文摘
积累先进的糖化终端产品(年龄)导致衰老和衰老相关疾病,特别是2型糖尿病。的NLRP3 inflammasome,先天免疫系统的重要组成部分,是与2型糖尿病的发病机制。然而,NLRP3的角色在AGE-induced inflammasome胰岛损伤基本上仍不清楚。结果表明,政府的时代(120毫克/公斤6周)C57BL / 6 j小鼠诱导异常响应葡萄糖(以葡萄糖耐量和胰岛素释放),胰腺β细胞超微结构的损伤和细胞死亡。这些影响与过度有关超氧化物阴离子水平,NADPH氧化酶2蛋白表达水平明显提高(NOX2) thioredoxin-interacting蛋白质(TXNIP) NLRP3,裂解il - 1β、增强caspase-1活动,显著增加TXNIP-NLRP3蛋白质相互作用的水平。消融的NLRP3 inflammasome或治疗与抗氧化剂N-acetyl-cysteine (NAC)明显改善这些影响。总之,我们的研究结果揭示的可能机制AGE-induced胰岛损伤在NLRP3 inflammasome激活。
1。介绍
先进的糖化终端产品(年龄)nonenzymatically生成,和年龄的形成极大地加速了长期高血糖患者的糖尿病(DM) [1,2]。年龄积累是导致衰老的主要因素之一,是一个重要的元素的年龄相关疾病的发病机理,特别是2型糖尿病及其并发症(3- - - - - -5]。最近的研究指出,年龄积累直接导致胰岛素生产β细胞功能障碍和细胞凋亡在活的有机体内(6- - - - - -9]。这些效应是由于,至少在某种程度上,增加细胞活性氧(ROS)的生产。尽管如此,AGE-mediated ROS的精确作用释放β细胞损伤仍不清楚。
炎症是导致一个关键机制β细胞功能障碍和死亡,其中炎性细胞因子发挥重要作用[10,11]。在不同的促炎细胞因子,interleukin-1β(il - 1β)在DM中起着重要作用。临床研究报道,抑制il - 1β通过il - 1受体拮抗剂或il - 1β2型DM患者的抗体会导致血糖和改善β细胞功能(12,13]。众所周知,il - 1β分泌主要是由半胱氨酸蛋白酶caspase-1,这主要是由inflammasomes激活,尤其是nucleotide-binding域包含受体富亮氨酸重复,pyrin domain-containing 3 (NLRP3) inflammasome [14]。
Thioredoxin-interacting蛋白质(TXNIP) arrestin蛋白质超家族的一员,调节糖尿病胰岛β细胞凋亡和功能障碍15- - - - - -17]。TXNIP内源性抑制剂和硫氧还蛋白的调节器,它维护细胞的抗氧化和抗凋亡的平衡系统(18]。最近的研究表明,TXNIP离解的硫氧还蛋白ROS-sensitive方式可以激活NLRP3 inflammasome和诱导il - 1β释放,即氧化应激链接TXNIP inflammasome激活(19- - - - - -21]。
越来越多的证据表明,代谢压力(葡萄糖、游离脂肪酸和人类淀粉样多肽)似乎激活il - 1系统通过NLRP3 inflammasome在胰岛19,22,23]。然而,目前尚不清楚是否NLRP3 inflammasome AGE-induced参与β细胞损伤,尽管后者过程由活性氧的生产公司。因此,在当前的研究中,我们测试的假设ROS / TXNIP途径有助于AGE-induced激活NLRP3 inflammasome,导致积极的释放il - 1β,导致胰岛β细胞损伤在活的有机体内。
2。材料和方法
2.1。动物和试剂
12个男性NLRP3敲除小鼠(NLRP3 KO)在我们的研究中用作我们前面描述的24]。与C57BL / 6 j小鼠获得来自杰克逊实验室和作为野生型对照组(WT)。所有的老鼠都保持在特定的无菌设施在新华医院实验动物中心。所有研究机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC)新华医院、上海交通大学医学院。
所有的试剂都是购自σ除非另有规定。鼠标anti-NLRP3单克隆抗体从Adipogen Inc .)获得多克隆兔anti-TXNIP和胰岛素抗体购自Abcam Inc .多克隆兔anti-glucagon, NADPH氧化酶2 (NOX2)凋亡speck-like蛋白(ASC)和il - 1β抗体购自圣克鲁斯Inc . Dihydroethidium(她)探针,caspase-1活动和末端转移酶的dUTP缺口末端标记(TUNEL)分析工具从Beyotime生物技术公司购买,il - 1β酶联免疫试剂盒从研发系统购买。小鼠胰岛素酶联免疫试剂盒购自Shibayagi公司。
