文摘
神经保护是一个可取的过程在许多神经系统疾病,然而复杂的机制在这个领域并不完全理解。毛果芸香碱癫痫模型引起的,seizure-induced会引起细胞线粒体功能损伤和死亡。本研究旨在调查UCP2的角色,ROS负监管机构后的神经保护胆碱能侮辱。我们的数据表明,UCP2表达增强大鼠海马3天后癫痫持续状态(SE),第五天达到峰值,然后返回到基底的水平。与此同时,phospho-AKT表达水平高海马体在沉默的早期阶段(5天后SE)。此外,它证明了UCP2的封锁了反义寡核苷酸(麻生太郎)SE老鼠成功UCP2 mRNA和蛋白含量下降。SE麻生太郎老鼠提出增加线粒体proapoptotic因子表达式,caspase-3活动,炎症细胞因子表达,和活性氧的形成。此外,麻生太郎治疗减少p-AKT表达和抗氧化酶活动后毛果芸香碱的侮辱。总之,目前的结果突出UCP2的神经保护行动,行动的凋亡抑制因子和氧化应激,提高神经元生存SE后发病。
1。介绍
线粒体是能源生产细胞器广泛参与细胞内稳态的维护和被描述为一个潜在的站点的错综复杂的事件,导致病理障碍和细胞死亡。解偶联蛋白(规定)anion-carrier蛋白质中发现线粒体的内膜和参与跨膜质子梯度递减1]。这个活动降低了ROS的驱动生产,从而减少细胞死亡(2,3]。到目前为止,五个跟单信用证亚型与UCP1描述基于序列同源性和其独特的功能4]。
UCP2是这个家庭中的一员,广泛表达于神经元和免疫细胞(5- - - - - -7]。增加了UCP2表达在免疫和多发地细胞在病理状态如动脉粥样硬化(8],I型糖尿病[9)、感染(10),脑缺血(11实验性自身免疫性脑脊髓炎,)(实验性自身免疫性脑脊髓炎(12]。一些病理生理条件下可能产生刺激,会导致UCP2的表达增加,导致神经保护的过程。UCP2减轻活性氧(ROS)生产,因此这些细胞氧化应激损伤的保护(2,5,13]。UCP2已经涉及到细胞内钙调节ATP生产、突触传递、神经可塑性,和细胞凋亡5,6,14,15]。
炎症信号激活是一个重要的机制导致增强活性氧的生产,因此,增量在几个细胞类型的细胞死亡,包括神经元(16- - - - - -18]。在实验性癫痫,产生癫痫发作的侮辱,一个强有力的炎症状态,可以观察到明显的神经元死亡19- - - - - -21]。UCP2在许多炎症被认为是一个重要的神经元素和中枢神经系统的退化状态22),尤其是对其减少活性氧的能力(12]。
十多年了,我们的团队一直致力于研究炎症在癫痫的病理生理学的作用,这是由白细胞介素的发现和血管活性肽作用系统(kallikrein-kinin和肾素-血管紧张素)组件有不同的行动保护在中间的颞叶癫痫发作或恶化(MTLE)患者和实验动物模型(23- - - - - -26]。毛果芸香碱在大鼠的急性的高剂量是一个实验模型,揭示了改变人类框架相媲美(审查,请参阅[27])。除此之外pilocarpine-induced神经毒素发作的机制建立,这是目前假设会造成癫痫持续状态(SE)毛果芸香碱引起的神经病变导致病理性增加以应对过多的活性氧产量(23,24,26]。
据我们所知,很少有研究显示在癫痫发作和UCP2表达之间的关系或其含义在激活细胞凋亡28- - - - - -31日]。在目前的研究中,我们测试了UCP2的假设可以作为一个内生epilepsy-induced损伤防护因子,使用反义寡核苷酸(麻生太郎)管理,在模型实验毛果芸香碱。
2。方法
2.1。实验小组
