文摘
HMGB1,一个高度保守的非组蛋白的dna结合蛋白,在炎性疾病中扮演一个重要角色。一旦释放到细胞外空间,HMGB1作为促炎细胞因子,引发炎症反应。我们之前的研究表明,红景天甙通过抑制信号通路JAK2-STAT3发挥抗炎效应。然而,是否红景天甙抑制HMGB1的释放尚不清楚。在这项研究中,我们的目标是研究红景天甙在释放HMGB1的影响,然后探讨潜在的分子机制。在实验大鼠模型引起的败血症CLP,红景天甙政府极大地减弱肺损伤,降低血清HMGB1的水平。在RAW264.7细胞,我们调查了红景天甙对LPS-induced HMGB1释放的影响,然后探讨了潜在的分子机制。我们发现红景天甙显著抑制LPS-induced HMGB1释放,抑制作用是与HMGB1的乙酰化水平。机制,红景天甙抑制HMGB1乙酰化作用通过AMPK-SirT1通路。此外,SirT1过度减毒LPS-induced HMGB1乙酰化和核质易位。 Furthermore, in SirT1 shRNA plasmid-transfected cells, salidroside treatment enhanced SirT1 expression and reduced LPS-activated HMGB1 acetylation and nucleocytoplasmic translocation. Collectively, these results demonstrated that salidroside might reduce HMGB1 release through the AMPK-SirT1 signalling pathway and suppress HMGB1 acetylation and nucleocytoplasmic translocation.
1。介绍
高机动组框1 (HMGB1),一个无处不在的非组蛋白的dna结合蛋白是真核细胞的细胞核中表达起来从而扮演重要的角色在维持核小体结构和稳定性,染色质重塑和基因转录的调节1- - - - - -3]。除了这些细胞内功能,HMGB1可以被释放到细胞外空间和作为促炎细胞因子诱导炎症反应(4]。到目前为止,我们已经了解到,HMGB1可以主动发布的激活免疫细胞或被动释放受损和坏死细胞(5,6,核质易位需要主动释放HMGB1的途径7]。一旦释放到细胞外空间,HMGB1与其受体结合包括TLR2 (toll样受体2),TLR4和愤怒(受体对先进的糖化结束产品),然后参与的信号通路(8]。越来越多的证据表明,HMGB1扮演着一个重要的角色在炎性疾病如脓毒症(9,10]。因此,针对HMGB1可能是一个重要的策略治疗脓毒症和其他炎症性疾病。
几个转译后的修改,如磷酸化、乙酰化、甲基化、参与的易位HMGB1从细胞核,细胞质中7,11,12]。最近的一项研究表明,HMGB1 RAW264.7细胞释放的乙酰化和LPS刺激后(13]。它也被报道,NAD-dependent第三类组蛋白脱乙酰酶(HDAC)起着重要的作用在调节乙酰化HMGB1释放神经元响应乙醇暴露(14]。作为NAD-dependent第三类组蛋白脱乙酰酶,sirtuin蛋白1 (SirT1)调节HMGB1 hyperacetylation和细胞外释放15]。活化蛋白激酶(AMPK),一个保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,是全身能量稳态的主要监管机构之一(16]。SirT1还充当能量传感器(17];SirT1, AMPK配合调节代谢途径。最近的一项研究报道,AMPK SirT1激活通过增加烟酰胺的表达phosphoribosyltransferase (Nampt) [18]。此外,新兴证据表明AMPK-SirT1信号通路调节炎症信号在各种细胞(19,20.]。
红景天甙(SAL, p-hydroxyphenethyl -β-D-glucoside、结构如图1)是一种活性成分分离红景天的(21]。据报道施加各种药理属性包括抗炎(21,抗肿瘤22,23),和神经保护24]。我们之前的研究表明,红景天甙抑制炎性细胞因子的释放、调解LPS诱导的RAW264.7细胞和腹膜巨噬细胞通过抑制JAK2-STAT3信号通路(25]。然而,是否红景天甙抑制HMGB1的释放和潜在的分子机制尚不清楚。
