文摘

脓毒症、系统性炎症反应感染是死亡的主要原因在重症监护室(ICU)。先前的研究表明,间充质基质细胞(msc)会对脓毒症有疗效。目前的研究旨在探讨msc对脓毒症的影响和底层机制关注inflammasome激活巨噬细胞。结果表明,骨骨髓来源间充质干细胞(bmsc)显著增加存活率和器官功能在盲肠的结扎和穿刺(CLP)老鼠比控制组的老鼠。bmsc大大限制NLRP3 inflammasome激活,抑制线粒体活性氧的生成,减少caspase-1和il - 1β激活cocultured骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)时,由Mito-TEMPO可废除的影响。此外,caspase-1的表达水平,il - 1β,地震在BMDMs 3-MA mitophagy抑制剂治疗后升高。因此,bmsc施加有利影响抑制NLRP3 inflammasome激活巨噬细胞主要通过增强mitophagy和减少线粒体ROS。这些发现表明,限制inflammasome激活巨噬细胞通过增加mitophagy和减少线粒体ROS可能msc防治脓毒症的关键机制。

1。介绍

脓毒症综合征,感染,炎症反应是住院病人死亡的主要原因之一(1]。脓毒症的并发症,如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和多器官功能障碍综合征(插件),是危重患者的发病率和死亡率的主要原因。Sepsis-associated死亡的重症监护室(ICU)非常高,对脓毒症率高达20%,35%至45%为严重脓毒症,60%为脓毒性休克(2]。因此,至关重要的是确定脓毒症有效的治疗策略。

脓毒症的病理生理的过程是复杂的,包括入侵微生物,炎性反应、抗炎和相关immunoparalysis [3,4]。大量的数据表明,间充质基质细胞(msc),一种成年干细胞样细胞,能够抑制炎症和免疫反应(5]。因此,干细胞治疗炎性疾病已经引起了越来越多的兴趣。值得注意的是,据报道,msc可以改善器官功能和降低死亡率(6,7),以及减少sepsis-induced炎症引起的脓毒症的动物模型中盲肠的结扎和穿刺(CLP)8]。然而,这种现象的潜在机制仍知之甚少,这大大限制了cytotherapy的治疗潜力。先前的研究已经表明,mitophagy prosurvival机制与各种线粒体相关细胞暴露于压力(9]。最近的研究表明,过量的活性氧(ROS)生产参与激活mitophagy [10,11]。它也建立了胞质E3泛素连接酶,帕金,线粒体外膜激酶,PTEN-induced假定的激酶1 (PINK1),是两个主要的监管机构mitophagy在哺乳动物细胞(9,12,13]。

基于先前的报道,我们推测,骨骨髓来源间充质干细胞(bmsc)可以减少sepsis-associated CLP-induced脓毒症的炎症和器官功能障碍。我们进一步研究了bmsc的免疫调节作用在骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)来确定的机制对脓毒症bmsc的有益影响。

2。材料和方法

2.1。道德

所有动物进行了程序符合国家卫生研究院指导实验室动物保健和使用的。实验协议批准由中国人民解放军总医院和第四军医大学动物保健委员会。

2.2。动物研究协议和CLP程序

转基因C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1的osb / J小鼠(C57BL / 6, 8 - 10周,20 - 24 g),不断表达eGFP在所有的组织和器官,是商业从杰克逊实验室购买(物料编号003291)。野生型C57BL / 6小鼠(8 - 10周,20 - 24 g)来自第四军医大学动物实验室。所有的动物都有免费的水和食物在实验。C57BL / 6小鼠接受CLP操作被随机分为三组根据静脉注射溶液1 h术后( 在每组),CLP +生理盐水组(注射100μl(生理盐水);中电控股(注射2.5×10 +的边后卫组⁵成纤维细胞在100年μl);和中电+ BMSC集团(注射2.5×10⁵伴着100年μl)。bmsc的命运和心肌功能发现手术后24小时。可视化的bmsc C57BL / 6小鼠肝组织在1 - 6 h后静脉注射补充图所示就是S1C。分析了存活率手术后每6 h直到96 h。

CLP根据提出的协议执行Rittirsch et al。14]。简而言之,C57BL / 6小鼠麻醉手术期间持续吸入2%异氟烷。腹部区刮,用70%的乙醇。下腹正中切口(约1厘米),和盲肠是形象化。盲肠结扎在指定的位置是用丝绸做的缝合,地地道道的渗透22 G针。然后,腹部切口被关闭。虚假的组,盲肠的世间,不结扎或刺穿。后立即手术,动物皮下注射1毫升/ 30克盐水和imipenem-cilastatin液体复苏和预防感染。