我们用三十雄性Wistar鼠(200 - 250 g),被实验随机分为3组。实验协议通过动物实验的伦理委员会大学诺德Julho (0034/2012)。老鼠与腹腔内(ip)戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤),然后在接受单剂量毛果芸香碱(350毫克/公斤,ip)。防止外围胆碱能影响,硝酸甲基东莨菪碱的剂量皮下注射1毫克/公斤,30分钟前匹鲁卡品管理。一群动物( )被杀5 h后癫痫持续状态开始(5 h,急性组)。另一组( )在控制发作期间被杀(SE发病后5天,沉默的集团),最后一集( )被杀后60天SE感应(自发的反复发作,慢性组)。Saline-treated动物( )被杀5 h, 5天或后60天盐水注射硝酸和甲基东莨菪碱和被用作控制(对照组)。癫痫发作观察和评分使用拉辛规模[32]4 h,然后老鼠收到4毫克/公斤的安定终止。验证UCP2表达在时间进程协议通过毛果芸香碱的三阶段模型,我们使用25纯种雄性老鼠的麻醉和随机死亡1,5日和24小时,3,5,7,45,90天后匹鲁卡品管理。
所有调查之后大学指南的使用动物实验研究,和所有正在努力减少痛苦,符合指导实验室动物保健和使用的由美国国立卫生研究院(NIH出版物编号为85 - 23,1996年修订)。动物被保存在一个12:12 h人造光:黑暗周期与啮齿动物随意提供食物和水。所有样品都是用于执行信使rna,蛋白质,或量化ROS-related化合物。
2.2。免疫组织化学
SE老鼠(5小时(5小时),5天(5 d), 60天(60 d),和他们的“控制”)与致命剂量的戊巴比妥钠麻醉并受transcardiac灌注1%多聚甲醛溶液(pH值7.4,15毫升/老鼠,输液速度15毫升/分钟)其次是4%多聚甲醛溶液(pH值7.4,150 mL /老鼠,输液速度15毫升/分钟)。灌注后,大脑被小心地脱离头骨,48小时4%多聚甲醛固定,沉浸在蔗糖溶液30% cryoprotection 48小时。Forty-micrometer-thick冠状切片获得使用低温恒温器(HM 505 e Micromeria蔡司)并存储在0.1磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)。整个海马片收集并存储在0.1磷酸盐缓冲剂。片被安装在gelatin-coated幻灯片与p-AKT抗体免疫组织化学(圣克鲁斯,1:200)。简而言之,自由漂浮片1%过氧化氢处理10分钟,用磷酸盐(PBS) (pH值7.4),然后接受Triton x - 100为0.4%,30分钟。片是用PBS, preincubated白蛋白10% 2小时,和孵化主要抗体在一夜之间在4°C。片洗净,然后用适当的二次抗体在室温下孵化(1:200年,生物素化的免疫球蛋白G, Calbiochem) 2小时。部分被清洗和孵化avidin-biotin-peroxidase复杂(ABC工具包,向量)90分钟,然后洗Tris-HCl (pH值7.6),最后开发diaminobenzidine (DAB)(1片/ 15毫升Tris-HCl)。接下来,洗在PBS切片和安装在组织学幻灯片。 Analysis and documentation of results were performed using a Leica FW 4500 B microscope (Wetzlar, Germany). The degree of staining was provisionally graded by the following criteria: 1+, low staining; 2+, moderate staining; and 3+, intense staining detected by light microscopy ×100 augmentation (10x objective).