在目前的研究中,我们的目的是探讨红景天甙对HMGB1释放的影响,探索影响是否与AMPK-SirT1-mediated HMGB1乙酰化作用。
2。材料和方法
2.1。试剂和抗体
红景天甙(纯度> 98%)和有限合伙人从σ购买。主GAPDH抗体,β肌动蛋白,核纤层蛋白B1,真沸点,SirT1, phospho-AMPK (Thr172)细胞信号技术的产品(CST)。anti-HMGB1, anti-phosphoserine, anti-acetyl赖氨酸抗体都从Abcam购买。所有的二级抗体用于免疫印迹买来LI-COR生物技术。事先批准蛋白质A / G +琼脂糖珠用于coimmunoprecipitation (IP)是来自圣克鲁斯生物技术有限公司
2.2。细胞培养和通道
RAW264.7细胞,从昆明细胞获得银行(中国昆明),培养在杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)含10%胎牛血清,100μ克/毫升的链霉素和100 U /毫升青霉素在37°C和5%的公司2。每1 - 2天的细胞通道。
2.3。测量HMGB1含量
HMGB1的大量细胞培养上清液中检测到使用double-antibody夹心酶联免疫试剂盒购自武汉华美生物技术有限公司(武汉,中国)。操作是根据制造商提供的协议。
2.4。质粒,转染
超表达质粒和消极的控制提出了SirT1的吴教授之浩(生物学系,皖南医学院)。SirT1的成分和消极控制质粒从上海购买Genechem有限公司(上海,中国)。细胞种植在6-well板24 h,然后转染Lipofectamine 3000转染试剂(英杰公司)根据制造商的协议。转染细胞的治疗时间和受西方墨点法或coimmunoprecipitation表示。
2.5。西方墨点法和Coimmunoprecipitation
细胞用冰冷的PBS,细胞溶解在冰上细胞溶菌作用30分钟的缓冲(Beyotime生物技术,中国),并结合蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏应用科学,印第安纳波利斯,美国)。溶菌产物收集和离心机(12500 rpm)在4°C,持续15分钟。等量的蛋白质与指定的抗体免疫沉淀反应在一夜之间在4°C。然后,20μl事先批准蛋白A / G +添加琼脂糖珠和孵化immunocomplexes额外2 h在4°C。洗后用冷裂解缓冲三次,免疫沉淀反应被sds - page分离,然后转移到硝化纤维素膜(美国微孔);膜被封锁的5%脱脂牛奶在室温下1 h。与TBST洗涤后,细胞膜表示主要抗体孵育过夜在4°C,然后用TBST洗3次。洗后,膜被孵化IRDye800 fluorophore-conjugated二级抗体1 h在黑暗中在室温下。LI-COR奥德赛的墨迹图分析了红外成像系统(LICOR生物科学、林肯、NE)和蛋白质被LI-COR奥德赛量化分析软件。
2.6。核和胞质蛋白提取
短暂治疗后,RAW264.7细胞细胞溶解和核和细胞质蛋白质分离和收集使用核质分离设备(Beyotime生物技术,中国)。操作严格按照制造商的指示进行。
2.7。激光共聚焦实验
RAW264.7或转染RAW264.7细胞被播种在小共焦激光菜;第二天,细胞使用红景天甙2 h,然后用LPS刺激的表示时间点。细胞被固定为4%的聚甲醛,permeabilized Triton x - 100, 0.2%和3% BSA阻塞。在PBS洗涤后,这些细胞被孵化的HMGB1主要抗体在一夜之间在4°C;然后,一只山羊anti-rabbit免疫球蛋白Alexa萤石555 -共轭二次荧光抗体是孵化1 h在黑暗中在室温下。核与DAPI染色为3分钟。使用徕卡TCS SP8显微镜图像被抓获。
2.8。脓毒症的动物模型