2.3。通过超声心动图心功能评价

超声心动图进行使用Vevo 2100超声波系统(Visual-Sonics,多伦多,加拿大),30 MHz线性传感器。与持续吸入1.0%异氟烷麻醉了。数据的左心室舒张末期内径(LVEDd)、左心室收缩末期直径(LVESd)和左心室(LV)内部维度舒张(LVID d)和收缩(LVID s)测量。左心室射血分数(LVEF)和部分相应地缩短(FS)计算。整个过程是由两个被调查人员。

2.4。分离、培养和鉴定的bmsc BMDMs和准备

伴着^{eGFP +}不断从转基因表达eGFP C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1的osb / J小鼠和培养如前所述15]。孤立的bmsc一致负了CD34、CD45和本来就;是积极CD29、CD44, CD90;潜力,multidifferentiation脂肪形成和骨生成(补充图所示S1A和B)。

老鼠牺牲,股骨被移除和洁净的组织。从股骨骨髓被刷新PBS和收集的离心(200 ,5分钟)。细胞培养密度的5×10⁵/毫升,在培养皿中与DMEM培养基补充10%(卷/期)的边后卫,1%(卷/期)青霉素和链霉素。后6 h 37°C的孵化有限公司5%₂,不依从细胞(主要来源于巨噬细胞的骨)浆和播种在盘子和孵化与25%完全培养基(卷/期)从L929小鼠成纤维细胞条件培养液7天(超过90%细胞阳性细胞表面标记CD11b)形成细胞增殖未激活的巨噬细胞(M0) [16,17]。

的在体外细胞研究分为以下六类:(1)对照组(控制);(2)LPS-treated集团(有限合伙人),BMDMs有限合伙人的被试(2μg / ml) 4小时;(3)有限合伙人+ ATP-treated集团(有限合伙人+ ATP-stimulated) BMDMs有限合伙人的被试(2μg / ml) 4小时后跟孵化与ATP(5毫米)0.5 h;(4)BMSC coculture集团(BMSC);(5)BMSC coculture LPS-treated集团(BMSC-LPS);(6)BMSC coculture和有限合伙人+ ATP-treated集团(BMSC-treated) BMDMs有限合伙人的被试(2μg / ml) 4小时后跟孵化与ATP(5毫米)为0.5 h。bmsc, transwell coculture,被添加在ATP BMDMs刺激的一步。

2.5。评估炎性细胞因子和器官损伤标记

炎性细胞因子(il - 1β肿瘤坏死因子-α、il - 6和il - 10)和血清生物标志物(cTnI、CK、LDH、ALT、AST淀粉酶、可控硅,和包子)测量与spectrophotometrically商业ELISA测定包(研发系统、美国)根据制造商的指示。

2.6。免疫组织化学染色

进行免疫组织化学染色检测炎性细胞浸润。组织部分与正常山羊血清5 - 10%被封锁了30分钟,然后孵化与单克隆抗体anti-Ly-6G和anti-Mac-3(美国圣地亚哥从Biolegend CA)一夜之间在4°C。然后,部分与二次清洗和孵化辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit抗体(于北京中山生物技术有限公司,中国)在37°C 1 h。部分是随机挑选的,所以图像可视化和拍摄倒或共焦显微镜(日本奥林巴斯)。

2.7。免疫印迹

如前所述(执行免疫印迹18]。简而言之,蛋白质从细胞或组织与收获里帕裂解缓冲(Beyotime生物技术,北京)。总蛋白质被加载到sds - page凝胶和electrophoretically转移到PVDF膜(微孔、Billerica MA)。与5%的脱脂牛奶1 h,阻塞后膜被孵化主要抗体在一夜之间4°C。之后,膜被清洗和孵化与相应的二次抗体在37°C 1 h。这些墨迹开发和增强化学发光(ECL)试剂(微孔)和可视化使用UVP能系统。吸干密度与数量一个系统软件进行了分析。

主要抗体如下:procaspase-1、caspase-1 pro-IL-1β,ASC P2X7 NLRP3 PINK1,帕金,LC3,β肌动蛋白(所有从Abcam,剑桥,妈,美国)。二次抗体如下:辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit和山羊anti-rat(中山生物技术有限公司)。

2.8。透射电子显微镜(TEM)