2.2。制备的年龄
在这项研究中使用的年龄是前面描述的8,9),准备如Makita et al。(25]。总之,牛血清白蛋白(BSA, 50毫克/毫升)是在无菌条件下孵化磷酸甘油醛(0.1米)的缓冲区(pH值7.4,0.2米)为七天。非公司糖被透析去除。Nonglycated BSA、孵化没有甘油醛作为消极的控制。木糖醇的年龄存在测试准备使用鲎变形细胞溶解产物(LAL)试剂产生的内毒素水平不到15欧盟/ L。
2.3。实验室啮齿动物的研究
在第一部分实验中,小鼠分为以下组( 每组):与BSA WT老鼠,NLRP3 KO小鼠与BSA、WT小鼠年龄,NLRP3 KO小鼠年龄。BSA(用作控制)或年龄是日常管理的腹腔内的剂量120毫克/公斤体重的6周根据我们以前的报告(9]。
在本研究的第二部分,C57BL / 6 j小鼠组( 每天每组)给予腹腔注射6周的年龄或BSA如上所述。一个额外的子群的老鼠注射年龄( )接受治疗和抗氧化剂N-acetyl-cysteine饮用水(NAC 40毫米),在提供足够的浓度在活的有机体内抗氧化能力(26,27]。我们不包括一组C57BL / 6 j小鼠仅NAC治疗在这项研究因为NAC不影响NLRP3 inflammasome活动如果人类外周血单核细胞(28]。
2.4。腹腔内葡萄糖耐量试验(GTT)、胰岛素释放试验(红外热成像)和腹腔内胰岛素耐量试验(ITT)
Overnight-fasted小鼠腹腔注射10%葡萄糖溶液(1.5毫克/克体重)。腹腔内葡萄糖耐量试验(GTT),血糖水平测定在不同时间点一个。胰岛素释放试验(红外热成像),血液收集在不同的时间点葡萄糖负荷后,和胰岛素水平与酶联免疫试剂盒测定。
对腹腔内胰岛素耐量试验(ITT),小鼠禁食6小时然后腹腔内注射人类常规胰岛素(0.75 U /公斤)。测量血糖水平(0)15、30、45、60分钟一个。
2.5。生理指标测定
在本研究的最后,overnight-fasted小鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。血液样本收集、离心获得血清,并将其保持在−80°C到化验。空腹血糖水平是由葡萄糖氧化酶法。空腹胰岛素浓度与酶联免疫试剂盒测定。
2.6。Immunofluorescent染色
胰腺的一部分在4%多聚甲醛固定,石蜡嵌入式,切成5μ米的部分。TUNEL染色,胰腺部分与TUNEL孵化试剂1 h在黑暗中。核与DAPI染色法是通过孵化。此外,一个积极的控制制备permeabilized胰腺部分preincubated脱氧核糖核酸酶1诱导DNA链断裂。immunofluorescent染色,固定胰腺部分加热煮沸15分钟的10毫米柠檬酸缓冲(pH = 6.0)为抗原检索。然后,探讨了部分与anti-insulin(1: 200),胰高糖素(1:150),或il - 1β(1:100)抗体,其次是孵化与特定的二级抗体。负控制准备,胰腺部分被替换下场的抗体探测PBS缓冲,在同一浓度的多发地兔免疫球蛋白g部分被荧光显微镜拍摄和分析使用ImageJ软件如我们之前所述报告(9,29日]。
2.7。检测超氧化物阴离子在小鼠胰岛
在我们以前的报告(9),部分胰腺是嵌入在O.C.T.包埋介质。部分(10μm)孵化与她30分钟(10μ米)评估胰腺癌超氧化物阴离子原位水平。她被超氧化物阴离子氧化产生ethidium,由夹层困细胞DNA。Ethidium荧光是量化使用ImageJ软件(9]。
2.8。透射电子显微镜法
胰腺组织的尾巴胰腺是收获和固定在2.5%戊二醛。此后,四氧化锇固定样本处理1%,脱水和嵌入。经过本地化的小岛在光学显微镜下,组织被切成超薄部分。的部分是醋酸双氧铀及柠檬酸铅之前在透射电子显微镜检查。
2.9。Caspase-1活动分析
胰腺组织的caspase-1活动溶解产物使用colourimetric试验测定。这个分析是基于能力的caspase-1改变acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp对硝基苯胺(Ac-YVAD-pNA)到黄色甲瓒产物对硝基苯胺(机构)。每分钟生产机构在测试样本被用作衡量caspase-1活动水平和inflammasome激活。结果表示为褶皱增加caspase-1活动。
