI)_95%= 0.174 - -0.941)。

几项研究表明，聚类miR-15/miR-16在前列腺癌中下调[47- - - - - -49］．Bonci等人在15例前列腺癌活检和20例前列腺癌培养中证实了85%的miR-15a/miR-16的下调[48］．在CaP细胞中，Bcl2, Ccdn1, WNT3A的表达增加，而miR-15a/mi-16降低。这些靶点参与细胞存活、增殖和侵袭。这个microRNA簇是一个特别有吸引力的预后指标，因为它位于13q14的染色体区域。虽然该染色体区域的缺失在转移性CaP中更常见，但一定比例的早期癌症显示了这种缺失，且这种缺失的频率与癌症从早期到晚期到转移期的进展相关[68，69］．最后，miR15和16可能与支持肿瘤的基质细胞相互作用，其下调可增加成纤维细胞生长因子-2及其受体的表达[49］．

miR-34a是由p53诱导的，在p53缺失的情况下也可以执行p53的许多功能[70］．然而，miR-34a的缺失会损害p53的活性[56］．Liu等人证明miR-34a的再表达可以直接抑制前列腺癌中癌症干细胞的生长和存活，前列腺癌被认为是参与进展和转移的细胞[57］．miR-34a和34c也可能参与雄激素受体依赖，p53介导的凋亡及其失调可能是癌细胞逃脱雄激素抑制的另一机制[56］．我们已经证明，在前列腺癌标本中miR-34a表达的缺失与雄激素受体表达的增加有关。在我们的研究中，BR-DIM (biresponse, 3,3 ' -Diindolylmethane)治疗前列腺癌导致miR-34a启动子去甲基化，从而失活雄激素受体[71］．

３.２．临床样本中的差异miRNA表达

在对60例前列腺癌与16例前列腺切除术标本的非癌切片进行的全基因组miRNAs表达分析中，15个miRNAs在有前列腺外延伸的肿瘤中表达差异[54］．与其他研究人员相比，varambalally等人的miR-101在具有前列腺外扩张的肿瘤中过表达最一致[72］．先前的研究表明，它的目标是抑制几个基因表达的主调控因子EZH2 [73］．更有趣的是，miR-32也过表达，并抑制了刺激细胞凋亡的分子Bim [54］．

在一项类似的研究中，Schaefer等研究了76例根治性前列腺切除术样本的mi-RNA表达谱，并将差异表达与临床结果关联起来[55］．使用24个肿瘤和24个非癌样本，通过微阵列分析，470个miRNA探针中有15个显示了差异表达，然后在76个样本中通过qRT-PCR验证了差异表达。MiR-96与Gleason评分呈正相关，miR-31、205与Gleason评分呈显著负相关。mirna 125b、205、222与肿瘤分期呈负相关。最后，在包括Gleason评分和肿瘤分期的回归模型中，miR96是无复发生存的预测因子(HR = 3.38)。

在第三项分析miRNA表达谱与前列腺癌预后的研究中，通过微阵列分析，使用114个miRNA探针，在40例根治性前列腺切除术标本的癌组织切片与非癌组织切片中识别差异表达的miRNA [59］．在114个被检测的mirna中，5个在癌组织中相对于正常组织下调(miR-23b, 100, 145, 221和222)。11例早期生化复发患者miR-135b和miR-194的表达较11例未早期复发患者升高40%。MiR-135b可能靶向错配修复基因MsH2 [74]，而miR-194抑制参与DNA超甲基化的从头甲基转移酶DNMT3a和甲基结合蛋白(DNA超甲基化的破坏导致基因组不稳定)[75］．

4.当前发展面临的挑战预后标记

4．1.前列腺生物标志物发现的可重复性

鉴别前列腺癌患者预后指标的困难很大程度上源于不同中心的研究结果相互矛盾。这一点在一篇关于前列腺癌中miRNA表达谱的综述文章中得到了说明，其中比较了最大的5个miRNA表达谱系列[76］．在这一系列讨论的45个mirna的列表中，16个显示了它们是上调还是下调的差异。此外，在所有5个系列中，没有一个基因被认为是重要的。

Michiels等人直接调查了不同人群中基因表达谱的重现性，测试了7项公开可用的表达谱研究数据的稳定性，这些数据来自多个随机验证集，以预测二元结果[77］．使用通过微阵列分析开发的每个训练集中与结果相关度最高的50个基因，他们发现在验证集中存在相当大的误分类，最低误分类率在31%到49%之间。此外，这些误分类率的许多置信区间重叠了50%，这表明在所有的研究中，除了两项研究外，表达谱在预测结果方面并不比单靠运气更好。他们还注意到，误分类率随着训练集大小的增加而降低。

为了从微阵列分析得到的基因表达谱获得更多的确定性，需要考虑其他相关方法。评估基因表达谱重现性的传统方法是计算不同数据集之间一致的基因数量，并将它们作为总表达基因的百分比进行表达，称为重叠基因比例[78］．最近开发的一种比较两个单独的基因表达面板的指标评估了每组之间共享的功能相关基因的比例，而不是特定基因的共享表达。这被称为相关重叠基因比例(POGR，或nPOGR，当它在两组之间标准化时)。尽管两个独立的数据集可能有非常低的POG分数，但它们的nPOGR分数可能非常高。例如，在前列腺癌中，当将前10个基因(0.30 - 0.89)、50个基因(0.14 - 0.69)和前100个基因(0.15 - 0.66)的分析从POG改为nPOGR时，一致性评分显著提高。这种微阵列解释的方法考虑了特定癌症的功能表达，这比实际的基因本身更具有临床相关性。

