益生菌被广泛用于保护压力诱导肠道功能障碍。氧化应激在胃肠道功能紊乱扮演着关键的角色。它是证实益生菌减轻氧化应激;然而,行动的机制尚未阐明。我们开发了一个
氧化应激是由一个失衡prooxidants和抗氧化剂,涉及广泛的人类和动物疾病。氧化应激是常与活性氧(ROS)的积累,可以诱导DNA羟基化,蛋白质变性,脂质过氧化作用[ 益生菌已被证明具有抗氧化活性 在先前的研究中,我们证明了
猪肠道上皮细胞系(IPEC-J2)是一个慷慨的礼物从格伦博士张(俄克拉荷马州立大学静吧)。IPEC-J2细胞在DMEM / F12培养,1:1的混合物杜尔贝科的修改鹰的媒介和火腿的F-12 (Gibco™,热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)补充10%胎牛血清(的边后卫;Gibco™),链霉素(100
一个
IPEC-J2细胞被播种在6-well组织培养板 估计的抗氧化效果
形态变化IPEC-J2光学显微镜下观察细胞治疗后(奥林巴斯、东京、日本)的放大100倍。图像获得使用cellSens条目系统(奥林巴斯)。
细胞凋亡和坏死治疗IPEC-J2细胞被发现使用细胞凋亡和坏死分析工具包(C1056) (Beyotime生物技术、海门、中国)。治疗后,这些细胞被沾染了赫斯特33342 (10 ng / mL)和propidium碘(π,10 ng / mL)在4°C在黑暗中20分钟,根据制造商的指示。凋亡细胞的核浓缩或支离破碎的可视化和拍照在倒置荧光显微镜下观察(IX71,奥林巴斯)。 也检测到凋亡细胞流式细胞仪使用膜联蛋白V PE / 7-AAD分析工具包(CA1030) (Solarbio,北京)。后立即治疗,细胞收集和resuspended绑定缓冲。一百毫升细胞悬液混合5
细胞内活性氧积累测量使用商业ROS检测设备(S0033S) (Beyotime生物技术、海门、中国)绿色荧光探针DCFH-DA (2
线粒体膜电位测定工具包(Beyotime生物技术、海门、中国)membrane-permeable染料,JC-1,用于检测细胞中的线粒体去极化。治疗后,这些细胞被孵化在JC-1解决方案在37°C,持续15分钟。JC-1 potential-dependent聚合的线粒体(用红色荧光标记)和单体的形式的JC-1的胞质后线粒体膜去极化(用绿色荧光标记)使用流式细胞仪检测。的MMP反映JC-1总量的比例和单体。实验进行了一式三份。
治疗后,这些细胞被轻轻洗两次与PBS和细胞溶解使用里帕裂解缓冲(包含PMSF) (Solarbio,北京)10分钟。这些细胞被离心机和10000×
细胞样本收集和蛋白提取和集中评价是同上LDH和MDA的决心。此后,谷胱甘肽的浓度和GSSG决心使用谷胱甘肽试验设备(A006-1-1)和GSSG化验设备(A061-2-1)(南京建成,中国)。实验进行了一式三份。
总抗氧化能力(T-AOC A015-1-2)和总超氧化物歧化酶的活动(T-SOD A001-1-2)、过氧化氢酶(CAT, A007-1-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶,A005-1-2)测定使用商业测定试剂盒(南京建成,中国)。治疗后,细胞细胞溶解,细胞蛋白质浓度测定。然后,T-SOD、猫和氧化酶活动是根据制造商的指示和决定表示为U /毫克的蛋白质。实验进行了一式三份。
猪Nrf2 siRNA 5
从治疗细胞总RNA提取使用RNAzol试剂(分子研究中心,辛辛那提,哦,美国)根据制造商的指示。RNA浓度测定使用NanoDrop分光光度计(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。RNA (1
IPEC-J2收集细胞的治疗后,和总蛋白提取和蛋白质浓度测定如上描述。等量的蛋白质(30
所有的结果都表示为
建立在猪IPEC-J2细胞氧化应激模型,我们使用MTT法测定细胞的可行性IPEC-J2治疗后与H
如图 不同治疗后细胞形态由光学显微镜(图检查 LDH释放可溶性胞质酶,当细胞膜受损。确认的保护作用
赫斯特33342年和PI染色结果表明,H
凋亡蛋白的表达,bcl - 2,伯灵顿,和活跃caspase-3评价免疫印迹,进一步理解的凋亡效应
评估的监管效果
为了进一步研究氧化还原状态,MMP的决心(数字 接下来,我们发现GSSG谷胱甘肽,作为细胞氧化还原状态的重要指标(图 MDA的主要产品是ROS-induced脂质过氧化作用。作为一个优秀的氧化应激的指标,我们也测量了MDA水平IPEC-J2细胞治疗。如图
的影响 的影响 如图 我们进一步确定的活动T-SOD,猫,并使用商业分析工具(数字氧化酶
进一步探索的行动方式 的影响 接下来,我们评估后Nrf2 H的易位
进一步澄清Nrf2在减轻氧化应激的作用 的影响
肠道菌群的失衡压力或病理条件下会导致病原体的生长,这可能产生氧气生成一个有氧环境,因此呈现肠道处于氧化应激状态( H 确认的抗氧化效果 增强宿主抗氧化防御系统会导致体内活性氧清除,从而减轻氧化应激。益生菌的保护作用包括酶和非酶的氧化还原机制( 确认