2.10。免疫印迹分析和免疫沉淀反应
相同蛋白质的胰腺组织溶解产物(40μg)分离通过钠十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)。分离蛋白质被electrophoretically PVDF膜,然后主要抗体孵育NLRP3 (1: 500), ASC (1: 800), il - 1β(1:200),TXNIP(1: 500)和微管蛋白在一夜之间(1:1000)和记者二级peroxidase-conjugated anti-rabbit或鼠标抗体。免疫沉淀反应(IP)如前所述。总蛋白(100毫克)与anti-TXNIP抗体免疫沉淀反应(5μg / mL)和孵化/ g琼脂糖珠过夜。沉淀蛋白质进行分析通过sds - page和涂抹主要抗体(anti-TXNIP和anti-NLRP3)。抗体与一个增强化学发光检测的蛋白质(ECL)工具包(微孔)。屁股被测密度术量化使用图像软件。乐队的强度是微管蛋白或TXNIP规范化。
2.11。统计分析
数据表示为平均值±标准偏差(美国)。组间的差异是由使用单向方差分析Newman-Keuls测试紧随其后。一个值小于0.05的被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。NLRP3敲除小鼠改善异常响应葡萄糖管理时代
NLRP3 KO小鼠用于理解的角色NLRP3 inflammasome在AGE-induced胰岛损伤。WT和NLRP3 KO小鼠腹腔注射年龄或BSA(控制)每天6周。我们第一次执行胰岛素和胰高血糖素的双重免疫荧光染色对胰岛素和胰高血糖素胰腺部分评估小鼠胰岛形态学。如图1(一)前六周的年龄中治疗引起胰岛形态学变化。总β细胞和α四组之间的细胞质量没有显著差异(数字1 (b)和1 (c))。
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(g)
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在空腹血糖水平没有明显差异(图1 (d))和胰岛素浓度(图1 (e)在四组)。全身胰岛素耐受性,腹腔内ITT公司评估的不同组间没有明显(图1 (f))。然后,腹腔内GTT进行评估代谢改变,即葡萄糖耐量和胰岛素分子释放。葡萄糖负荷后血糖水平显著提高WT小鼠治疗年龄与WT老鼠接受BSA(图1 (g)),这与低胰岛素水平AGE-treated WT老鼠相比BSA-treated WT老鼠(图1 (h))。这些影响并不欠治疗胰岛素抵抗的形成,因为年龄并不影响空腹血糖和胰岛素水平或全身胰岛素敏感性,这相比BSA-treated WT老鼠。因此,这些结果表明,政府直接受损的时代β细胞功能在活的有机体内。有趣的是,年龄相关性影响等更高层次的葡萄糖负荷后血糖和胰岛素分泌受损明显改善的消融NLRP3(数字1 (g)和1 (h))。
3.2。NLRP3淘汰赛减少胰岛β细胞凋亡在老鼠管理时代
先前的研究已经阐明,受损在活的有机体内会导致胰岛素分泌减少β细胞生存或函数或两者的结合30.]。如图2,凋亡细胞的数量被积极TUNEL染色高AGE-treated WT小鼠凋亡细胞的数量相比AGE-treated NLRP3 KO小鼠。这些数据表明,删除NLRP3基因保护胰岛β细胞从AGE-induced死亡在活的有机体内。
(一)
(b)
3.3。NLRP3淘汰赛恢复胰岛的超微结构的损伤β细胞在小鼠年龄
我们使用透射电子显微镜来更好地描述NLRP3删除的保护作用在单个细胞水平。如图3的电子显微图β肽胰岛内显示的线粒体肿胀AGE-treated WT老鼠与BSA-treated WT老鼠,尽管insulin-secretory颗粒组之间几乎没有改变。消融的NLRP3导致AGE-induced线粒体损伤的重要改进β在小岛的肽。
3.4。NLRP3 Inflammasome激活参与AGE-Induced小鼠胰岛损伤
直接地址的参与NLRP3 inflammasome AGE-induced胰岛损伤,我们研究了il - 1的本地处理βinflammasome激活的最终步骤。免疫荧光结果显示,虽然il - 1β表达相对较低,在正常小鼠WT符合以前的报告(31日),il - 1β染色仍然可以检测到小岛。然而,每日年龄注射诱导显著升高immunoexpression il - 1的水平β在WT老鼠,这变化是逆转NLRP3删除(数字4(一)和4 (b))。