本研究通过动物保健和使用委员会皖南医学院。动物是依照规定的要求和中国实验动物管理立法的一般建议。短暂,脓毒症诱导Wistar鼠体重180 - 220克,盲肠的结扎和穿刺(CLP)如前所述26]。所有的老鼠都与戊巴比妥钠麻醉(30毫克/公斤)和手术前随机分为三组:对照组(虚假的操作组),中电控股集团、红景天甙(SAL)组。在对照组,大鼠麻醉和手术没有CLP。CLP组大鼠麻醉,中电控股。萨尔组,红景天甙(20毫克/公斤)接种的老鼠,他们受到CLP后30分钟。血液收集12 h CLP后检测血清HMGB1的水平。在平行实验,12 h CLP后,肺组织是提取大鼠麻醉下实施安乐死。
2.9。组织学检查
从大鼠肺组织分离,然后用PBS洗净,用福尔马林固定,石蜡的嵌入。最后,部分被苏木精和伊红染色())。
2.10。统计分析
所有数据都表示为均值±SD。使用SPSS软件进行统计分析(SPSS 17.0版;美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。的意义差异计算与单向方差分析(方差分析)。 被认为是表明一个显著差异。
3所示。结果
3.1。红景天甙降低血清HMGB1水平和改善肺损伤在CLP老鼠
我们之前的研究发现,红景天甙减毒血清il - 6和TNF -α水平LPS-induced急性肺损伤(25]。在目前的研究中,进一步证明红景天甙的抗炎作用,我们要评价红景天甙对释放HMGB1的影响和在CLP-induced感染性肺损伤模型。图2(一个)表明血清水平的红景天甙组HMGB1在12 h CLP后中电集团的价格相比明显减少。因为肺组织在脓毒症(尤其容易受到严重损伤10),我们进行组织学检查评价红景天甙对CLP-induced肺损伤的影响,特点是充血,水肿,炎症细胞浸润。我们的研究结果显示,组织损伤、水肿和炎症细胞浸润明显都是缓解红景天甙组与中电集团(图2 (b))。
(一)
(b)
3.2。红景天甙变弱LPS-Induced HMGB1在RAW264.7细胞释放
澄清是否降低血清中HMGB1 salidroside-treated CLP老鼠是因为红景天甙的抑制作用在HMGB1释放,我们选择RAW264.7细胞检测红景天甙在LPS-induced HMGB1释放的影响。因为我们以前的研究表明,红景天甙没有细胞毒性细胞生存能力即使在高剂量的400μ克/毫升(25]。我们用50 - 200细胞刺激μg / ml红景天甙的研究。我们第一次发现HMGB1的释放在LPS刺激RAW264.7细胞。细胞治疗100 ng / ml的有限合伙人为不同时间点(3、6、12、18和24 h);HMGB1的水平在文化上层清液使用酶联免疫试剂盒测定。图3(一个)表明LPS诱导释放HMGB1, HMGB1的水平见顶大约在12 h。其次,我们研究红景天甙在LPS-activated HMGB1释放的影响。RAW264.7细胞使用不同剂量的红景天甙(50,100年和200年μg / ml) 2 h,然后处理100 ng / ml的有限合伙人12 h。结果在图3 (b)表明,红景天甙明显的剂量依赖性降低HMGB1释放。
(一)
(b)
3.3。红景天甙抑制LPS-Induced HMGB1 RAW264.7细胞的核质易位
核质易位的HMGB1炎症期间释放HMGB1的关键一步。研究红景天甙对HMGB1核质易位的影响,HMGB1在核和胞质蛋白的含量检测到核质分离。HMGB1在细胞核和细胞质的定位是由激光共焦显微镜。RAW264.7细胞使用红景天甙(200μg / ml) 2 h,然后用LPS刺激(100 ng / ml) 12 h。分别收集细胞质和核蛋白质。结果在图4(一)表明核HMGB1蛋白水平的降低与LPS刺激后预处理和红景天甙明显抑制响应。同时,细胞质HMGB1的表达表现出相反的变化。激光共焦显微镜的结果显示,HMGB1(红色)主要是局部细胞核在对照组(蓝色);与LPS处理后,核HMGB1被转移到细胞质和易位HMGB1被抑制的细胞使用红景天甙(图4 (b))。我们的研究结果表明,红景天甙抑制HMGB1的核质易位LPS诱导的RAW264.7细胞。
(一)
(b)
3.4。红景天甙减少HMGB1的乙酰化作用而非磷酸化LPS诱导的RAW264.7细胞
