乳杆菌猪小肠上皮细胞在过氧化氢环境下表现出抗氧化和细胞保护活性

摘要

益生菌广泛用于保护应激诱导的肠道功能障碍。氧化应激在胃肠道疾病中起着重要作用。益生菌可以缓解氧化应激;但其作用机制尚未阐明。我们开发了一个在体外探讨猪肠道上皮细胞(IPEC-J2)氧化应激模型的抗氧化作用及潜在作用模式乳杆菌ZLP001。IPEC-J2细胞用无误预孵育l .杆菌用ZLP001处理3 h，然后用过氧化氢(h₂O₂) 4小时。预处理与l .杆菌ZLP001保护IPEC-J2细胞抗H₂O₂引起的氧化损伤，如细胞活力测定所示，并且显着减轻了H引起的细胞凋亡₂O₂．l .杆菌与H相比，ZLP001预处理降低了活性氧生成和细胞丙二醛浓度，提高了线粒体膜电位₂O₂单独治疗，表明l .杆菌ZLP001促进细胞内氧化还原稳态的维持。此外,l .杆菌ZLP001调控某些抗氧化酶的表达和生成，从而激活抗氧化防御系统。治疗l .杆菌与H相比，ZLP001导致细胞核内Nrf2富集₂O₂单独治疗。Nrf2的敲除明显减弱了其缓解作用l .杆菌ZLP001对IPEC-J2细胞抗氧化应激的影响，提示Nrf2参与了抗氧化作用l .杆菌ZLP001。总的来说，这些结果表明l .杆菌ZLP001是一种有潜力的益生菌，可以潜在地缓解氧化应激。

1.介绍

氧化应激是由氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡引起的，与广泛的人类和动物疾病有关。氧化应激通常与活性氧(ROS)的积累有关，它可以诱导DNA羟基化、蛋白质变性和脂质过氧化[1从而损害细胞的生存能力，最终导致多种疾病[2]．由于肠道持续暴露于腔内环境，因此肠道更容易受到氧化应激的影响。肠道氧化应激影响营养物质的消化吸收，可引起多种肠道疾病[3.，4]．特别是在动物生命的关键阶段，如断奶，肠道发育不全，摄入量降低，会导致内源性抗氧化剂合成不足。因此，抗氧化剂补充策略已被考虑。膳食抗氧化剂，如维生素C和E，以及金属，如锌和铜，可以中和氧化分子，并在维持人类和动物体内氧化还原稳态方面发挥重要作用[5，6]．

益生菌已被证明具有抗氧化活性在体外和在活的有机体内［7- - - - - -9]．食品中存在的几种益生菌菌株及其产物具有显著的抗氧化活性，这些菌株在厌氧环境中具有较高的生存能力，具有较强的氧自由基清除能力，并产生多种抗氧化酶[10- - - - - -12]．不同菌株的抗氧化性能差异很大，这表明它们是菌株特异性的[7，13]．益生菌已被证明通过清除自由基、螯合金属离子、调节酶和调节肠道菌群来调节氧化还原状态，从而在多种宿主细胞和人体中发挥抗氧化活性[8，9]．此外，据报道，益生菌主要通过通过转录因子核红细胞2相关因子2（NRF2）的激活来诱导排毒酶[14，15]．包括Sirt1、MAPK和PKC在内的其他调控途径，可能触发Nrf2的解离或增强细胞内稳态，也参与了抗氧化作用的调控[9]．然而，关于益生菌抗氧化作用的潜在机制，如浓度效应、线粒体功能和Nrf2解离模式等问题仍未解决。

在我们以前的研究中，我们证明了这一点l .杆菌健康仔猪回肠黏膜ZLP001分离株[16]具有较强的抗氧化能力，在过氧化氢中具有较高的存活能力，具有较高的氧自由基清除能力在体外，减轻断奶仔猪氧化应激在活的有机体内［17]．然而，抗氧化能力l .杆菌ZLP001在氧化应激或其作用机制尚不清楚。因此，在本研究中，我们评估了l .杆菌ZLP001在一个在体外用过氧化氢处理猪肠上皮细胞(IPEC-J2)建立氧化应激模型₂O₂）.