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(g)
由于il - 1的疣状β反映了总il - 1β蛋白表达包括前体和成熟形式,我们进行免疫印迹分析il - 1β分区两种形式。Caspase-1化验也执行检测Caspase-1的酶活性。如数据所示4 (c),4 (d),4 (e),4 (f),4 (g)、年龄导致大幅提高NLRP3蛋白质的表达,激活caspase-1, il - 1的成熟β在WT老鼠,而ASC表达水平保持不变。删除NLRP3预防发生AGE-induced增强caspase-1活动和il - 1的激活增加的影响β(17 kDa亚基)(数据4 (c)和4 (d))。
3.5。NAC对AGE-Induced小鼠胰腺NLRP3 Inflammasome激活
我们下了ROS / TXNIP通路是否有助于AGE-induced NLRP3 inflammasome激活。为此,C57BL / 6 j小鼠与BSA的日常管理,年龄,或年龄+ NAC(著名的活性氧抑制剂)6周。我们的数据表明NAC治疗显著改善胰岛β细胞功能(数据5(一个)和5 (b))和抑制β细胞死亡(数据5 (c)和5 (d))。如数据所示6(一)和6 (b)、生产和NOX2超氧化物阴离子蛋白水平明显增强AGE-treated老鼠。这些影响与TXNIP的蛋白质表达水平明显增加,NLRP3,裂解il - 1β增强的caspase-1活动,一个明显的增加TXNIP-NLRP3蛋白质相互作用,作为评估coimmunoprecipitation(图6 (e))。此外,NAC治疗显著降低超氧化物阴离子的水平,抑制了AGE-induced TXNIP表达水平,NLRP3,裂解il - 1β减少caspase-1活动,扭转了表型增加蛋白质TXNIP和NLRP3(图之间的交互水平6)。
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(b)
(c)
(d)
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(我)
4所示。讨论
在各种年龄亚型,glyceraldehyde-derived年龄(有毒年龄的主要组件)已被证明在炎症的发展发挥重要作用和血管病患者DM (32- - - - - -34]。在初步实验中,甘油醛或单糖进行年龄是日常管理对C57BL / 6 j小鼠腹腔内的剂量120毫克/公斤体重的6周。接触glyceraldehyde-derived年龄引起明显在C57BL / 6 j小鼠葡萄糖耐量,并没有观察到小鼠接受单糖进行年龄(数据未显示)。因此,后续研究选择glyceraldehyde-derived年龄和称为年龄。
促炎细胞因子生产过剩是导致DM广为人知。一些证据显示,当地的il - 1β代在胰岛细胞的原因β细胞死亡和损害他们产生胰岛素的能力(35,36]。年龄有越来越支持这一概念,由于他们发挥病理作用诱导的促炎细胞因子,如il - 1β肿瘤坏死因子-α等等(37- - - - - -40]。年龄直接增加il - 1β人类腹膜巨噬细胞分泌没有脂多糖启动(40)和妊娠糖尿病妇女的脂肪组织(41]。的NLRP3 inflammasome哨兵,传感代谢压力和担忧的胰岛细胞的免疫防御。NLRP3激活导致招聘的适配器蛋白质ASC和效应caspase-1形成NLRP3 inflammasome复杂,最终负责乳沟和il - 1的分泌β(14]。在这里,我们表明,AGE-induced增加胰腺il - 1的成熟β是依赖于NLRP3 inflammasome激活。淘汰赛NLRP3改善异常反应的葡萄糖(葡萄糖耐量和胰岛素释放)在小鼠体内注射。此外,删除NLRP3 inflammasome保护胰腺β肽从超微结构的损伤和细胞死亡引起的长期管理时代。在一起,我们的研究结果表明,NLRP3 inflammasome激活是一个关键机制,参与AGE-induced胰腺损伤。高浓度的年龄可能触发NLRP3 inflammasome复杂而导致激活il - 1β。随后,分泌il - 1β在微环境加剧了慢性炎症反应在胰岛细胞42]。