因为许多转译后的修改,包括磷酸化和乙酰化作用,例如,参与HMGB1的核质易位,我们研究红景天甙的影响LPS-induced HMGB1在RAW264.7细胞磷酸化和乙酰化作用。细胞被preincubated红景天甙(200μg / ml) 2 h,然后处理100 ng / ml的有限合伙人4 h。总蛋白提取,然后,IP是用来确定HMGB1的磷酸化和乙酰化作用。如图5(一个),HMGB1明显磷酸化在LPS刺激。然而,在预处理红景天甙,HMGB1磷酸化水平没有影响。HMGB1的乙酰化作用也被检测到。我们的研究结果表明,有限合伙人治疗诱导HMGB1的乙酰化RAW264.7细胞和预处理,红景天甙可以抑制LPS-induced HMGB1乙酰化作用明显(图5 (b))。综上所述,这些结果表明,红景天甙减少LPS-activated HMGB1乙酰化作用而不是在RAW264.7细胞磷酸化。
(一)
(b)
3.5。红景天甙上调SirT1的表达通过AMPK在RAW264.7细胞信号
SirT1, NAD-dependent第三类组蛋白去乙酰酶抑制剂的一员,发现影响HMGB1的乙酰化和释放。我们进一步探讨红景天甙是否影响SirT1在当下的表达研究。RAW264.7细胞治疗红景天甙(200μg / ml)在不同时间点,或不同浓度的红景天甙(50,100年和200年μg / ml) 12 h,或使用红景天甙(200μg / ml) 2 h,然后处理有限合伙人(100 ng / ml)额外12 h。总蛋白提取,SirT1的水平是由西方墨点法。数据6(一)和6 (b)表明,红景天甙增强SirT1的表达以时间和剂量依赖性的方式。此外,LPS刺激减少了SirT1的水平;然而,红景天甙预处理剂量依赖性逆转SirT1的减少引起的有限合伙人(图6 (c))。据报道,AMPK-SirT1各细胞信号通路调节炎症信号,AMPK可以SirT1激活。因此,我们下一步研究红景天甙是否通过AMPK信号调节SirT1的表达式。RAW264.7细胞治疗红景天甙(200μg / ml)在不同时间点,或不同浓度的红景天甙(50,100年和200年μg / ml) 12 h,或红景天甙(200μg / ml) +有限合伙人(100 ng / ml) 12 h。总蛋白提取和磷酸化AMPK水平取决于西方墨点法。AMPK的结果表明,磷酸化增强对红景天甙刺激以时间和剂量依赖性的方式(数字6 (d)和6 (e))。LPS刺激明显抑制AMPK磷酸化,红景天甙治疗可以显著逆转抑制LPS AMPK磷酸化(图6 (f))。这些结果表明,红景天甙可能通过上调SirT1 AMPK信号。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.6。SirT1过度抑制HMGB1的乙酰化和核质易位LPS诱导的RAW264.7细胞
上面给出的结果表明,红景天甙减少乙酰化和核质易位LPS-induced HMGB1的移植SirT1的表达式。进一步验证SirT1的角色HMGB1乙酰化调节和核质易位,我们过表达SirT1的质粒和消极控制RAW264.7细胞的质粒。转染24小时后,细胞治疗有或没有有限合伙人(100 ng / ml)表示时间点。HMGB1被检测到核质分布的分离和共焦实验,HMGB1被检测到IP的乙酰化作用,转染效率的分析了SirT1的灰度级扫描。与控制质粒相比,SirT1超表达效率分别为152.40%和140.8,分别。从图的结果7(一)显示与控制细胞转染质粒,有限合伙人的治疗后,HMGB1的水平相比,细胞核明显减弱,细胞治疗没有有限合伙人。相反,HMGB1蛋白的表达在细胞质中呈现相反的变化。然而,HMGB1含量的变化在细胞核和细胞质被显著抑制SirT1 plasmid-transfected细胞相比,控制plasmid-transfected细胞。HMGB1的分布是由激光共焦显微镜。在图7 (b),我们表明,在控制plasmid-transfected RAW264.7细胞,HMGB1(红色)主要位于细胞核(蓝色),但在LPS刺激后,HMGB1显然从细胞核转移到细胞质中。在细胞转染SirT1超表达质粒,HMGB1的易位引起LPS显然是减毒的价格相比控制plasmid-transfected组。我们也调查了SirT1在LPS-activated HMGB1乙酰化超表达的影响。结果在图7 (c)表明,细胞转染质粒与控制,有限合伙人治疗诱导HMGB1的乙酰化作用明显,但增强的HMGB1乙酰化作用在控制plasmid-transfected组显著降低SirT1 plasmid-transfected细胞。换句话说,我们的结果表明,SirT1超表达可以抑制LPS-induced HMGB1乙酰化在RAW264.7细胞和核质易位。