为了进一步推进这一概念，Soh等人开发了一种不同的衡量方法来分析微阵列分析，其中考虑了可能出现功能分离的基因之间的相互作用[79］．这种技术被称为基因的子网络(Snet)，分析基因表达与已知相互作用的基因网络的关系。这考虑到某些基因受到具有某种功能的其他基因的影响，这一概念在生物学上更为现实。然而，使用这些技术的一个问题是，当对特定基因或基因相互作用的假设不正确时，可能会出现关于基因表达谱再现性评估的潜在错误。

4.2.克服前列腺癌异质性

基于表达谱预测前列腺癌预后的另一个问题是，在同一患者中，许多前列腺癌的肿瘤分级不同。在对115例连续前列腺癌的分析中，Arora等人指出，100例(85%)前列腺切除术标本有1个以上的肿瘤病灶[80].在仅有9%的病例中，所有确定的肿瘤病灶都反映了整体的Gleason分级。因此，我们可以预期单个根治性前列腺切除标本中每个肿瘤病灶之间的基因表达存在异质性。如果假设多灶性前列腺癌是由场效应场景引起的，这将是一个特别的问题Boyd等人利用高分辨率全基因组拷贝数分析表明，即使是多灶性前列腺癌也可能有单克隆起源[81］．在18例前列腺切除术标本中，有13例发现有1个以上的肿瘤灶，因此有丰富的资料。在这些病例中，在每个前列腺癌病例中，所有肿瘤灶共享由相同断点定义的相同基因组拷贝数变化。这表明多灶前列腺癌起源于单一的致瘤事件，其后代作为肿瘤干细胞迁移到整个前列腺组织。因此，在这些祖细胞水平上，肿瘤病灶之间可能具有高度的一致性。由此产生的Gleason评分异质性则来自于迁移事件之后发生的变化。如果能够识别出这些祖细胞的共同表达谱，这些表达谱将在各个肿瘤中更加一致。然而，如果后期的变化更具有预后意义，则祖细胞表达谱可能无关紧要。

基因表达谱可能遇到异质性的另一种方式是前列腺内组织的复杂性。基于粗糙解剖获得的样本的基因表达谱可能被邻近的正常前列腺上皮细胞、前列腺间质和浸润性淋巴细胞污染。为了减少这种污染，最近的研究使用了一种激光捕获的前列腺癌灶显微解剖技术，这种技术允许人们将恶性上皮细胞从周围组织中分离出来[46］．这项技术还允许研究人员单独检查这些恶性细胞附近的间质，这可能阐明肿瘤-间质相互作用在前列腺癌进展中的作用。这种技术的局限性在于，这种方法只能提取少量的RNA。这需要在分析之前进行放大，这可能会在表达式概要中引入错误[82］．与mRNA相比，mirna需要更少的组织进行分析，这使其更适合这项技术，尽管这两种形式的RNA都已通过这种方法成功获得[46］．

4．3．前列腺活检的错误分类

为了指导治疗决定的预后标志物，必须在活检标本中可靠地检测到它们。然而，众所周知，与相应的根治性前列腺切除术标本相比，前列腺活组织检查常常会对肿瘤进行错误的分类。在最近一项关于Gleason升级的大型研究中，我们回顾了7643例根治性前列腺切除术标本[7］．根治性前列腺切除术时Gleason评分从Gleason 6升级到更高的分数的发生率为36.4%。其中，11.2%是由于三级模式，这意味着仍有25%的格里森一级或二级评分的升级率。

与使用前列腺活检预测根治性前列腺切除术格里森评分(Gleason score)所产生的差异(可能是基于采样误差)类似，人们也会预期从活检核心获得的基因表达谱会出现错误分类。Nonn等人比较了从冷冻组织根治性前列腺切除术标本和石蜡包埋前列腺活检中获得的表达谱，同时使用了mRNA和miRNA谱[46］．mRNA表达谱的比较显示，在根治性前列腺切除术标本中检测到的34个差异表达mRNA中，有10个(29%)也在前列腺活检中检测到。miRNA表达谱的比较表明一致性提高了，前列腺切除术中检测到的73%的miRNA在活检标本中也被检测到，假阳性率为8%。

克服这种取样误差的另一种方法是利用循环或排泄的表达谱来补充通过组织表达谱获得的表达谱。例如，一组5个循环miRNA被发现可以预测前列腺活检检测前列腺癌[83］．另一个例子是使用尿PCA3来预测前列腺癌预后。尿PCA3与肿瘤体积、阳性边缘、肿瘤分期和Gleason评分相关[84］．

5.结论

惰性前列腺癌的过度治疗以及患者在主动监测中可能的错误分类，都证明了生物标志物的发展可以改善前列腺活检时前列腺癌预后的预测。一些研究已经证明了mRNA和miRNA的差异表达在预测临床结果中的作用。这些研究需要验证，因为不同系列的研究结果往往不一致。额外的限制来自于前列腺癌的异质性和活检样本的错误。需要对这些有价值的预后工具进行进一步的研究，以验证其重现性和准确性。

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版权所有©2012 Steven M. Lucas和Elisabeth I. Heath。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。