2.材料和方法

2．1．菌株、细胞和培养条件

l .杆菌ZLP001最初由我们实验室从断奶4周的健康仔猪回肠黏膜中分离得到。该菌株经中国工业培养中心(北京)鉴定，保存在中国普通微生物培养中心(CGMCC No. 7370)。l .杆菌ZLP001细胞培养在改善德曼,Rogosa和夏普液体介质(10 g蛋白胨、酵母粉5克、20克葡萄糖,10 g牛肉膏,5 g醋酸钠,2 g柠檬酸铵磷酸,磷酸2 g钾、硫酸镁0.58克,0.19 g硫酸锰,1毫升的渐变- 80,和水1000毫升;pH值6.5)，在37°C厌氧条件下。

猪肠道上皮细胞系(ipc - j2)是Glenn Zhang博士(俄克拉荷马州立大学，Stillwater, OK)慷慨的礼物。ppec - j2细胞在DMEM/F12中培养，DMEM/F12是Dulbecco改良的Eagle培养基和Ham的F-12 (Gibco™，Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)以1:1的比例混合，并添加10%胎牛血清(FBS;Gibco™),链霉素(100μg/mL)、青霉素(100 U/mL)、1% ITS预混料(5μg / mL胰岛素,5μg/mL转铁蛋白，5 ng/mL硒;ScienCell，圣地亚哥，CA)在37°C, 5%的CO₂95%的空气，90%的湿度。

2.2。氧化应力模型建立

一个在体外通过用H处理IPEC-J2细胞来建立氧化应激模型₂O₂．采用甲基噻唑四唑(MTT)测定细胞活力。将IPEC-J2细胞接种于6孔组织培养板(Costar, Corning Inc.， Corning, NY, USA) 2 mL完全培养基培养过夜。H处理后₂O₂在0,250,500,750,1000,1250,1500和1750的最终浓度下 μmol/L孵育4 h，用5 mg/mL MTT工作液37℃孵育4 h。490 nm处的吸光度使用Multiskan FC仪器(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)测量。半数致死剂量(LD50)₂O₂的最佳浓度H₂O₂建立基于IPEC-J2细胞的氧化应激模型。

2．3.细胞治疗

将ppec - j2细胞接种于6孔组织培养板 细胞/。过夜培养后，用不含抗生素的培养基替换完整培养基，细胞孵育l .杆菌ZLP001 10点⁵， 10⁶， 10⁷， 10⁸,或10⁹CFU/孔持续2小时、3小时或4小时。用PBS洗去细菌后，将细胞置于含或不含H的完全培养基中培养₂O₂(最优H₂O₂从上述实验得到的浓度)4 h。MTT法测定细胞活力。

来评估它的抗氧化作用l .杆菌ZLP001在IPEC-J2细胞上的作用，设计了4个处理:对照，al .杆菌ZLP001处理(根据上述实验的最佳浓度和培养时间)，H₂O₂治疗，和一个l .杆菌ZLP001预处理+ H₂O₂治疗。过夜培养后，与IPEC-J2细胞孵育l .杆菌ZLP001在不含抗生素的完全培养基中培养3 h。然后用PBS冲洗细菌，将细胞置于含或不含H的完全培养基中培养₂O₂4 h。此外，在不含抗生素的完全培养基中培养IPEC-J2细胞3 h，然后用h₂O₂在上述条件下分别为氧化应激对照和未处理对照。

２.４.细胞形态观察

在100倍放大的光学显微镜(Olympus, Tokyo, Japan)下观察peec - j2细胞的形态学变化。使用cellSens Entry系统(Olympus)获取图像。

2．5．细胞凋亡和坏死的检测

采用凋亡和坏死检测试剂盒(C1056)检测处理后的IPEC-J2细胞的凋亡和坏死情况。处理后，按照厂家说明，用Hoechst 33342 (10 ng/mL)和碘化丙啶(PI, 10 ng/mL)在4°C黑暗中染色20分钟。倒置荧光显微镜(IX71, Olympus)观察凋亡细胞核的凝聚或碎裂。