(一)
(b)
(c)
3.7。红景天甙逆转LPS-Induced HMGB1乙酰化和核质易位在SirT1 shRNA-Transfected RAW264.7细胞
进一步验证红景天甙的角色和SirT1在HMGB1乙酰化和核质易位,质粒转染SirT1成分和消极控制到RAW264.7细胞。转染后48小时,细胞治疗与有限合伙人或红景天甙+ LPS 12 h。HMGB1的表达在核和胞质蛋白免疫印迹检测,HMGB1的位置是由共焦显微镜,HMGB1的乙酰化作用是检测到IP, SirT1的转染效率由灰度级扫描分析。如图8(一个)与控制相比,质粒,SirT1干扰效率分别为59.34,63.50和55.63%,分别。在SirT1 shRNA-transfected细胞,LPS诱导HMGB1的清晰的易位细胞质细胞核。然而,HMGB1的易位SirT1 shRNA-transfected细胞逆转后预处理红景天甙。通过检测SirT1表达式的总蛋白质,我们发现红景天甙获救SirT1的减少引起SirT1成分(图8(一个))。HMGB1的定位检测到共焦显微镜还表明,红景天甙可以反向LPS-induced HMGB1核质易位SirT1 shRNA-transfected RAW264.7细胞(图8 (b))。进一步验证了红景天甙对LPS-activated HMGB1乙酰化作用,RAW264.7细胞转染了SirT1的成分。转染后48小时,细胞使用红景天甙2 h,然后处理有限合伙人额外4 h。SirT1干扰效率分别为60.87%和58.62通过灰度级扫描和统计分析,分别。提出了图8 (c),HMGB1 LPS引起的乙酰化作用降低了预处理与红景天甙SirT1 shRNA-transfected细胞。这项研究的结果表明,红景天甙救援的乙酰化和核质易位HMGB1 LPS诱导的SirT1 shRNA-transfected细胞通过增强SirT1的表情。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
红景天的已广泛应用于中药没有毒性。红景天甙,具有生物活性的化合物分离红景天的具有多种药理作用,包括抗炎(27,抗肿瘤28),和神经保护29日]。我们之前的研究表明,红景天甙减毒LPS-induced炎症反应通过抑制JAK2-STAT3预防STAT3信号通路的激活和转移到细胞核(25),但红景天甙的抗炎效果的详细分子机制仍然是难以捉摸的。
HMGB1,无处不在的dna结合蛋白,已被确定为一个关键的中介在endotoxaemia末和脓毒症(10]。HMGB1释放的机制需要易位HMGB1离原子核的细胞质,然后释放到细胞外空间(13]。最近的研究表明,HMGB1的转译后的修改,如磷酸化和乙酰化作用,参与HMGB1的易位和随后的分泌30.,31日]。红景天甙是否影响HMGB1的转译后的修改和随后的核质易位尚不清楚。在这项研究中,我们首先研究红景天甙的关系和HMGB1释放体内和体外,然后探索底层机制。
体内,我们发现红景天甙的抑制性影响释放HMGB1及肺损伤通过创建的脓毒症大鼠模型。成功管理红景天甙抑制HMGB1的海拔CLP老鼠,和充血,水肿,炎症细胞浸润引起的CLP中缓解红景天甙组(图2)。这些结果表明,红景天甙可能作为释放HMGB1的抑制剂。HMGB1的核质易位是释放HMGB1活跃在炎症的关键一步。澄清红景天甙在HMGB1核质易位的影响,RAW264.7细胞用红景天甙预处理,然后用LPS刺激,导致HMGB1释放和易位的检测。结果呈现在图3表明,细胞培养上清液中HMGB1含量增强LPS刺激后,大约在12 h达到顶峰。在preretreatment红景天甙,LPS-induced HMGB1发布是剂量依赖性地抑制。HMGB1的水平以及其定位在细胞核和细胞质表明红景天甙抑制LPS-induced HMGB1核质易位(图4)。