TEM观察线粒体形态。短暂,收集BMDMs接受固定的程序,逐步酒精脱水、包埋、聚合、切片、染色。用电子显微镜图像观察(jem - 2000 ex TEM JEOL有限公司东京,日本)。随机的部分被蒙蔽技术员可视化。

2.9。线粒体ROS生产检测

发现线粒体ROS生产使用MitoSOX™(例/ Em: 510/580 nm), MitoTracker®深红色调频(例/ Em: 640/662 nm)和MitoTracker绿色调频(例/ Em: 490/516 nm)荧光染料(从表达载体,英杰公司公司,美国)流式细胞术。

2.10。统计分析

数据表示为均值±SD和分析了使用方差分析其次是事后Bonferroni调整t以及。kaplan meier的存活率进行了分析测试随后log-rank事后测试。所有统计测试使用SPSS软件进行版本17.0(美国、IBM、纽约Armonk)和GraphPad棱镜软件5.0版本(GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。综合治疗提高存活率和CLP后Multiorgan功能

图1(一)显示了CLP后C57BL / 6小鼠存活曲线。而CLP +生理盐水和CLP +的边后卫,存活率显著增加在CLP + BMSC,存活率为10%,5%,40%在三组96 h的时间点( )。他染色显示,BMSC显著地改善形态变化的重要器官,如心脏、肝、脾、肺、肾,由间质水肿明显,红细胞,炎性细胞浸润(图1 (b))。此外,血清生物标记,包括心肌肌钙蛋白I (cTnI),肌酐激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、淀粉酶、血清肌酐值(SCr)和血液尿素氮(BUN),显著降低在CLP + BMSC组相比,CLP +生理盐水和CLP +的边后卫组( ),这表明BMSC CLP(图后治疗改善器官功能1 (c))。

3.2。CLP后bmsc改善心肌功能

图1 (d)在每组表明代表M-mode超声心动图图像。CLP-induced心脏萧条是通过降低左心室射血分数(LVEF)、左心室部分缩短(LVFS)和最大速度增加以及减少在左心室压力每秒(±dP / dt)在CLP +生理盐水组( CLP +生理盐水组和虚假的组)。CLP +生理盐水与中电+的边后卫,BMSC有增加左心室射血分数(LVEF)、左心室部分缩短(LVFS)和最大速度以及压力每秒减少左心室(±dP / dt),这一部分BMSC治疗改善心肌功能在CLP(数字1 (e)和1 (f))。

3.3。bmsc CLP-Induced炎症水平降低

心脏和肺组织炎性细胞浸润是由免疫组织化学Ly-6G和MAC-3公认生物标记对中性粒细胞和巨噬细胞。可以推断BMSC治疗抑制炎症细胞浸润,就是明证减少巨噬细胞(Mac-3)(数据2(一个)和2 (c))和中性粒细胞(Ly6G)渗透(数字2 (b)和2 (c))在肺和肝脏组织。此外,bmsc的促炎细胞因子水平降低il - 6、il - 1β和肿瘤坏死因子-α,同时增加抗炎细胞因子il - 10在血清(图2 (d), CLP + BMSC组与中电+生理盐水组; CLP + BMSC组与中电+的边后卫组)。

3.4。bmsc抑制NLRP3 Inflammasome-Mediated Caspase-1和il - 1β激活

图3(一个)显示代表滴NLRP3 ASC, procaspase-1 caspase-1 p20, pro-IL-1β,il - 1β在肝组织中。NLRP3 inflammasome BMSC治疗后表达降低与CLP +生理盐水和CLP +的边后卫组(数字3(一个)和3 (b))。此外,caspase-1乳沟和激活,导致成熟和il - 1的分泌β,揭示了caspase-1 p20和il - 1βp17表达,更有抑制小鼠的肝脏组织中与BMSC治疗比单一的生理盐水或治疗的边后卫。

3.5。bmsc抑制Caspase-1和il - 1β激活BMDMs

简而言之,BMDMs影射与有限合伙人(2μg / ml) 4小时,其次是孵化与ATP(5毫米)为0.5 h。bmsc, transwell coculture,被添加到在ATP BMDMs刺激的一步。18小时之后,caspase-1和il - 1β激活巨噬细胞溶菌产物分析的免疫印迹(如图4(一))。有限合伙人和ATP刺激诱导caspase-1和il - 1β激活,通过增加caspase-1 p20和il - 1βp17表达式。此外,BMSC coculturing抑制LPS和ATP刺激诱导caspase-1和il - 1β在BMDMs激活( , BMSC-treated集团与有限合伙人+ ATP-stimulated集团)(图4 (b))。同样,il - 1的水平β和地震-上层清液减少BMSC-treated组相比,有限合伙人+ ATP-stimulated组(图4 (c))。此外,表达水平没有显著差异的P2X7, procaspase-1, pro-IL-1β在组织(图4 (b))。