使用膜蛋白V PE / 7-AAD测定试剂盒（CA1030）（CA1030）（Solarbio，中国），还通过流式细胞术检测凋亡细胞。在处理后立即收集细胞并重新悬浮在结合缓冲液中。将一百微升细胞悬浮液与5混合 μL Annexin V/PE，室温避光孵育5分钟。在加上10之后μL (20μg/mL 7-AAD和400μL的PBS，立即用流式细胞仪分析细胞(FACScaliburTM, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)。实验进行了三个重复。

2.6。评估细胞内ROS的生成

使用商业化的ROS检测试剂盒(S0033S) (Beyotime Biotechnology，中国海门)和绿色荧光探针DCFH-DA (2 ，7 -二乙酸二氯荧光素)。处理后去除培养基，活性氧指标DCFH-DA (10μM)加入新鲜无fbs培养基，37℃孵育30 min。荧光显微镜(IX71, Olympus)观察细胞并拍照。为了量化ROS的产生，使用荧光微板阅读器(Tecan, Männedorf，瑞士)在激发/发射波长为525/610 nm下测量荧光强度。ROS水平表示为处理细胞与对照细胞相比的百分比。实验进行了三个重复。

2.7。线粒体膜电位(MMP)测定

采用线粒体膜电位检测试剂盒(Beyotime Biotechnology，中国海门)，采用膜透染料JC-1检测细胞线粒体去极化。处理后，细胞在37°C的JC-1溶液中孵育15分钟。流式细胞术检测到JC-1在线粒体中的潜在依赖聚集(用红色荧光标记)以及在线粒体膜去极化后JC-1在细胞溶胶中的单体形式(用绿色荧光标记)。MMP由JC-1团聚体与单体的比例反映。实验进行了三个重复。

2.8。乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)的测定

治疗后，用PBS轻轻洗涤细胞并使用RIPA裂解缓冲液（含PMSF）（Solarbio，北京，中国）裂解10分钟。细胞离心，10,000× 在4℃下10分钟，收集上清液。使用双链烷酸（BCA）蛋白质测定法测定蛋白质浓度（BCA蛋白质测定套件; Pierce，Madison，Wi，USA）。然后，使用LDH测定试剂盒（A020-2）和MDA测定试剂盒（A003-2）（Jiancheng，China）测定LDH和MDA的水平。实验进行了三个重复。

2.9。谷胱甘肽和氧化谷胱甘肽(GSH和GSSG)浓度的测定

细胞标本采集、蛋白提取及浓度评定方法同上，LDH、MDA测定方法相同。随后，使用GSH检测试剂盒(A006-1-1)和GSSG检测试剂盒(A061-2-1)(中国南京建城)测定GSH和GSSG浓度。实验进行了三个重复。

2.10。T-AOC、T-SOD、CAT、GSH-Px活性测定

采用商品检测试剂盒(南京建城)测定总抗氧化能力(T-AOC, A015-1-2)、总超氧化物歧化酶(T-SOD, A001-1-2)、过氧化氢酶(CAT, A007-1-1)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px, A005-1-2)活性。处理后，裂解细胞，测定细胞蛋白浓度。然后根据厂家说明书确定T-SOD、CAT、GSH-Px活性，并以U/mg蛋白表达。实验进行了三个重复。

2.11。nrf2 -敲除IPEC-J2细胞的建立

猪Nrf2 siRNA 5 -GCCCAUUGAUCUCUCUGAUTT-3（意义）和5 -AUCAGAGAGAUCAAUGGGCTT-3(反义)由中国上海基因制药有限公司合成。将IPEC-J2细胞接种于6孔板( 细胞/well)，过夜培养，并根据制造商说明使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)转染sirna。

2.12。定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)

根据制造商的说明，使用RNAzol试剂(辛辛那提分子研究中心，OH, USA)从处理过的细胞中提取总RNA。使用NanoDrop分光光度计(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)测定RNA浓度。RNA (1μg)根据制造商的说明，使用iScript™cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)逆转录为cDNA。qpcr使用iTaqTM Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad)在QuantStudio 3 Real-Time PCR系统(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)中进行。本研究使用的猪特异性引物均为引物5.0设计或参考文献，序列列于补充表S1．目的基因表达归一化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH）;利用2^{- - - - - -ΔΔCt}方法(18]．