2.3。定量mRNA表达
解冻海马均质在1毫升的试剂盒试剂(Gibco BRL,马里兰州)和总RNA分离根据制造商的指示。一微克的总RNA用于互补脱氧核糖核酸合成和实时PCR基因表达分析。首先,DNase我(表达载体)治疗1单位/浓度μg RNA在20毫米Tris-HCl面前,pH值8.4,包含MgCl 2毫米2为15分钟37°C,其次是孵化在95°C 5分钟进行去除DNA污染。逆转录(RT)进行了20μL反应在50 mM Tris-HCl MgCl pH值8.3,3毫米2二硫苏糖醇,10毫米,0.5毫米核苷酸,50 ng随机引物200单位Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶(表达载体)。这个反应进行如下:20°C 10分钟,45分钟42°C, 95°C的5分钟。互补脱氧核糖核酸在这一点上放大了7500序列实时PCR检测系统(ABI棱镜,应用生物系统公司,促进城市,CA)使用SYBR绿色核心反应工具包(应用生物系统公司)。聚合酶是热激活10分钟在95°C, 95°C, 15秒的周期,1分钟60°C放大成绩单,在每个周期和数据收集。为每个数据点实验进行了一式三份。目标基因mRNA表达被量化为相对价值与一个内部参考,GAPDH的表达式是不信之间的改变不同的实验条件。老鼠引物用于mRNA量化UCP2(基因库加入NM_019354.2) 5-CCACAGCCACCGTGAAGTT-3和反向5-CGGACTTTGGCGGTGTCTA-3 ;加入Bcl2-associated死子(伯灵顿)(基因库NM_017059.2) 5-ACTCCCCCCGAGAGGTCTT-3和反向5-AGTTGAAGTTGCCATCAGCAAA-3 ;bcl - 2(加入基因库NM_016993.1) 5-GCTACGAGTGGGATACTGG-3和反向5-GTGTGCAGATGCCGGTTCA-3 ;肿瘤坏死因子-α(加入基因库X66539) 5-AAATGGGCTCCCTCTATCAGTTC-3和反向5-TCTGCTTGGTGGTTTGCTACGAC-3 ;interleukin-1b(加入基因库M98820), 5-CACCTCTCAAGCAGAGCACAG-3和反向5-GGGTTCCATGGTGAAGTCAAC-3 ;和白细胞介素- 6(基因库加入E02522) 5-TCCTACCCCAACTTCCAATGCTC-3和反向5-TTGGATGGTCTTGGTCCTTAGCC-3 。5提出了GAPDH引物-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3和反向5-GCCCCACGGCCATCA-3(加入基因库NM_017008数量)。第二条看家基因(18 s rRNA,加入基因库Rn18s)是用于验证结果。1微升的RT反应用于实时PCR。目标量化值和GAPDH基因mRNA转录得到的阈值周期数,在强化信号与一个指数级增长的PCR产品开始被探测到。融化曲线生成的每个运行确认产品一致性。相对目标基因表达水平是基于GAPDH规范化表达作为一种内源性RNA控制。∆Ct测定值减去平均水平Ct从平均价值目标基因的信使rnaCt价值的内部控制(GAPDH)。2−∆∆Ct参数被用来表达相对表达数据。
2.4。UCP2沉默
反义寡核苷酸(麻生太郎)协议进行使用24纯种男性cannula-implanted老鼠。简单地说,老鼠麻醉与腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪(35毫克/千克和5毫克/公斤,职责。),刮,放置在一个立体定位框架。然后Ocry-gel动物眼睛的保护和水化。头皮切口进行中线,头骨被曝光和清洁血液和骨膜。随后,插管(表23)植入单方面在海马体的坐标Paxinos et al。(记者:前囱背后的3.5毫米,侧:3.1毫米,和垂直:4.5毫米从大脑皮层33]。两个螺丝定位在头骨,每个套管与牙科水泥粘贴到位倒外套管和螺丝。不锈钢条扩展超越的顶端插入套管,到接种。所有老鼠收到~ 5毫升的0.9%通过ip注入生理盐水来补充和帮助康复手术。老鼠被允许手术后的恢复7天之前任何额外的实验程序。毛果芸香碱管理如前所述执行( )。