据报道与我们的结果一致,年龄上调蛋白表达水平的模式识别受体年龄(愤怒),增加活性氧的产量,刺激的激活NLRP3 inflammasome,并引发小鼠肾损伤的发展(43]。愤怒拮抗剂治疗明显抑制年龄/ RAGE-induced ROS生产和变弱NLRP3激活,因此降低il - 1的水平β和衰减异常的小鼠的肾脏功能43]。此外,年龄治疗直接激活NLRP3 inflammasome和刺激成熟的il - 1β在人类胎盘分泌组织(44]。年龄也可能诱发炎症反应在髓核细胞NLRP3 inflammasome-dependent方式与愤怒/ NF -κB通路(45]。愤怒的其他内生non-AGE配体,包括S100A8 S100A9,一直显示激活NLRP3 inflammasome通过刺激ROS的产生(28]。然而,康等人最近表明,愤怒激活黑素瘤2(但不是NLRP3)在急性胰腺炎(inflammasome46]。可能参与愤怒/ NLRP3 inflammasome不能完全排除因为巨噬细胞用于实验刺激与组蛋白和DNA,但并不与年龄。事实上,inflammasome的组件,ASC, caspase-1,和NLRP3炎症在急性胰腺炎的发展所需47- - - - - -49]。NLRP3基因的敲除防止实验性急性胰腺炎(47)和慢性obesity-induced胰腺损伤(30.]。与上述结果相反,最近发表的摘要报告了与年龄变弱不同预处理NLRP3 stimuli-triggered caspase-1激活和il - 1β分泌骨骨髓来源的巨噬细胞(50]。年龄对免疫细胞的直接影响需要进一步的研究。
有趣的是,小colocalization观察il - 1之间β和β细胞标记胰岛素在本研究(图4(一)),这表明胰岛居民和/或浸润的巨噬细胞可能在小岛促炎细胞因子的主要来源在活的有机体内。NLRP3 inflammasome-mediated il - 1β生产从胰腺内浸润的巨噬细胞可以促进胰腺的死亡β细胞和随后的糖尿病(51]。进一步调查澄清的关键细胞参与AGE-stimulated il - 1β在胰岛细胞分泌是必要的。
值得注意的是,ROS / TXNIP途径有重要作用触发NLRP3 inflammasome激活和il - 1β分泌(19- - - - - -21]。这两个在活的有机体内动物研究和在体外细胞培养的研究澄清,NADPH oxidase-related过多的活性氧诱导硫氧还蛋白的分离和TXNIP,导致激活NLRP3 inflammasome [42,52,53]。在目前的研究中,我们发现,管理年龄显著增加超氧化物阴离子通过upregulation NOX2蛋白质水平,进而导致TXNIP表达水平的增加和NLRP3 inflammasome组件和增加蛋白质交互水平TXNIP和NLRP3之间。此外,NAC治疗减少了氧化应激的超氧化物阴离子减少,导致后续TXNIP-NLRP3蛋白质相互作用的抑制和il - 1的水平β分泌,减毒胰岛损伤。这些结果表明,NLRP3表达和inflammasome激活在回应时代刺激与ROS / TXNIP通路有关在活的有机体内。
5。结论
我们的研究表明,NLRP3 inflammasome激活是一个关键的信号机制AGE-induced胰岛损伤。这项研究还提供了直接的在活的有机体内证据表明NLRP3-deficient老鼠抑制胰岛炎症反应和损伤在时代的挑战。因此,我们的研究表明调节NLRP3 AGE-induced信号可能有助于控制糖尿病患者的胰岛损伤。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
香和陆Ai-Ling贡献同样这项工作。
确认
作者感谢沃伦斯博士(美国国立卫生研究院)提供NLRP3-deficient老鼠。这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81600645)、安徽省自然科学基金(1708085 mh186),关键项目的安徽大学优秀青年人才(gxyqZD2016182),皖南医学院的关键研究基金会(WK2016ZF02)和引进人才的科学研究基金会Yijishan医院(YR201508)湘,安徽省自然科学基金(1608085 qh191) Xinming姚明,和中国国家自然科学基金(81370935)和上海市教委创新项目(14 zz110)清苏。