2.13。免疫印迹

处理后收集IPEC-J2细胞，提取总蛋白，测定蛋白浓度。等量的蛋白质(30μG）每泳道加载，蛋白质在110V下分离1小时，然后在4℃和90V下转移到PDVF膜60-100min。在用5％脱脂牛奶封闭后，将印迹与初级抗体在4℃下孵育过夜。三次用三缓冲盐水洗涤后，将印迹与HRP缀合的二抗孵育。根据制造商的说明，使用Western Blot亮度试剂（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）进行化学发光检测。本研究中使用的抗体列于补充表中S2．使用ChemiDoc XRS系统(Bio-Rad)成像免疫反应条带，并使用ImageJ(美国国立卫生研究院，Bethesda, MD)进行量化。

2.14。统计分析

所有结果表示为 ．数据分析使用Prism版本6 (GraphPad Software, Inc.， San Diego, CA, USA)进行。均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，然后采用邓肯方差分析事后在SPSS测试(版本20.0,SPSS公司，芝加哥，伊利诺伊州，美国)。两组的平均数使用未配对的学生双尾进行比较 -测试。 被认为是一个显著的差异。

3.结果

3．1.IPEC-J2细胞氧化应激模型的建立

本实验采用MTT法测定H₂O₂．如图所示1(一)H₂O₂剂量依赖性地降低了IPEC-J2细胞的活力。治疗4小时后用1000μM H₂O₂时，IPEC-J2的细胞活力降低为 ．因此，这个浓度是1000μM和4 h处理诱导氧化应激。

３．２．l .杆菌ZLP001减弱了由H引起的细胞损伤₂O₂

如图所示1 (b)，用10⁶或10⁷CFUl .杆菌H后，ZLP001提高了IPEC-J2细胞活力约70%-75%₂O₂侮辱,这表明l .杆菌ZLP001变弱H₂O₂全身的细胞损伤。低浓度和高浓度l .杆菌ZLP001疗效较差，10⁹CFUl .杆菌ZLP001直接降低了IPEC-J2的活力，对H₂O₂全身的伤害。预处理与l .杆菌ZLP001预处理3 h比预处理2 h或4 h更能有效地保护细胞活力。我们选择了10⁶CFUl .杆菌ZLP001浓度和3 h的预处理时间进行进一步研究。

光学显微镜观察不同处理后的细胞形态(图)1 (c)）.与正常细胞相比，H₂O₂-处理的IPEC-J2细胞体积增大，细胞膜结构疏松。预处理后l .杆菌ZLP001对细胞完整性的损害较小。

乳酸脱氢酶是一种可溶性胞质酶，当细胞膜受损时释放出来。来证实它的保护作用l .杆菌ZLP001对IPEC-J2细胞，H后LDH渗漏₂O₂测量治疗(图1 (d)）.虽然H₂O₂-处理的IPEC-J2细胞与未处理的细胞相比有显著的LDH释放l .杆菌ZLP001在培养上清液中强烈降低LDH泄漏。

3.３．l .杆菌ZLP001减轻H₂O₂-诱导IPEC-J2细胞凋亡和坏死

Hoechst 33342和PI染色结果显示H₂O₂显著刺激了IPEC-J2细胞的凋亡(亮蓝色)和坏死(亮红色)，表明H₂O₂全身的氧化损伤。l .杆菌ZLP001预处理显著改善H₂O₂诱导的细胞凋亡和坏死(图2（a））.流式细胞术结果证实了这些发现(图)2 (b)和2 (c)）.

western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和活性caspase-3的表达，进一步了解其抗凋亡作用l .杆菌ZLP001压力。抗凋亡因子Bcl-2表达增强l .杆菌ZLP001治疗后无明显增加₂O₂单独处理(数据2 (d)和2 (e)）.H后₂O₂治疗后，激活的caspase-3表达明显增加，而这种诱导被缓解l .杆菌ZLP001预处理。对Bax表达无明显影响。