3.6。bmsc抑制NLRP3 Inflammasome激活BMDMs通过减少线粒体ROS

与有限合伙人+ ATP-stimulated组相比,BMSC coculturing减少线粒体ROS在BMDMs(图(mtROS)水平5(一个))。流式细胞术分析MitoTracker深Red-MitoTracker绿色(图5 (b))表明,bmsc缓解LPS + ATP BMDMs电极刺激诱发的线粒体损伤。抗氧化剂Mito-TEMPO被用来抑制mtROS代。图5 (c)显示的colocalization NLRP3(绿色),线粒体(红色),并通过免疫荧光染色细胞核(蓝色)。控制BMDMs,很少NLRP3 cosedimented线粒体。然而,更NLRP3与LPS-ATP刺激后或者相邻的线粒体。bmsc和Mito-TEMPO导致少colocalization NLRP3和线粒体。有限合伙人和ATP的刺激后,Mito-TEMPO治疗的表达水平降低caspase-1 p20和il - 1βp17 ( , ),这表明NLRP3激活与mtROS水平有关。此外,表达水平的caspase-1 p20和il - 1βp17也减少BMSC-treated组( , ),表明bmsc的影响可以归因于mtROS BMDMs清除(数字5 (d)和5 (e))。此外,bmsc和Mito-TEMPO减少细胞因子il - 1的分泌β和地震(图5 (f), )。

3.7。通过增加BMDM bmsc抑制NLRP3 Inflammasome激活Mitophagy

使用电子显微镜(EM),我们直接评估线粒体完整性和状态。我们观察了mitophagy(红色箭头所示)和线粒体肿胀BMSC-treated组少于治疗有限合伙人和ATP在BMDMs(图6(一))。此外,autophagy-associated LC3 puncta发现积累在线粒体BMDMs当coculturing bmsc LPS刺激后,ATP(图6 (b))。免疫印迹结果如上所示的数据6 (c)和6 (d)、治疗的BMDMs mitophagy /自噬抑制剂3-methyladenine (3-MA)增强caspase-1和il - 1的激活β,以及il - 1的分泌β和地震BMDMs当coculturing bmsc有限合伙人和ATP后刺激(图6 (e))。

3.8。bmsc增加Parkin-Mediated Mitophagy BMDMs

bmsc和Mito-TEMPO PINK1的表达显著升高,帕金,LC3BII /我比(数字7(一)和7 (b))。MitoSOX流式细胞术显示,bmsc显著降低mtROS一代,而由3-MA mitophagy抑制减弱这种效果,表明bmsc的抑制性影响mtROS代是由mitophagy(图7 (c))。

4所示。讨论

几项研究已经表明msc对脓毒症的有利影响,但潜在的机制尚不清楚。在目前的研究中,我们对败血症实验证明bmsc施加有益的影响通过抑制NLRP3 inflammasome激活巨噬细胞。此外,本研究中的一个重要的发现是,bmsc限制NLRP3 inflammasome激活通过增加mitophagy激活和减少巨噬细胞中线粒体ROS。

msc的防腐功效可能归因于他们家里受伤组织的能力,旁分泌细胞因子分泌,减少受伤组织的细胞凋亡,调节免疫细胞(19,20.]。据报道,msc减毒脓毒性损伤通过减少炎性细胞的浸润,各目标器官细胞死亡(21]。然而,Krasnodembskaya et al。确定人类bmsc减毒活bacteria-induced损伤由于直接的抗菌活性22]。此外,同一组发表了一项研究治疗潜在的人类MSC在脓毒症模型,他们发现,MSC效应与增加血液单核细胞的吞噬活性和M2两极分化的单核细胞/巨噬细胞在脾脏23]。虽然复杂,但收购机械的知识是至关重要的对脓毒症损伤发展BMSC细胞疗法。在目前的研究中,我们的数据表明,bmsc CLP小鼠存活率增加,减轻器官通过改善器官功能损伤和减轻促炎细胞因子。