五个动物收到毛果芸香碱没有进入。一个接受癫痫持续状态(SE 5 d组)与7组老鼠,老鼠和其他10 SE受到麻生太郎政府(SE麻生太郎5 d组)。寡核苷酸的设计根据UCP2在NIH-NCBI沉积序列(011671海里)。反义oligodeoxynucleotides序列(麻生太郎)(美国卡尔斯巴德英杰公司)如下:5tgc ATT GCA手枪CTC a - 3和反义5tga手枪CTG CAA TGC a - 3 。这些寡核苷酸抑制UCP2表达的有效性已被以前所示(7,34]。反义寡核苷酸溶解在人工脑脊液(aCSF)前管理。显微镜下注射(500 pmol),体积100问,为两国海马CA3子域进行每日开始前一天直到5天post-SE匹鲁卡品管理。老鼠接受双边显微镜下注射等量的aCSF ( ,7 pilocarpine-treated和6控制老鼠)担任车辆控制。动物被杀第一个《超能显微镜下注射后6天。与感应没有差异产生的寡核苷酸治疗UCP2的表达与控制(数据未显示)。
2.5。酶联免疫吸附试验(ELISA)
UCP2、活跃caspase-3 phospho-AKT, il - 1β鼠海马的,il - 6浓度控制,SE, SE麻生太郎被ELISA量化。组织切除,立即冻结在−80°C。蛋白质提取,组织用冰在组织提取试剂含有蛋白酶抑制剂(表达载体)鸡尾酒(罗氏,印第安纳波利斯)。离心后12000在4°C 20分钟,上层清液的化验解偶联蛋白2 (UCP2)(大鼠线粒体解偶联蛋白2酶联免疫试剂盒,Cusabio®,武汉,中国),caspase-3活动(caspase-3 / CPP32比色测定装备,Biovision,苗必达,CA), phospho-AKT (AKT-pS473酶联免疫试剂盒,Abcam,剑桥,英国),il - 1β和il - 6(鼠il - 1β或鼠il - 6 Quantikine;研发系统,阿宾顿、英国)。
2.6。测定氧化压力参数
海马体匀浆内氧化应激参数评估控制,SE-treated, SE麻生太郎老鼠。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用比色商业工具(开曼化工有限公司安阿伯市,美国)基于NADH氧化、抑制超氧化物自由基的生成的黄嘌呤氧化酶、次黄嘌呤和使用四唑盐检测到450海里。具体的活动表示为单位每毫克的蛋白质。过氧化氢酶(CAT)活性测定spectrophotometrically由商业工具(美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich),基于测量H的分解2O2。一只猫单位被定义为1摩尔每分钟消耗的过氧化氢,和特定的活动报道单位每毫克的蛋白质。组织MDA含量测定spectrophotometrically所描述的(35),使用商业套装(美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich)基于与硫代巴比土酸丙二醛(MDA)的反应(稍后通知),产生一个比色产品。MDA积累是指示性的细胞膜脂质过氧化的程度,并表示为nmol /毫克的蛋白质。蛋白质羰基含量的定量测定,我们使用一个商业工具(美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich)基于蛋白质羰基化合物的衍生化,导致形成稳定的dinitrophenyl (DNP)腙加合物。羰基含量计算基于DNPH的摩尔消光系数和nmol /毫克蛋白表达的结果。
2.7。统计分析
数据分析与GraphPad棱镜软件6.0 (La Jolla、钙、美国)。Shapiro-Wilk和列文正常测试是用来验证和误差方差,分别。双向方差分析(方差分析)补充图基的测试是用来检测三组之间的差异在样本正态分布。除非另有指示,生化和分子生物学实验进行了一式三份。一个值≤0.05被认为是显著的。值表示为意味着±均值的标准误差(SEM)。
3所示。结果