3．4．l .杆菌ZLP001调节H细胞的氧化还原状态₂O₂对待IPEC-J2细胞

评估其调控效果l .杆菌ZLP001在H₂O₂-诱导的IPEC-J2细胞氧化还原状态，我们使用细胞可渗透的非荧光探针DCFH-DA测量细胞内ROS的产生(图)3(一个)和3 (b)）.不出所料，暴露于H₂O₂，表示H₂O₂导致IPEC-J2细胞内ROS爆发。然而，用l .杆菌ZLP001明显抑制H₂O₂在IPEC-J2细胞。

为了进一步研究氧化还原状态，测定了MMP(图)3 (c)和3 (d)），可能受到h的影响₂O₂全身的活性氧释放。H后₂O₂单独处理后，IPEC-J2细胞中j -聚集物与j -单体的比值明显降低。后l .杆菌ZLP001预处理后，该比值增加，显示出积极的作用l .杆菌ZLP001在IPEC-J2细胞中的氧化还原状态。

接下来，我们检测GSSG和GSH，这是细胞氧化还原状态的重要指标(图)3 (e)）.H后₂O₂治疗后，细胞内GSSG水平显著升高，而GSH水平显著降低( ）.然而,预处理l .杆菌ZLP001有抑制H₂O₂有关两个GSSG ( ）与谷胱甘肽( ）.GSSG和GSH水平l .杆菌zlp001处理的细胞与对照组细胞相似( ）.

MDA是ros诱导的脂质过氧化的主要产物。作为氧化应激的一个很好的指标，我们还测量了处理过的IPEC-J2细胞中的MDA水平。如图所示3 (f)， H₂O₂-处理的ppec - j2细胞较对照细胞明显增加，表明脂质过氧化的发生。l .杆菌ZLP001预处理可显著抑制ppec - j2细胞脂质过氧化，表现为MDA水平降低。

3.5。l .杆菌ZLP001上调抗氧化防御系统在H₂O₂对待IPEC-J2细胞

的影响l .杆菌ZLP001对细胞抗氧化防御系统的作用被进一步研究l .杆菌ZLP001缓解细胞氧化应激。T-AOC在l .杆菌与正常对照组相比，zlp001处理的细胞数量增加(图)4(一)）.而预处理l .杆菌ZLP001能显著减弱H₂O₂．

如图所示4 (b),HO-1，GSTA1,TRXR1细胞对H反应的mRNA表达显著升高₂O₂,而猫表达量显著减少，表明细胞激活了抗氧化机制，以保护自己免受氧化应激。相比之下,H₂O₂单独处理,l .杆菌ZLP001预处理明显抑制HO-1和TRXR1mRNA表达量增加SOD1和猫表达式。l .杆菌ZLP001单独处理可显著提高SOD1和GPX2，而与对照细胞相比，其他抗氧化酶无显著影响。

我们进一步确定了使用商业测定套件的T-SOD，CAT和GSH-PX的活动（图4 (c)- - - - - -4 (e)）.根据基因表达结果，这些酶活性处理或预处理l .杆菌ZLP001与对照和H₂O₂单独治疗。后l .杆菌ZLP001预处理后，H₂O₂被减轻了。这些结果表明l .杆菌ZLP001增强内源性抗氧化分子。总的来说，抗氧化作用l .杆菌ZLP001可以归因于抗氧化防御系统的激活。

3.6。l .杆菌ZLP001激活ppec - j2细胞的Nrf2信号通路

进一步探讨的行动模式l .杆菌ZLP001检测了Nrf2在不同浓度的ppec - j2细胞中的表达l .杆菌ZLP001(图5(一个)和5 (b)）.免疫印迹结果表明l .杆菌ZLP001剂量依赖性地降低了胞质Nrf2，促进了核内Nrf2的积累，尤其是在10⁷CFU，提示Nrf2发生核易位。细胞内Keap1积累增强l .杆菌ZLP001治疗，特别是在10⁶和10⁷CFU。

接下来，我们评估了H后Nrf2的易位₂O₂处理和预处理l .杆菌ZLP001。如图所示5 (c)和5 (d)H₂O₂单独处理对Nrf2从细胞质向细胞核的转位有显著影响。然而，经过预处理处理后l .杆菌ZLP001细胞液中Nrf2的含量进一步下降，而细胞核中Nrf2的积累量与H₂O₂单独治疗。胞质中Keap1含量呈数值增加趋势l .杆菌ZLP001单独治疗，H₂O₂单独治疗和前处理l .杆菌ZLP001。