几个转译后的修改影响离原子核HMGB1的易位细胞质;例如,LPS刺激诱发的磷酸化和乙酰化HMGB1及其后续生264.7中分泌细胞(32,33]。符合这些报告,我们的结果表明,有限合伙人显然与红景天甙诱导HMGB1磷酸化和乙酰化预处理降低LPS-induced乙酰化作用而不是磷酸化(图5)。Sirtuin蛋白1 (SirT1),一个NAD-dependent第三类组蛋白脱乙酰酶,在调节中扮演重要角色HMGB1乙酰化作用[12,33]。我们随后研究红景天甙对HMGB1乙酰化作用的影响是否与SirT1的表达,发现红景天甙增强SirT1表达式剂量和时间的方式(数字6(一)和6 (b))。此外,治疗后与有限合伙人,SirT1的表达与对照组相比是减毒RAW264.7细胞。结果符合那些从马等人的一份报告发现,有限合伙人减少SirT1的表达通过p38 MAPK信号(34]。然而,红景天甙预处理可以扭转SirT1的减少引起的有限合伙人(图6 (c))。AMPK-SirT1信号通路调节炎症信号在不同的细胞。探索可能的信号机制红景天甙的监管SirT表达式,发现AMPK的磷酸化。正如所料,红景天甙能提高AMPK磷酸化和救援减少AMPK磷酸化LPS引起的(数据6 (d),6 (e),6 (f))。
确认SirT1的角色LPS-induced HMGB1核质易位和乙酰化作用,RAW264.7细胞转染与Flag-SirT1超表达和控制质粒,然后,HMGB1的核质易位和乙酰化作用是检测到。正如所料,控制plasmid-transfected细胞,LPS刺激增加HMGB1核质易位和乙酰化作用,而核质易位和LPS引起的HMGB1显然是减毒的乙酰化Flag-SirT1 plasmid-transfected细胞(图7)。进一步验证红景天甙HMGB1乙酰化和核质易位的影响通过增加SirT1的表情,我们也转染SirT1 shRNA首先表达下调SirT1的表达式,然后把SirT1的差别与红景天甙扭转对这些细胞。我们的结果在图8表明,红景天甙可以挽救的乙酰化和核质易位HMGB1 LPS诱导的SirT1 shRNA-transfected细胞移植SirT1的水平。
最近的研究表明,JAK-STAT1信号促进HMGB1乙酰化和核质易位(13]。这项研究表明,JAK-STAT1信号参与HMGB1的释放引起的有限合伙人。此外,据报道,丙酮酸乙酯抑制HMGB1的乙酰化和释放通过SirT1 / STAT1信号在LPS-activated RAW264.7细胞和腹膜巨噬细胞33]。然而,之前的研究表明,红景天甙没有抑制LPS-activated STAT1磷酸化RAW264.7细胞(25]。黄等人报道,SirT1直接与HMGB1交互;然而,在与LPS刺激或TNF -α,HMGB1乙酰化复杂的解离,导致HMGB1的释放(35]。基于这些结果,我们推测,红景天甙可能通过上调减少释放HMGB1 AMPK-SirT1信号,抑制HMGB1乙酰化,然后衰减SirT1, HMGB1的离解。然而,红景天甙对SirT1的绑定,HMGB1的影响需要进一步调查。
总之,在目前的研究中,红景天甙是证明抑制HMGB1在LPS-induced RAW264.7细胞和降低血清CLP老鼠通过抑制HMGB1水平LPS-induced HMGB1乙酰化作用,至少部分通过调节AMPK-SirT1信号通路(图9)。我们的研究结果表明,红景天甙可能被视为一个潜在的治疗疾病中HMGB1视为目标。这项研究还提供了一个新的视角对红景天甙的抗炎作用。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
本研究得到了国家自然科学基金(批准号81601380),安徽省高校自然科学研究项目(批准号KJ2016SD59),省级优秀青年人才基础的学院和大学安徽省(批准号gxyqZD2016173),活性生物大分子安徽省重点实验室(批准号1306 c083008),皖南医学院重点科研项目(批准号WK2015Z01)。作者想感谢刘银花副教授协助实验。