我们假设UCP2 neuroprotector可能抵消神经损伤引起的SE毛果芸香碱诱导的实验性癫痫模型。SE大鼠海马的分析,我们发现改变UCP2的表达mRNA在急性期(0.80±0.22)相对于vehicle-treated控制(0.52±0.19)。然而,UCP2 mRNA表达在沉默阶段观察到高出4倍观察了急性期(3.26±0.28)。UCP2信使rna含量在慢性阶段(0.53±0.11,图1)返回到基底的水平,与对照组相似。GAPDH和18 s rRNA显示类似的量化结果实时PCR实验(数据未显示)。因此,我们分析了UCP2的时间进程表达式mRNA在所有阶段的实验性癫痫模型。毛果芸香碱注射后,我们注意到,三天有显著upregulation UCP2的表达(1.47±0.14,图2)相比,控制。增强UCP2 mRNA表达达到了顶峰SE发病后5天(3.10±0.31),这一时期后进一步下滑到基线水平。与此同时,我们通过免疫组织化学方法检测出健壮的磷酸化的表达一种蛋白激酶(p-AKT),生存的细胞标记,在寂静的阶段(5天后毛果芸香碱)相比的控制和其他实验组(表1和图3)。
(一)
(b)
治疗UCP2反义寡核苷酸(麻生太郎)已经证明有效的抑制UCP2代(34]。我们使用相同的寡核苷酸分析epileptogenesis发病与UCP2减法。事实上,UCP2沉默成功地减少了UCP2 mRNA表达SE(0.51±0.21,图5天后4(一)相比)的控制和SE组(0.83±0.16,3.36±0.32,职责)。麻生太郎治疗耐受良好,没有在实验组死亡率。老鼠接受UCP2反义寡核苷酸政府提出SE(即100%。,所有的动物对待麻生太郎毛果芸香碱政府开发紧随其后癫痫持续状态, )。相比之下,动物只有毛果芸香碱不容易进入癫痫持续状态从12个老鼠(7)。UCP2蛋白量化后提出减少值SE麻生太郎组(0.91±0.21 pg / mL)相比,SE (3.55±0.21 pg / mL)和对照组(2.38±0.21 pg / mL,图4(一))。此外,我们量化p-AKT表达式后麻生太郎政府。SE麻生太郎老鼠提出了一个减少p-AKT表达式(0.71±0.21 ng / g,图4 (c))相比,SE和控制老鼠(1.17±0.11 ng / g和1.82±0.34 ng / g,职责)。
(一)
(b)
(c)
然后分析炎症介质的表达在海马体的控制样本,SE和SE麻生太郎的老鼠。我们观察到一个增强TNF -α(1.33±0.05),il - 1β(2.89±0.41)和il - 6 mRNA SE(2.48±0.29) 5天后发作控制相比,(0.90±0.03,1.40±0.47,1.22±0.39,分别地;图5(一个))。然而,麻生太郎治疗后,SE麻生太郎老鼠的海马了近2倍的表达这些促炎介质(2.49±0.21,4.13±0.12,4.48±0.47)相比SE的老鼠。增加的il - 1β和il - 6在mRNA量化检测证实使用ELISA检测方法来确定蛋白表达。除了增加il - 1的表达β老鼠和il - 6在SE (4.01±0.19 pg / mL和2.26±0.19 pg / mL,职责),SE麻生集团重要和强大的表达这些促炎的标记(5.37±0.29 pg / mL和3.19±0.19 pg / mL)相比其他实验组(il - 1的控制β:2.35±0.13 pg / mL和il - 6: 1.23±0.05 pg / mL)。
(一)
(b)
然后我们分析了mRNA的表达是否存在凋亡因素SE的麻生太郎治疗大鼠海马的沉默阶段。SE发病诱发不仅减少凋亡bcl2 mRNA表达(0.72±0.21)也是一个健壮的mRNA的表达bcl2-associated死子(坏的管理者)(3.58±0.44),表明一个激活细胞凋亡相比,控制的(1.95±0.26,1.69±0.32,职责)。然后我们观察到一个强大的bcl2 mRNA的表达减弱SE 5天后发病和麻生太郎治疗(0.26±0.05)相比的SE组。坏mRNA表达增加与SE麻生太郎治疗(6.75±0.53)比任何其他组(图6(一))。这更高的减少bcl2:坏mRNA比率表明更明显凋亡细胞死亡与UCP2沉默的沉默阶段pilocarpine-induced癫痫模型(图6 (b))。调查,麻生太郎治疗改变生存通过增加细胞凋亡,我们分析了海马caspase-3水平的活跃。如图6 (c),caspase-3活动在第五天高海马体SE麻生集团(4.35±0.36 ng / mL)相比,控制(1.23±0.18 ng / mL)和SE组(1.73±0.21 ng / mL),表明细胞凋亡后麻生太郎政府的扩充。