3.7。NRF2 siRNA废除了抗氧化效果l .杆菌ZLP001

进一步阐明Nrf2在减轻氧化应激中的作用l .杆菌ZLP001，我们评估了ppec - j2细胞中Nrf2敲低后的细胞活力和ROS的产生。与阴性对照siRNA转染的细胞和未转染的对照组细胞相比，Nrf2 siRNA处理的细胞在基因和蛋白水平上有效地显示出更低的Nrf2水平(图)6(一)和6 (b)）.Nrf2 sirna转染的IPEC-J2细胞在H₂O₂(图6 (c)）.抗氧化剂保护作用l .杆菌ZLP001也被Nrf2 siRNA阻断，与阴性对照siRNA转染的细胞相比，细胞活力降低。此外，Nrf2的敲除削弱了其作用l .杆菌ZLP001在防止ROS响应H时生成₂O₂挑战(图6 (d)）.这些结果表明，Nrf2 siRNA破坏了植物的抗氧化作用l .杆菌这表明Nrf2通路参与了这一作用。

4.讨论

肠道菌群在应激或病理条件下的不平衡会导致病原菌的生长，病原菌会产生氧气来产生有氧环境，从而使肠道处于氧化应激状态[19，20.]．肠道氧化应激损伤上皮屏障，影响营养物质的消化吸收，可导致多种疾病[3.，21，22]．因此，肠道氧化还原稳态对维持宿主健康至关重要。虽然一些益生菌具有抗氧化能力，但其潜在机制尚不完全清楚。在这项研究中，我们旨在阐明抗氧化能力l .杆菌ZLP001在氧化应激中的作用及其可能的机制。

H₂O₂是一种强氧化剂，能够氧化多种组分，这就是为什么它通常被用来建立氧化应激模型，研究各种细胞类型的氧化还原调控过程[23- - - - - -25]．在本研究中，MTT测定和LD50结果表明，1000μM H₂O₂处理4 h足以诱导ppec -2细胞氧化应激。预处理与l .杆菌ZLP001 (10⁶CFU, 3 h)显著缓解h₂O₂,这表明l .杆菌ZLP001具有抗氧化能力，保护细胞完整性。先前的研究表明，上皮屏障损伤与氧化应激有关[22，26]．我们之前的研究表明l .杆菌ZLP001对肠道屏障功能有积极作用[27];因此，我们推测其强化作用l .杆菌肠屏障上的ZLP001可以部分地与其抗氧化能力相关。我们使用形态分析来观察核凝结和DNA碎片，这是细胞凋亡的标志[28，29]．细胞凋亡通常是在细胞受到氧化应激时引起的[30.，31]．H₂O₂与对照细胞相比，-处理后的ppec - j2细胞凋亡明显，Hoechst染色显示凋亡细胞核出现。预处理与l .杆菌ZLP001明显降低H₂O₂全身IPEC-J2细胞。流式细胞术结果证实了这些发现。益生菌此前已被证明具有抗凋亡作用，从而改善屏障功能[32，表明它们确实可以提高细胞的生存能力。此外,治疗l .杆菌ZLP001增强了Bcl-2的表达，而预处理抑制了H₂O₂，证实了其潜在的抗凋亡作用l .杆菌ZLP001。[14使用益生菌菌株芽孢杆菌amyloliquefaciensSC06，但仅检测凋亡相关基因表达并显示图像结果。综上所述，我们的结果表明l .杆菌ZLP001具有在氧化应激下保持肠道完整性和屏障功能的潜力。