心脏功能对脓毒症的临床结果至关重要。因此,近年来心肌功能障碍已经获得越来越多的关注(24,25]。在最近的研究中,我们观察到在脓毒性小鼠心脏功能受损超声心动图和血流动力学测量。CLP引起的BMSC治疗有效地改善心脏功能。类似地,威尔等人的结果。建议静脉输液内毒素msc改善心肌功能的模式26]。然而,msc的有益作用的确切机制心脏复苏远未明朗。罗杰斯等人的数据显示,msc对修复对心肌的影响通过心肌细胞的分子改变自己27]。值得注意的是,脓毒症的研究表明,线粒体可以调节器官功能障碍,包括心脏功能衰退。考虑到我们的数据,线粒体功能障碍可能是心脏抑郁症在脓毒症的基本因素。然而,仍然需要进一步的研究来阐明这一点。

根据先前的研究,脓毒症时发起守恒的微生物结构(其为病原体也被称为的分子模式,pamp)与受体结合嵌入细胞膜或细胞内细胞质的先天免疫系统的细胞,即血液单核细胞和组织巨噬细胞。脓毒症的第一阶段的特点是生产促炎细胞因子,包括肿瘤坏死因子-α(TNF -α)、白介素- 1 (IL)β、il - 6和引发。这些促炎介质编排脓毒性反应的主机。不久这hyperproduction促炎介质的第一阶段,第二阶段随之而来Th2细胞,单核细胞和巨噬细胞刺激pamp分泌大量的抗炎介质如il - 10。这一阶段被认为是一种免疫抑制状态或immunoparalysis主机在多器官功能障碍的发生(28]。与先前的报道一致,我们发现炎症生物标记(il - 1β肿瘤坏死因子-α、il - 6和il - 10)、血清标志物(cTnI、CK、LDH、ALT、AST淀粉酶、可控硅,和面包),和炎性细胞浸润增加在CLP老鼠与对照小鼠相比7,26,29日]。此外,线粒体ROS生成也升高CLP-induced感染性老鼠。这些结果被张等研究结果一致。提出,CLP-induced败血症引发了严格的炎症反应与ROS的生成(30.]。脓毒症的特点是压倒性的激活的炎症和免疫反应。本研究的一个有趣的发现是,bmsc限制了炎症反应和ROS生成在CLP的动物。这是与先前的报道。犬吠和他的同事报道,联合治疗与褪黑素和凋亡脂肪间充质干细胞通过衰减缓解sepsis-induced器官损伤炎症和氧化应激反应2,31日]。值得注意的是,炎性细胞因子是由巨噬细胞而不是注射bmsc,表明bmsc的治疗效果与过度的炎症反应是由一个bmsc与巨噬细胞相互作用。的在体外coculture实验进一步证实了这个发现。

Inflammasomes各种蛋白复合物,可以识别inflammation-inducing刺激和控制炎症细胞因子的生产(32]。其中,NLRP3 (nucleotide-binding域,leucine-rich-repeat-containing家庭,和pyrin domain-containing 3) inflammasome是最广泛的研究了inflammasomes之一。的NLRP3 inflammasome,调节亚基组成的NLRP3,适配器ASC和效应caspase-1分子复杂,可以激活触发免疫防御等分泌炎性细胞因子il - 1β或地震33,34]。先前的研究表明,NLRP3 inflammasome是调节和激活在肝脏脓毒症35,36]。我们的数据显示,NLRP3 inflammasome-mediated和il - 1β在感染性肝组织活化,bmsc抑制NLRP3激活和合成il - 1β激活。尽管NLRP3水平或其适配器ASC并未透露一个重要变更,其细胞定位发生了变化。根据我们的免疫荧光结果推断,休息NLRP3本地化的内质网,虽然inflammasome激活的情况下,NLRP3与内质网和线粒体结构。线粒体ROS能够诱导NLRP3 inflammasome激活(37]。作为我们的数据显示,外加Mito-TEMPO (mitochondria-targeted抗氧化剂),的relocalization NLRP3 inflammasome进一步减弱,结合后续caspase-1和il - 1的激活下降β。类似于前面的结果,我们发现防治(NAC,活性氧抑制剂)废除caspase-1激活和il - 1的显著增加β表达BMDMs有限合伙人和ATP。这些结果表明,保护作用的bmsc NLRP3 inflammasome被调节线粒体ROS介导的一代。