(一)
(b)
(c)
脂质过氧化作用被测量MDA量化生产。MDA水平被发现增加了海马体的老鼠受到毛果芸香碱政府(SE组,0.91±0.07 nmol /毫克)相比,控制(0.56±0.15 nmol /毫克)。麻生太郎治疗的海马体的MDA水平明显提高pilocarpine-treated老鼠(1.39±0.11 nmol /毫克,图7(一))。在SE老鼠,羰基蛋白被发现的水平升高在海马体(0.92±0.11 nmol /毫克)相比的控制(0.47±0.23 nmol /毫克)。麻生太郎治疗增加了海马体的羰基蛋白含量的老鼠注射毛果芸香碱(1.42±0.09 nmol /毫克,图7 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
麻生太郎的疗效评估治疗对细胞内的抗氧化系统,我们测量ROS-related酶的活动。海马体的SOD酶活性是一成不变的SE组(0.90±0.17 U /毫克)相比,控制(0.81±0.11 U /毫克)。但是,麻生太郎治疗SE大鼠SOD酶的活性显著升高(2.48±0.34 U /毫克;图7 (c))。我们表明,过氧化氢酶活动的水平增加(3.62±0.16 U /毫克)在海马体SE相比控制(1.82±0.11 U /毫克)。必须指出治疗麻生太郎导致猫的活动增强海马(4.79±0.23 U /毫克,图7 (d))。
4所示。讨论
在目前的研究中,我们表明,老鼠受到毛果芸香碱引起的癫痫动物模型增加了UCP2的表达在海马体在沉默的早期阶段(SE)后3 - 5天之间。麻生太郎治疗成功地减少UCP2 mRNA和蛋白表达在这个时期之后。此外,SE老鼠的大脑注射麻生太郎显示氧化应激增加,脂质过氧化造成的损害,高水平的蛋白质羰基和抗氧化酶的活动水平,增加SOD、过氧化氢酶。此外,当SE老鼠收到麻生太郎,我们观察到的炎性标志物表达和增强的细胞凋亡。
我们小组报告了几个分子的参与对炎症过程的影响,逐渐采取癫痫的重要作用及其潜在的治疗(23,25]。epileptogenesis为了建立机制,我们观察到大量的细胞和分子的变化,随着时间的推移,增加了解,扩大新分子的名单,可能导致疾病的病理状态。尽管UCP2-based神经保护被广泛报道在许多物种11,36- - - - - -44),其参与海马癫痫需要进一步调查。为此,我们观察了UCP2的表达毛果芸香碱后政府在沉默的阶段,达到峰值后的第五天癫痫持续状态发病。这是通过组织分析证实海人段癫痫在啮齿动物43,45,46]。
UCP2基因表达沉默阶段可能需要表明,这个分子在epileptogenesis神经元细胞。的沉默阶段pilocarpine-induced模型的特点是没有分化表型,但许多代谢改变。我们观察到同期增加p-AKT UCP2的表达增加。UCP2和AKT已经被描述之间的关系(11,47),虽然其相关性癫痫仍不清楚。激酶AKT,也被称为蛋白激酶B是一种丝氨酸/ threonine-specific中起中心作用的蛋白激酶信号通路调节代谢和细胞转变。AKT积极可以调节细胞生长和凋亡负面通过激活一系列不同的下游信号分子(48,49]。癫痫的一种蛋白激酶磷酸化非常受欢迎,因为他们积极影响神经元生存通过减少细胞损伤后观察到的侮辱。虽然没有激酶活性,UCP2与细胞生存有密切的互动因素基于最近的报告(11]。Derdak et al。47),使用UCP2基因敲除小鼠模型,提供了第一个在活的有机体内UCP2和癌症之间联系的证据,当转基因小鼠显示上皮细胞增殖和细胞凋亡之间的不平衡。
UCP2基因表达的沉默是一种分子协议针对的信使rna分子,通过退火限制其可用性之间的互补的核苷酸序列。这种模式曾被使用有趣的结果。例如,De Souza et al。34]表明,UCP2改善高血糖的综合症的沉默在两个不同的肥胖和糖尿病动物模型。2008年,Degasperi et al。7)报道,抑制TNF - UCP2的表达增加α全身的活性氧积累和细胞凋亡的标志。作者假定UCP2表达的诱导大鼠下丘脑可以被视为一种内源性保护机制,可能会减少有害影响的强有力的炎症刺激。我们的观察,老鼠接受了UCP2反义治疗更容易癫痫持续状态可能是一个神经保护引起了UCP2的证据。