来证实它的抗氧化作用l .杆菌在ZLP001中，我们测定了ROS的产生，MDA的水平和MMP。ROS主要是为细胞生长和增殖而产生的，在生理条件下具有调节作用[33- - - - - -35]．正常情况下，细胞内ROS水平维持在可维持水平。然而，当ROS水平超过细胞内源性清除能力时，ROS过量产生，会导致细胞内大分子的氧化损伤，从而引发一系列氧化应激反应[36]．H₂O₂DCFH-DA染色显示，诱导peec - j2细胞内ROS爆发。预处理与l .杆菌ZLP001显著降低H₂O₂．GSH转化为GSSG证实了这一点l .杆菌ZLP001可以缓解由H引起的氧化应激₂O₂．GSH积极参与清除ROS，但氧化后GSH转化为GSSG导致蛋白谷胱甘肽化[37]．在本研究中，脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的水平表现出与ROS水平相似的趋势。H₂O₂治疗刺激丙二醛分泌，而l .杆菌ZLP001预处理可抑制H₂O₂．作为大多数细胞类型中细胞内氧化剂产生的最大贡献者，线粒体是主要氧化过程的场所[38并在氧化应激诱导的细胞死亡中起关键作用[39]．我们测量MMP来评估线粒体氧化还原状态。H₂O₂降低了MMP，然而l .杆菌ZLP001预处理增强了MMP。MMP降低所显示的线粒体功能障碍被认为是早期凋亡的一个特征[40]．H后MMP降低₂O₂本研究结果提示，诱导ppec - j2细胞凋亡。预处理与l .杆菌ZLP001增强MMP，显著抑制IPEC-J2细胞凋亡。因此,l .杆菌ZLP001能有效调节IPEC-J2细胞中的抗氧化状态。我们研究的局限在于对该菌株的活性分子研究不够深入。研究表明，益生菌菌株产生的抗氧化分子，如胞外多糖和阿鲁酸，可能是益生菌发挥其抗氧化活性的关键因素[41，42]．进一步的分离、纯化和结构阐明也可能需要评价的主要活性成分l .杆菌ZLP001。

增强宿主抗氧化防御系统，清除体内ROS，从而减轻氧化应激。益生菌的保护作用包括非酶和酶的氧化还原机制[43]．为进一步研究其抗氧化机制l .杆菌ZLP001，我们评估了ppec -2裂解物中T-AOC和一些抗氧化相关酶的mRNA表达和活性。T-AOC通常反映了非酶抗氧化防御系统的能力[44，常被用作研究氧化状态的生物标志物[45]．预处理后T-AOC升高l .杆菌ZLP001证明l .杆菌ZLP001至少部分通过非酶抗氧化防御系统抑制氧化应激。HO-1是一种II期酶，受各种刺激的转录调控[46]．HO-1对H极其敏感₂O₂并可作为筛选抗氧化剂的敏感靶点[14]．在本研究中，我们观察到HO-1H基因表达₂O₂，被压制了l .杆菌ZLP001预处理。抗氧化酶，如SOD和CAT，可以将ROS解毒为安全分子，从而保护细胞免受ROS的损伤[47，48]．增加表达SOD1后l .杆菌ZLP001单独治疗和增加猫表达后l .杆菌ZLP001预处理与H₂O₂本研究观察治疗情况。因此，我们也检测了其他一些抗氧化剂相关基因的表达水平。l .杆菌ZLP001单独治疗增加GPX2表达提高抗氧化能力。在中也得到了类似的结果Labeo rohita喂食益生菌及共生食物[49]．的增加GSTA1H后表达₂O₂暴露可能提示一种自我保护反应，以减轻H₂O₂毒性(50]．H₂O₂治疗,l .杆菌ZLP001预处理降低TRXR1表达，这与几项研究的结果一致芽孢杆菌菌株的研究(14]．

确认l .杆菌ZLP001增强了ppec - j2细胞的抗氧化系统，我们测定了ppec - j2细胞裂解物的抗氧化酶活性。根据基因表达结果，l .杆菌ZLP001提高了T-SOD活性l .杆菌ZLP001预处理缓解了H₂O₂．益生菌菌株对宿主抗氧化酶的调节作用已被广泛验证在体外(在各种细胞模型中)和在活的有机体内(在血清和不同组织中)[43，50- - - - - -52]．我们的发现表明l .杆菌ZLP001能显著改善ppec - j2细胞的抗氧化状态，通过促进细胞抗氧化防御系统对抗产生ROS的物种，从而提高细胞对H₂O₂挑战。