保持健康对细胞线粒体人口是重要。自噬清除线粒体营业额的主要通路,称为mitophagy [38]。最近,Mahrouf-Yorgov等人发现,msc的道在梗塞的心里的老鼠可以减少损伤通过上调HO-1线粒体生物起源和增加,抑制mitophagy或HO-1未能防止心脏细胞凋亡(39]。激活自噬过程的报道在脓毒性减弱心脏功能障碍和肝损伤小鼠(40- - - - - -42]。同样,Carchman et al。证明mitophagy是必要的,以防止器官损伤在脓毒症,但作者认为这保护过程的激活TLR9识别信号(43]。帕金,E3泛素连接酶,促进功能失调的线粒体自噬的批准(44]。在我们目前的研究中,结果表明:bmsc增加Parkin-mediated mitophagy和减少mtROS代BMDMs。此外,抑制与3-MA mitophagy代理阻止il - 1的bmsc的抑制作用β激活和线粒体ROS生产,表明bmsc对炎症的影响监管和线粒体ROS生成主要是由mitophagy。

虽然我们的研究的数据承担一些临床相关性,几个限制依然存在。首先,心脏功能抑郁症在脓毒症可能是由各种因素,解毒等炎症因子,可能不能代表所有的贡献者。我们只观察msc的影响,但潜在的机制仍不清楚。第二,数据是基于一个小鼠CLP模型,以及bmsc的剂量可能是不同的在临床设置。此外,随着在体外细胞研究不能完全模拟在活的有机体内情况下,之间的薄弱环节在活的有机体内和在体外研究应该考虑。尽管inflammasome抑制的机制通过msc被切割在体外少,这是证实在活的有机体内。因此,更多的研究是必要的,以确认如果我们当前的发现是人类对msc在临床的设置。

5。结论

bmsc改善小鼠存活率,减轻器官损伤实验中电引起的败血症。bmsc的有利影响是由抑制NLRP3 inflammasome激活巨噬细胞,主要通过增加巨噬细胞的mitophagy和减少线粒体ROS生成(图8)。综上所述,msc可以作为有前途的细胞治疗,作为对抗immune-modulator,脓毒症。

的利益冲突

作者宣称没有利益存在竞争。

作者的贡献

李霜,吴皓和韩董,同样这个工作。

确认

这项工作得到了中国国家重点研究项目(2016 yfa0100903),中国国家杰出青年科学家基金(81325009)、国家自然科学基金(81530058)、(FCao BWS12J037),陕西省创新团队资助(没有。2014 kct-20)和通用金融的格兰特中国博士后科学基金会(2017 m613337)。

补充材料

补充1。图S1:特征和注入BMSCseGFP +的命运。答:分化BMSCseGFP +的潜力。Fibroblast-like-shaped BMSCseGFP + GFP是积极的。脂肪生成BMSCseGFP +脂肪形成的分化条件下被油红O染色法检测。骨生成评估了茜素红染色。酒吧,100μm。b .流式细胞术结果显示BMSCseGFP +统一为CD34阴性,CD45,本来就和阳性CD29、CD44, CD90。c .可视化BMSCseGFP + C57BL / 6小鼠(红色箭头)肝组织静脉注射后在1 - 6 h。酒吧,100μm。数据显示代表2 (A, B)或3 (C)独立的实验。

补充2。图S2:抑制ROS生成废除caspase-1激活。答:免疫印迹分析caspase-1和il - 1β的溶解产物BMDMs孵化1 h和NAC(美国Sigma-Aldrich)(10毫米),其次是有限合伙人和ATP。西方的屁股半定量的分析。误差线代表意味着±s.e.m。 和 。 。数据代表至少有三个独立的实验。

补充3。图S3:共焦显微镜分析LC3 BMDMs彩色的(绿色)和线粒体(红色)为colocalization mitophagy的一项指标。规模的酒吧,20μm。

补充4。图S4:原始图像的caspase-1 p20和il - 1βp17在图4。

补充5。图S5:相对平均荧光强度(MFI)比较。答:BMDMs处理有限合伙人(2μg / ml, 4小时)和ATP(5毫米,0.5 h) (L + A)。bmsc与BMDMs cocultured transwell从ATP许可2 h。BMDMs沾MitoSOX (5μ米)最后30分钟,然后分析了FlowJo 7.6.1 (Becton, Dickinson & Company,美国)。b . BMDMs刺激与3-MA(10毫米)6 h沾MitoSOX (5μ米)30分钟,然后分析了FlowJo 7.6.1。的数据是代表三个独立的实验。

补充6。图S6: colocalization NLRP3和线粒体。BMDMs表达NLRP3(绿色)分析与线粒体的NLRP3 colocalization使用共焦显微镜(红色)。规模的酒吧,20μm。