SE毛果芸香碱可以促进氧化应激引起的,可以反映在抗氧化酶的直接激活。在健康的条件下,平衡ROS的产生及其破坏的抗氧化系统。然而,这种平衡可以改变通过增加活性氧的生产或减少细胞抗氧化系统。Pilocarpine-induced癫痫发作产生一些相关变量的变化生成和消除氧自由基在成年大鼠(50]。在H SOD酶反应结果2O2和水从超氧化物歧化作用(O2−)激进,过氧化氢酶将H2O2氧气和水(51]。Tejada et al。52)报道,增加酶抗氧化活动后观察,表明神经元试图抵消过度SE-induced ROS。然而,我们观察到一个一成不变的SE发病后SOD活性。SOD活性与机制的启动和/或传播毛果芸香碱引起的癫痫发作。该数据证实了另一项研究显示的SOD活性毛果芸香碱治疗后24小时,只表明SOD活性变化在癫痫发作的启动(53]。
曹et al。54)报道,UCP2基因敲除小鼠的脾细胞更容易受到病原体activation-induced细胞凋亡,而高水平的ROS UCP2 KO小鼠凋亡易感性的原因。在我们的研究中,UCP2抑制时,抗氧化剂酶CAT和SOD活性显著增加。这些结果符合(7,34]建议的破坏性效果减少UCP2的表达与增强活性氧的形成。同时,我们显示,麻生太郎治疗导致MDA和蛋白质羰基增加SE老鼠。氧化应激诱导细胞凋亡内源性抗氧化因子下降时(7,55]。我们的研究结果表明,SE出现老鼠的海马发生凋亡减少抗氧化酶的活动。这些内源性抗氧化系统的扩充麻生太郎治疗后可以保护你的海马对毛果芸香碱导致的氧化应激。
Bengzon et al。56)报道,改变细胞死亡调节蛋白的表达和活性,如Bcl2和半胱天冬酶家族的成员,容易发生在区域细胞变性。这表明这些因素的参与细胞凋亡后发作。陈等人。57)注意到,红藻氨酸管理导致标志着海马体神经元细胞凋亡,伴随着增加水平的伯灵顿,激活caspase-3, Bcl2水平下降。在我们的研究中,bcl2 mRNA pilocarpine-induced癫痫后相对于糟糕的表达下降。UCP2表达的减少会导致更大的调制两种因素,显示更明显激活凋亡细胞死亡麻生太郎管理时,数据证实了这是Degasperi et al。7]。虽然caspase-3活动增加观察SE发病后,更高的增加SE和麻生太郎治疗后观察。然后我们可以推断出神经细胞可能有更高的敏感性SE后细胞死亡。然而,麻生太郎后,这种易感性增加。这些数据随着bcl2:坏比反义治疗后突出UCP2的神经保护作用。在一起,这些证据表明保护性细胞防御机制侮辱,依照其他几个研究[4,44,58]。
虽然UCP2的神经保护作用可能依赖于其他几个分子的活化,其抑制一种蛋白激酶的激活形式也呈现出一定的下降,进而阻止AKT发挥其催化活性和随后激活其他细胞survival-related分子(59,60]。事实上,在SE麻生太郎老鼠,我们观察到p-AKT表达减弱,确凿的这些发现。UCP2是通过神经因素直接影响减少线粒体ROS和通过分泌细胞因子的光谱的变化朝着更抗炎光谱(61年]。事实上,当我们UCP2表达减少,炎性标志物表达增加。我们的数据证实一项研究使用神经毒素MPTP-treated UCP2-deficient老鼠还显示一个增强的促炎细胞因子的表达,如肿瘤坏死因子-α和白介素1β(62年]。
5。结论
我们的数据表明,UCP2的表达调节凋亡反应和活性氧形成减轻细胞损伤在过度产生的海马神经元侮辱持久SE毛果芸香碱引起的。虽然还需要进一步的研究来确定epileptogenesis的分子途径,我们的研究结果有助于增加知识的活动在癫痫UCP2-survival-apoptosis轴。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。
作者的贡献
玛丽娜Rascio戴安娜南美洲和Regiane多斯桑托斯菲同样这项工作。
确认
作者要感谢CNPq (308067/2014-2) UNINOVE, FAPESP,必须占州政府PRONEX,西班牙de Neurociencia Translacional (INNT-MCT)和披风。这个手稿编辑Editage(仙人掌通信公司,美国)。