Nrf2/ keap1 -抗氧化反应元件(ARE)轴的激活增加了抗氧化反应元件的转录，从而保护细胞和组织免受ROS损伤[53- - - - - -55]．改变的第二期基因表达和抗氧化酶活性意味着l .杆菌ZLP001可能影响Nrf2/Keap1通路。因此，我们研究了Nrf2/Keap1-ARE通路是否参与了抗氧化功能l .杆菌ZLP001。Nrf2/Keap1通路相关蛋白在ppec - j2细胞中表达增强l .杆菌ZLP001，尽管差异仅在10⁷CFU。先前的研究也表明，与对照组和单独使用益生菌治疗相比，高脂饲料喂养的小鼠中使用益生菌可以诱导Nrf2表达在体外能诱导ppec -1细胞Nrf2磷酸化[14，56]．然而，由于不同的益生菌菌株诱导不同水平的Nrf2表达[57]，我们计划进行多个菌株的比较研究，并调查其他可能的途径。Nrf2通常在细胞暴露于氧化剂和亲电试剂时被激活，从而保护细胞免受氧化应激[54]．H₂O₂在本研究中，应激增加了Nrf2磷酸化，这与Wang等人的观点一致[14]．预处理后l .杆菌在ZLP001中，我们观察到Nrf2在胞质中解离增强，但与H相比，它没有在细胞核中积累₂O₂单独治疗。小林和山本[58报告说，激活的第二阶段防御系统使细胞对随后更大的挑战更具抵抗力。因此，有可能l .杆菌ZLP001可能在我们检测时间点之前激活了Nrf2，这使得IPEC-J2细胞对H₂O₂而不需要Nrf2的持续积累。我们进一步评估了ppec - j2细胞在Nrf2敲低后的细胞活力、ROS产生和抗氧化酶mRNA表达水平。的保护作用l .杆菌ZLP001在H₂O₂-诱导的ppec - j2细胞损伤在Nrf2缺失的情况下被消除。这些结果证实了Nrf2-ARE信号通路参与了其保护作用l .杆菌通过调控抗氧化酶的表达和活性，增强对H₂O₂-诱导的氧化应激在IPEC-J2细胞。类似地，先前在不同细胞和宿主中的研究报告称，益生菌菌株通过上调Nrf2表达，增加抗氧化和细胞保护基因的表达来减轻氧化应激[14，15，59]．然而，Nrf2被激活l .杆菌ZLP001没有我们预期的那么显著，与抗氧化活性不一致。正如我们提到的，其他信号通路也可能参与抗氧化调节l .杆菌ZLP001。益生菌可通过激活SIRT1信号减弱肝脏氧化应激[60改善;改进₂O₂-通过PKC和mapk依赖机制诱导上皮屏障的破坏[61]．这些途径是否有助于抗氧化活性l .杆菌ZLP001是未知的。因此，需要更有力、更深入的研究来揭示其确切的抗氧化机制l .杆菌ZLP001。

5.结论

我们证明了l .杆菌ZLP001能缓解H₂O₂在猪上皮细胞中。预处理与l .杆菌ZLP001缓解H₂O₂通过调节细胞氧化还原状态和增强抗氧化防御系统，Nrf2/Keap1-ARE信号参与其保护机制(图)7）.我们的研究结果提高了我们对其潜在机制的理解l .杆菌ZLP001具有抗氧化应激作用，可发展为抗氧化应激动物的治疗性或保护性治疗。然而，Nrf2信号是否如我们推测的那样在更早的时间点被激活，以及是哪种信号触发了Nrf2与其组成抑制剂Keap1的分离，还是其他可能的途径有助于其抗氧化，仍有待进一步研究。

数据可用性

本研究期间产生的数据可由相应作者要求提供。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

JW构思了研究并起草了手稿。JW, WZ和XCH进行了实验。WZ分析了数据。SW和YW对形式分析做出了贡献。JW和HJ编辑了手稿。JW和WZ对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

感谢日齐博士的建议和冯涛博士的大力支持。本研究由北京市自然科学基金项目(批准号:6202004)、国家自然科学基金项目(批准号:31972576)和BAAFS科技创新能力建设专项(批准号:KJCX201914)资助。

补充材料

补充表S1:本研究引物序列。补充表S2:本研究使用的抗体。（补充材料）

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